(19)
(11)EP 0 000 028 A1

(12)EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG

(43)Veröffentlichungstag:
20.12.1978  Patentblatt  1978/01

(21)Anmeldenummer: 78100045.0

(22)Anmeldetag:  01.06.1978
(51)Internationale Patentklassifikation (IPC)2C12N 11/14, C12N 9/02, C12N 9/92
(84)Benannte Vertragsstaaten:
BE CH DE FR GB LU NL SE

(30)Priorität: 10.06.1977 DE 2726188

(71)Anmelder: Kali-Chemie Aktiengesellschaft
D-30173 Hannover (DE)

(72)Erfinder:
  • Weidenbach, Günter, Dipl.-Chem. Dr.rer.nat.
    D-3000 Hannover 73 (DE)
  • Bonse, Dirk, Dipl.-Chem. Dr.-Ing.
    D-3161 Arpke (DE)


(56)Entgegenhaltungen: : 
  
      


    (54)Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats


    (57) Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Her-stellung von wasserunlöslichen Enzympräparaten.
    Erfindungsgemäß werden anorganische Träger mit unterschiedlichem häufigsten Porendurchmesser zunächst nach an sich bekannten Verfahren mit zur Bindung des Enzyms an den Träger befähigten funktionellen Gruppen versehen und aus den so funktionalisierten Trägern nach an sich bekannten Verfahren Enzympräparate hergestellt, indem man den unterschiedlichen Trägern unterschiedliche Mengen an Enzym anbietet. Dabei zeigt sich, daß die absolute Aktivität der erhaltenen Präparate ungeachtet der an sie gebundenen Enzymmenge vom häufigsten Porendurchmesser des Trägers abhängig ist und für einen bestimmten häufigsten Porendurchmesser ein Maximum durchläuft.
    Anschließend werden aus dem hinsichtlich seines häufigsten Porendurchmessers ermittelten optimalen Träger Enzympräparate hergestellt, indem man diesem Träger unterschiedliche Mengen an Enzym anbietet. Dabei zeigt sich, daß bei einem bestimmten Enzymangebot die spezifische Aktivität des Präparats der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand nahekommt oder diese erreicht.
    Es läßt sich somit die für ein Präparat mit maximaler Aktivität benötigte Enzymmenge optimieren.
    Gegenstand der Erfindung sind außerdem nach dem Verfahren hergestellte Enzympräparate mit Amyloglucosidase- bzw. Glucoseisomerase-Aktivität.


    Beschreibung


    [0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzympräparate und danach hergestellte Enzympräparate.
    Es ist bekannt, Enzyme durch Bindung an organische oder anorganische Träger zu immobilisieren, d.h. wasserunlöslich zu machen, so dass diese wiederverwendbar sind und in kontinuierlich arbeitenden Verfahren eingesetzt werden können.

    [0002] Organische Materialien (z.B. Zellulose, Nylon, Polyacrylamid) weisen als Träger erhebliche Nachteile auf, da sie keine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, vom Lösungsmittel angegriffen werden können, gegenüber wechselnden pH-Werten und Ionenstärken empfindlich sind und teilweise zum Mikrobenbefall neigen, wodurch die Bindung zum Enzym gelöst werden kann.

    [0003] Deshalb wurden anorganische Substanzen als Träger vorgeschlagen, auf denen Enzyme adsorptiv oder kovalent gebunden werden. Die bevorzugte Art der Bindung hängt von der Art und den Einsatzbedingungen des Enzyms und der Beschaffenheit des Substrates ab. Liegt das Substrat beispielsweise in einer starken Salzkonzentration vor, ist die Adsorptionsmethode nicht anwendbar, da eine Desorption der adsorbierten Enzymmoleküle möglich ist. Deshalb wird die kovalente Bindung des Enzyms an den Träger vorgezogen. Die Trägeroberfläche muss dann spezifische funktionelle Gruppen enthalten, die eine Bindung des Enzyms gewährleisten. Da der Träger diese funktionellen Gruppen in den meisten Fällen nicht besitzt, ist eine Vorbehandlung der Oberfläche erforderlich. Bekannt ist beispielsweise die Belegung von anorganischem Material mit Silanen, wodurch die Oberfläche organisch funktionelle Gruppen (z.B. Alkylamin) erhält, die mit organischer Substanz eine kovalente Bindung eingehen. Weiterhin ist die Behandlung anorganischer Träger mit Sulfurylchlorid, Thionylchlorid oder Cyanurchlorid erprobt worden. Ausserdem ist es möglich, die Trägeroberfläche mit einem wasserunlöslichen Polymer zu überziehen, das freie funktionelle Gruppen aufweist, wie z.B. Polyacrolein, das zwischen 10 und 70 % freie Aldehydgruppen, bezogen auf die Anzahl der monomeren Moleküle, besitzt.

