(19)
(11)EP 0 171 447 A1

(12)EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG

(43)Veröffentlichungstag:
19.02.1986  Patentblatt  1986/08

(21)Anmeldenummer: 84109673.8

(22)Anmeldetag:  14.08.1984
(51)Int. Kl.4C12P 7/58
(84)Benannte Vertragsstaaten:
AT DE FR GB IT NL

(71)Anmelder: Akademie der Wissenschaften der DDR
D-10117 Berlin (DE)

(72)Erfinder:
  • Babel, Wolfgang, Dr.
    DDR-7024 Leipzig (DD)
  • Miethe, Dietmar, Dr.
    DDR-7114 Zwenkau (DD)
  • Iske, Uwe, Dr.
    DDR-7030 Leipzig (DD)
  • Sattler, Karl, Dr.
    DDR-7010 Leipzig (DD)
  • Richter, Hans-Peter, Dr.
    DDR-7271 Pohritzsch (DD)
  • Schmidt, Jörg, Dipl.-Ing.
    DDR-4413 Sandersdorf (DD)
  • Düresch, Rolf, Dr.
    DDR-4410 Wolfen (DD)

(74)Vertreter: Beetz & Partner Patentanwälte 
Steinsdorfstrasse 10
80538 München
80538 München (DE)


(56)Entgegenhaltungen: : 
  
      


    (54)Verfahren zur bakteriellen Herstellung von Gluconsäure


    (57) Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure durch bakterielle Oxidation von Glucose, bei dem Bakterien der Art Acetobacter methanolicus verwendet werden, insbesondere der beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, DDR, unter der Hinterlegungsbezeichnung IMET B 346 hinterlegte Stamm von Acetobacter methanolicus. Das Verfahren kann im pH-Bereich zwischen 1 und 6 und bei Temperaturen zwischen 10 und 35°C bei Zellkonzentration ≥ 0,5 g.1-1 durchgeführt werden, wobei die Glucoseoxidation in Gegenwart anderer Zucker wie Fructose selektiv ist.


    Beschreibung


    [0001] Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung wäßriger Gluconsäurelösungen durch Oxidation von Glucose mit Hilfe von Bakterien.

    [0002] Die technische Herstellung von Gluconsäure, die gegenwärtig hauptsächlich in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie angewendet wird, erfolgt fast ausschließlich auf mikrobiellem Wege, wobei meist Stämme von Aspergillus niger benutzt werden. Obwohl die Fähigkeit zur Oxidation von Glucose unter Bildung von Gluconsäure (und H202) auch bei Penicillien und Pullularien bekannt ist, und verschiedene Acetobacter-, Gluconobacter- und Pseudomonas-Species ebenfalls Glucose in Gluconsäure umwandeln können, werden in technischen Verfahren bisher keine Bakterien eingesetzt.

    [0003] Die bekannten mikrobiellen Verfahren haben den Nachteil, daß die Produktionskultur unter sterilen Bedingungen - und nur zum Zwecke der Glucoseoxidation - gewonnen werden und daß sowohl in der Wachstumsphase als auch in der ersten Produktbildungsphase ("Gärphase") - bis die Enzymsynthese abgeschlossen ist - Sterilität gewahrt und der pH-Wert durch Titration mit Alkali- oder Erdalkalihydroxid zwischen 6 und 7 konstantgehalten werden muß. Diese Notwendigkeit der Neutralisation bedingt einen weiteren Nachteil insofern, als durch die damit eintretende Viskositätserhöhung erhebliche Schwierigkeiten für den weiteren technischen Prozeß (erhöhter Energieaufwand, Aufarbeitung usw) entstehen (DE-AS 18 17 907).

    [0004] Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Gluconsäure unter unsterilen Bedingungen, ohne Neutralisation des Mediums während der Erzeugung des Produzenten und der Produktbildung und ohne Induktionsphase für die Bildung des Glucose oxidierenden Enzyms herzustellen.

    [0005] Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

    [0006] Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure beruht auf der Oxidation von Glucose mit Hilfe von Bakterien der Art Acetobacter und ist gekennzeichnet durch Verwendung von Bakterien der neuen Art Acetobacter methanolicus, wobei die Glucose im pH-Bereich zwischen 1 und 6 und bei Temperaturen zwischen 10 und 35 °C diskontinuierlich oder kontinuierlich bei Verweilzeiten zwischen 5 und 60 h zu freier Gluconsäure oxidiert wird. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung des in der Stammsammlung des Zentralinsituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena (DDR) unter der Bezeichnung IMET B 346 hinterlegten Stamms von Acetobacter methanolicus.

    [0007] Erfindungsgemäß ist ferner von Vorteil, daß die Produktbildung auch mit geringen Zellkonzentrationen bis hinunter zu 0,5 g·1-1 durchgeführt werden kann.

    [0008] Die verwendete Bakterienart der Gattung Acetobacter unterscheidet sich von den bisher beschriebenen in folgenden Merkmalen:

    Sehr gutes Wachstum auf Glucose,

    sehr gutes Wachstum auf Gluconaten,

    sehr gutes Wachstum auf 2.3-Butandiol,

    gutes Wachstum auf Methanol,

    Wachstum auf Capronsäure und

    fehlendes Wachstum auf Lactat.

    Morphologie des Typenstamms:



    [0009] Große, dicke Stäbchen, mehr oder weniger abgerundet, zuweilen zwei oder mehrere kettenförmig zusammenhängend, beweglich, begeißelt (1 - 3 Geißeln), Gram-negativ; Größe: 0,9 - 1,2 um x 3,6 pm, daneben kürzere Stäbchen mit 0,9 x 1,8 um und kokkoide Form (0,9 x 0,9 µm).

    Koloniemorphologie:



    [0010] Runde, leicht erhabene, glattrandige, weiß-gelbliche Kolonien von feucht-schmieriger Konsistenz, Größe nach 48 h 0,5 - 1 mm.

    [0011] Durch die Synthese eines Glucose oxidierenden Enzyms sind Bakterien der Art Acetobacter methanolicus in der Lage, Glucose als Substrat zu freier Gluconsäure zu oxidieren.

    [0012] Als Substrate für die Gluconsäuregewinnung können neben reiner Glucose auch glucosehaltige Gemische, insbesondere Glucose/Fructose-Gemische und/oder alle bei der Hydrolyse pflanzlicher Produkte wie Stärke oder Cellulose anfallenden glucosehaltigen End- und Zwischenprodukte, eingesetzt werden. Während der Produktbildung sollte die aktuelle Glucosekonzentration nicht höher als 25 § sein.

    [0013] Die Gluconsäurebildung kann nach Zuführung der Bakterienbiomasse in einer wäßrigen Substratlösung vorgenommen werden, was die Vorteile einer hohen Reinheit des Produkts und eines geringen Aufwands bei der Aufarbeitung mit sich bringt. Andererseits kann die Produktsynthese auch nach Auszehren des Wachstumsmediums und Zusatz von Substrat im Fermentationsmedium durchgeführt werden. Die Rückhaltung der für den Oxidationsprozeß notwendigen Bakterienbiomasse bzw Enzymkonzentration kann auch durch Trägerfixierung bzw Immobilisierung nach bekannten Verfahren erfolgen.

    [0014] Eine periodische Erneuerung von Biomasse kann vermieden werden, wenn die zur Produktbildung erforderliche Biomasse analog einem zweistufigen Verfahren dem Prozeß kontinuierlich zugeführt wird. In diesem Falle wird jedoch zur Gewinnung einer zellfreien wäßrigen Gluconsäurelösung eine nachgeschaltete Aufarbeitung erforderlich.

    [0015] Die Biomassekonzentration kann ferner in der Produktionsphase zur Erzielung hoher spezifischer Produktbildungsraten (bis 6 g . h g ) und Ausbeuten (bis 97 %) unter 5 g · 1-1 gehalten werden. Diese ermöglicht - im Falle der Gewinnung von Gluconsäure für technische Zwecke, zB zur Verwendung in der Waschmittelindustrie - eine außerordentlich einfache Aufarbeitung, wobei eine vorherige Abtrennung der Biomasse nicht erforderlich ist. Die wäßrige Gluconsäurelösung (bis 310 g · 1-1) kann durch bekannte Verfahren unmittelbar anschließend aufkonzentriert werden.

    [0016] Die Vorteile der Verwendung der neuen Bakterienart bestehen darin, daß sie als Produzent für Gluconsäure unsteril, weil im sauren pH-Bereich wachsend, erzeugt werden kann, sowie darin, daß die Produktbildung sofort, dh ohne Verzögerung und nicht mit der zB bei Aspergillus niger notwendigen Induktionsphase für das Glucose oxidierende Enzym bei dem für das Wachstum optimalen pH-Wert, aber auch oberhalb pH 4 bis pH 6, nach Zugabe von Glucose einsetzt, was im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren höhere Raum/Zeit-Ausbeuten ermöglicht (bis zu 15 g - h 1-1). Daß der pH-Bereich der Glucoseoxidation den pH-Bereich für das Wachstum dieser acidophilen Bakterien bei weitem überschreitet, bedingt weitere Vorteile: Die Produktbildung kann unsteril durchgeführt werden, ferner ist eine Neutralisation nicht erforderlich. Somit kann die bei den bekannten mikrobiologischen Verfahren, die Gluconsäure im wesentlichen als Gluconat produzieren, nachteilige Viskositätserhöhung vermieden werden.