    [0004] Als Material für anorganischeTräger wurden Aluminiumoxide, Nickeloxid, Eisenoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Hydroxylapatit, Silikate und poröses Glas vorgeschlagen, deren Porenstruktur die Zugänglichkeit des Enzyms und des Substrates zur inneren Oberfläche gewährleistet, über deren weitere wünschenswerte Eigenschaften, wie z.B. optimale Porenverteilung und Oberflächengrösse jedoch sehr unterschiedliche Angaben vorliegen.

    [0005] Mit keinem der genannten Träger gelang es, unabhängig von der angewandten Bindungsart, Enzyme so zu immobilisieren, dass ihre spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität im freien Zustand nahekommt. Nach Angaben von D.L.Latigue (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, S. 127) liegen auch unter besten Immobilisierungsbedingungen nur maximal 80 % des auf dem Träger aufgebrachten Enzyms in aktiver Form vor.

    [0006] Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzympräparate, bei denen man einen anorganischen Träger mit funktionellen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, so zu verbessern, dass bei minimalem Enzymaufwand ein maximal aktives Präparat erhalten wird.

    [0007] Die Lösung dieser Aufgabe gelingt gemäss der Erfindung dadurch, dass man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt, und dass man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, die nur so viel Enzym enthält, dass die spezifische Aktivität des damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt.

    [0008] Bei der Lehre nach der Erfindung werden zunächst Träger mit unterschiedlichen häufigsten Porendurchmessern nach bekannten Methoden mit Kupplungsmitteln versehen, die sowohl ausreichend fest am Träger haften, insbesondere eine kovalente Bindung zum Träger eingehen, als auch zu einer kovalenten Bindung mit dem Enzym befähigt sind. Als gebräuchlichste Methode hat sich in der Vergangenheit für anorganische Träger die Silanisierung durchgesetzt, es sind aber, wie schon ausgeführt, auch andere Kupplungsmittel einsetzbar. Die Anzahl der Kupplungsglieder am Träger muss hinreichend gross sein und hängt weitgehend von der Oberfläche des Trägers ab.

    [0009] Den so vorbehandelten Trägern werden dann unterschiedliche Enzymmengen angeboten, indem man sie mit Enzymlösungen unterschiedlicher Konzentration in Berührung bringt und nach bekannten Methoden eine kovalente Bindung des Enzyms zum Kupplungsglied und damit zum Träger herstellt. Nach. Bestimmung der Aktivität der so erhaltenen Präparate zeigt sich, dass die Aktivität der Präparate ungeachtet der an sie gebundenen Enzymmenge von dem häufigsten Porendurchmesser abhängt und ein Maximum durchläuft. Es hat sich dabei ausserdem gezeigt, dass die Korngrösse des Trägers für die Lage des Maximums unerheblich ist und allenfalls dessen Absolutwert beeinflusst. Die Korngrösse des Trägers hat daher für die Lehre nach der Erfindung nur eine untergeordnete Bedeutung und richtet sich weitgehend nach dem vorgesehenen Einsatzzweck, beispielsweise der Viskosität des Substrats, der Verfahrensführung und dgl.

    [0010] Dem auf diese Weise hinsichtlich des häufigsten Porendurchmessers ermittelten optimalen Träger werden dann wiederum unterschiedliche Mengen Enzym angeboten. Dabei zeigt sich, dass bei bestimmten Enzymkonzentrationen Präparate erhalten werden, deren spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand nahekommt oder diese erreicht, d.h. die relative Aktivität des Präparats erreicht einen Wert von 100 %.

    [0011] Bei Trägern, die aus einem Si02-Gel hergestellt sind, lässt sich gemäss Weiterbildung der Erfindung der optimale Träger erhalten, wenn man das Gel nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na20 und bezogen auf Trockensubstanz, von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, und Trocknung, 5 bis 10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 4000C bis 850°C, vorzugsweise 5700C bis 750°C, glüht.

    [0012] Zweckmässigerweise erfolgt die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180°C bis 200°C. Für das Glühen hat sich ein wasserdampfhaltiger Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80 % als vorteilhaft erwiesen.

    [0013] Der so hergestellte Träger weist einen häufigsten Porendurchmesser von 175 bis 3.000 Å, vorzugsweise 250 bis 600 Å, optimalerweise etwa 340 Å, auf.

    [0014] Das erfindungsgemässe Immobilisierungsverfahren ist für alle technisch und analytisch wichtigen Enzyme anwendbar, beispielsweise für Hydrolasen (z.B. Amylasen, Glycosidasen, Proteasen), Oxydoreductasen (Glucoseoxidase, Katalase), Isomerasen (Glucoseisomerase), Transferasen (Dextransucrase).

    [0015] Für den Fall, dass das Enzym Amyloglucosidase ist, welche im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 10 bis 15 Einheiten/mg aufweist, wird das optimale Präparat dann erhalten, wenn man den optimalen Träger mit einer Lösung in Berührung bringt, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält.

    [0016] Wird als Enzym Glucoseisomerase eingesetzt, die im freien Zustand eine spezifischeAktivität von 50-70 Einheiten/mg aufweist, erhält man das optimale Präparat, wenn der optimale Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20-50 mg, vorzugsweise 25 mg Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.

    [0017] Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

    Beispiel 1



    [0018] Zur Herstellung des Trägers 1 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes Si02-Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-% bei 1800C in wasserdampfgesättigter Luft drei Stunden getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 7300C in einem Luftstrom von 2 1/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80 % aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das SiO2 einen häufigsten Porendurchmesser von 1400 Å. Der Träger 1 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.

    [0019] 150 g dieser Trägerfraktion wurde 8 Stunden mit 4 1 einer 10 %igen Lösung von δ-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol am Rückfluss gekocht und nach Abkühlung mit je 1000 ml Benzol und mit je 1000 ml Aceton dreimal gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur im Vakuum wurde der Träger zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) und dreimal mit bidest. Wasser gewaschen. Die Trocknung erfolgte über P205 im Vakuum. Berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung enthielt der Träger 1 0,13 m Äq Silan/g.

    [0020] 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phofphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die Aktivität der Amyloglucosidase betrug 11,75 U/mg, wobei als Aktivitätsmass U die Bildung von 1/u Mol Glucose/min bei 25°C benutzt wurde. Die Suspension wurde 20 Minuten unter Vakuum gehalten, wieder belüftet und nach zwei Stunden nochmals für 20 Minuten evakuiert. Nach vier Stunden erfolgte die Trennung von Träger und Lösung durch Filtration, anschliessend dreimalige Waschung mit bidest. Wasser und schliesslich eine dreimalige Waschung mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 5). Die fertige Probe 1.1 wurde in Phosphatpuffer (pH 5) bei 4°C aufbewahrt. Die C-N-Analyse ergab einen Proteingehalt von 16,5 mg/g.

    [0021] Zur Herstellung der Probe 1.2 wurden 10 g des silanisierten Trägers 1 in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation der Probe 1.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 1.2 ergab einen Proteingehalt von 9,0 mg/g.

    Beispiel 2



    [0022] Zur Herstellung des Trägers 2 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes Si02-Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 680°C in einem Luftstrom von 2 1/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80 % aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das SiO2 einen häufigsten Porendurchmesser von 340 Å. Der Träger 2 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.

    [0023] 150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 4 1 einer 10 %igen Lösung von δ-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt.

    [0024] Der Träger 2 enthielt, berechnet auf Basis des Mittelwertes der C-und N-Bestimmung, 0,19 m Äq Silan/g.

    [0025] 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert. Die fertige Probe 2.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 30,8 mg/g auf.

    [0026] Weitere 10 g des silanisierten Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
    Die C-N-Analyse der fertigen Probe 2.2 ergab einen Proteingehalt von 17,4 mg/g.

    Beispiel 3



    [0027] Zur Herstellung des Trägers 3 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes Si02-Gel mit einem Na20-Gehalt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 640°C in einem Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 60 % aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das Si02 einen häufigsten Porendurchmesser von 180 Å. Der Träger 3 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,50 mm.

    [0028] 150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 4 1 einer 10 %igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt.

    [0029] Der Träger 3 enthielt, berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung 0,51 m Äq Silan/g.

    [0030] 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert.

    [0031] Die fertige Probe 3.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 26,2 mg/g auf. ,

    [0032] Weitere 10 g des silanisierten Trägers 3 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 3.2 ergab einen Proteingehalt von 12,7 mg/g.

    Beispiel 4



    [0033] Um den Nachweis zu führen, dass das Kupplungsmittel auf die Aktivität des Präparates keinen Einfluss hat, wurde von dem Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 Å) die Fraktion 0,25-0,5 mm ausgesiebt und davon 50 g in 500 ml 12,5 %iger wäßriger Glutardialdehydlösung 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend erfolgte ein Zusatz von 500 ml gesättigter NH4C1-Lösung. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Probe mit Wasser bis zur Chloridfreiheit gewaschen und über P205 im Vakuum getrocknet. 10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase (Merck 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert.

    [0034] Die fertige Probe 4.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 29,8 mg/g auf.

    [0035] Weitere 10 g des Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase (Merek 1330) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
    Die C-N-Analyse der fertigen Probe 4.2 ergab einen Proteingehalt von 17,9 mg.

    Beispiel 5



    [0036] 10 g des Trägers 1 (häufigster Porendurchmesser 1400 Å) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase (Y.Takasaki, Agr.Biol.Chem.33, Nr. 11, 1527-1534 (1969))enthielt, suspendiert.

    [0037] Die Reaktionszeit betrug bei Raumtemperatur 30 Minuten. Nach jeweils 10 Minuten wurde das Reaktionsgefäss evakuiert und nach Beendigung der Reaktion die Restlösung abgesaugt. Dann erfolgten 3 Waschungen mit Wasser und 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7).

    [0038] Die fertige Probe 5.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 4,8 mg/g auf.

    [0039] Zur Herstellung der Probe 5.2 wurden weitere 10 g des Trägers 1 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.

    [0040] Die C-N-Analyse der fertigen Probe 5.2 ergab einen Proteingehalt von 2,0 mg/g.

    Beispiel 6



    [0041] 10 g des Trägers2(häufigster Porendurchmesser 340 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.

    [0042] Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 6.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 22,0 mg/g auf.

    [0043] Zur Herstellung der Probe 6.2 wurden weitere 10 g des Trägers 2 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 6.2 ergab einen Proteingehalt von 10,2 mg/g.

    Beispiel 7



    [0044] 10 g des Trägers 3 (häufigster Porendurchmesser 180 i) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.

    [0045] Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 7.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 11,2 mg/g auf.

    [0046] Zur Herstellung der Probe 7.2 wurden weitere 10 g des Trägers 3 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.

    [0047] Die C-N-Analyse der fertigen Probe 7.2 ergab einen Proteingehalt von 5,1 mg/g.

    Beispiel 8



    [0048] 10 g des im Beispiel 4 genannten Trägers (häufigster Porendurchmesser 340 Ä , behandelt mit wäßriger Glutardialdehydlösung) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 8.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 21,3 mg/g auf.

    [0049] Zur Herstellung der Probe 8.2 wurden weitere 10 g des gleichen Trägers in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 8.2 ergab einen Proteingehalt von 9,8 mg/g.

    Beispiel 9



    [0050] Die Aktivität der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Präparate 1.1, 1.2; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1, 4.2 sowie die des zur Fixierung eingesetzten Enzyms (Amyloglucosidase, Merck 1330) wurde nach der Dinitrosalizylsäuremethode (vergl. Rick, W., Stegbauer, H.P. in: Bergmeyer, H.U. "Meth. d. Enzymatischen Analyse", Verlag Chemie 1970 S. 848 ff) bestimmt. Eine Aktivitätseinheit (U) entspricht der Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1µ Äquivalent reduzierende Gruppen (berechnet als Glucose) pro Minute freisetzt.

    Inkubationsbedingungen



    [0051] 2 %ige Substratlösung (Zulkowsky-Stärke Merck 1257) in 0,1 m Acetatpuffer pH 5,0, 30 Minuten, 25°C. Trägerfixierte Präparate wurden unter o.a. Bedingungen in einem 40 ml Reaktor bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 min 1 (Produktbildungsrate unabhängig von Rührgeschwindig- . keit) suspendiert.

    [0052] Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt. Der häufigste Porendurchmesser der Träger wurde aus der Porenverteilung (gemessen mit Hochdruckporosimeter) bestimmt.

    [0053] In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Proben 1-4 zusammengestellt. Die verwendeten Kenngrössen werden wie folgt definiert:




    Beispiel 10



    [0054] Die Aktivität der in den Beispielen 5-8 beschriebenen Präparate 5.1, 5.2; 6.1, 6.2; 7.1, 7.2; 8.1, 8.2 sowie die der zur Fixierung eingesetzten Glucoseisomerase wurde nach der Takasaki-Methode (vgl. Y.Takasaki: Agr.Biol.Chem. Vol.30, Nr.12, 1247-1253, 1966 und Z.Dische u.E.Borenfreund: J.Biol. Chem.192, 583, 1951) bestimmt. Eine Aktivitätseinheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 mg Fructose bildet.

    Inkubationsbedingungen



    [0055] 

    Die trägerfixierten Präparate wurden wie im Beispiel 9 beschrieben unter Standardbedingungen im Rührreaktor suspendiert.

    [0056] Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt.

    [0057] In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Proben 5-8 zusammengestellt.

    [0058] Die Definition der verwendeten Kenngrössen ist im Beispiel 9 angegeben.


    Die Ergebnisse zeigen:



    [0059] 

    1. Die Aktivität U der untersuchten Proben verläuft über ein Maximum, das vom häufigsten Porendurchmesser des Trägers abhängig ist.

    2. Die spezifische Aktivität Us hängt von der Enzymaufnahme ab und erreicht bei einer bestimmten Enzymkonzentration cE den Wert der Aktivität des Enzyms im freien Zustand USF, so dass Urel = 100 wird. Wird diese Enzymmenge überschritten, sinkt die spezifische Aktivität ab, wobei das Produkt aus Us und cE konstant bleibt.

    3. Die vom Träger aufgenommene Enzymmenge ist eine Funktion des häufigsten Porendurchmessers. Das System Enzym/Träger weist maximale Aktivität bei kleinstmöglichem Enzymeinsatz auf, wenn der optimale Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 Ä) 17,4 mg Amyloglucosidase/g bzw. 10,2 mg Glucoseisomerase/g aufgenommen hat (Proben 2.2 bzw. 6.2).

    4. Enzymaufnahme und Aktivität der untersuchten Proben sind vom Kupplungsmittel unabhängig.



    [0060] Da die Enzymkosten beträchtlich sind und mit dem geforderten Reinheitsgrad sehr stark ansteigen, für den wirtschaftlichen Einsatz also eine erhebliche Rolle spielen, ist mit dem erfindungsgemässen Verfahren erstmals die Möglichkeit geschaffen worden, auch teure Enzyme technisch anzuwenden, da es das Verfahren gestattet, bei Einsatz des erfindungsgemässen Trägers, die für maximale Aktivität benötigte Enzymmenge zu optimieren.


    Ansprüche

    1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparates, bei dem man einen anorganischen Träger mit funktionellen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Lösung eines Enzyms in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt, und dass man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, die nur so viel Enzym enthält, dass die spezifische Aktivität des damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt.
     
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger aus einem Si02-Gel auswählt, das nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na20, auf 0,1 bis 0,5 Gew.-% und Trocknung 5-10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 400°C bis 850oC, vorzugsweise 570°C bis 750oC, geglüht ist.
     
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180°C bis 200°C erfolgt.
     
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch-gekennzeichnet, dass das Glühen in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80 % erfolgt.
     
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym Amyloglucosidase verwendet wird.
     
    6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung einer Amyloglucosidase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 10 bis 15 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält.
     
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym Glucoseisomerase verwendet wird.
     
    8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung einer Glucoseisomerase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 50 bis 70 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20 bis 50 mg, vorzugsweise 25 mg, Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.
     
    9. Enzympräparat, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
     
    10. Enzympräparat mit Amyloglucosidase-Aktivität, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
     
    11. Enzympräparat mit Glucoseisomerase-Aktivität, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 7, 8.
     





    Recherchenbericht