    [0017] Bei der Verwendung von Glucose/Fructose-Gemischen bzw von bei der Hydrolyse von pflanzlichen Produkten wie Stärke oder Cellulose anfallenden glucosehaltigen End-, Neben- und Zwischenprodukten als Substrat ist nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine gleichzeitige Gewinnung von Fructose und Gluconsäure durch selektive mikrobielle Oxidation des Glucoseanteils zu Gluconsäure möglich. Nach Abtrennung der gebildeten Gluconsäure kann die Fructose nach bekannten Verfahren gewonnen oder ohne vorherige Abtrennung des Produzenten für nachfolgende Produktsynthesen, beispielsweise zur Gewinnung von Citronensäure, Verwendung finden. Ein mikrobieller Abbau der Fructose ist hierbei auch nach quantitativem Umsatz der Glucose zu Gluconsäure nicht zu beobachten.

    [0018] Anhand von Ausführungsbeispielen wird die Erfindung im folgenden näher erläutert:

    Beispiel 1



    [0019] Zu 4 1 einer Suspension des beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, DDR, unter der Hinterlegungsbezeichnung IMET B 346 hinterlegten Bakterienstamms in Wasser (Bakterientrockenmasse 50 g/1, pH-Wert 4,2) wurden in einem Rührkesselreaktor von 15 1 Gesamtvolumen zu Beginn 800 g Glucosemonohydrat (Ausgangskonzentration an Glucose 15,4 %) und nach 21 und 35 h weitere 500 g Glucosemonohydrat zugegeben.

    [0020] Folgende Verfahrensparameter wurden eingehalten:



    [0021] Eine Regelung des pH-Werts erfolgte nicht.

    [0022] Nach 11 h wurde aufgrund spektrophotometrischer Messung eine Gluconsäurekonzentration von 161 g/1 ermittelt.

    [0023] Zu diesem Zeitpunkt betrugen die spezifische Produktbildungsrate 2,9 g . g-1. h-1, die Produktivität 14,6 g . 1-1 . h und die Ausbeute 92 %. Nach 52 h wurde eine Gluconsäurekonzentration von 310 g/1 bestimmt. Die Restglucose im Fermentationsmedium betrug < 0,1 %. Dies entspricht einer mittleren Produktivität von 6,0 g . 1-1 h-1, einer mittleren spezifischen Produktbildungsrate von 1,15 g · g-1 · h und einer Ausbeute von 89,9 %. Der zur Oxidation der Glucose benötigte Sauerstoffbedarf betrug in den ersten 20 h 0,12 g Sauerstoff/g Gluconsäure und stieg in den folgenden 30 h auf 0,16 g Sauerstoff/g Gluconsäure an.

    Beispiel 2



    [0024] Zu 12 1 einer Suspension der in Beispiel 1 genannten Mikroorganismen in Wasser (1 g/1 Bakterientrockenmasse, pH-Wert 4,5) wurden in einen Rührkesselreaktor von 30 1 Gesamtvolumen 2,4 kg Glucosemonohydrat, nach 21 h 1,2 kg und nach 31 h 0,6 kg Glucosemonohydrat zugegeben. Der Versuch wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt.

    [0025] Folgende Werte wurden ermittelt:

    Nach 21 h:



    nach 44,5 h:

    Beispiel 3



    [0026] In einen 30 1 Membranrührkesselreaktor wurden 12 1 wäßrige Glucoselösung (100 g/l) gegeben und mit 7 g/1 der in Beispiel 1 genannten Biomasse angeimpft.

    [0027] Analog Beispiel 2 wurden nach 21 h und 31 h 1,2 bzw 0,6 kg Glucose dem Fermentationsmedium zugesetzt. Die Rührerdrehzahl und die Belüftungsrate während der Produktbildung betrugen 100 min-1 bzw 1,4 1/min. Nach einer Fermentationszeit von 45 h wurde eine Gluconsäurekonzentration von 215 g/1 erreicht. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte die kontinuierliche Zudosierung einer 25,0-% igen wäßrigen Glucoselösung mit einer Verweilzeit von 20 h. Nach ca. 1,5 Verweilzeitperioden stellte sich ein quasistationärer Gleichgewichtszustand bei einer mittleren Gluconsäurekonzentration von 227 g/1, entsprechend einer Produktivität von 11,3 g Säure/1 . h, ein. Das gluconsäurehaltige wäßrige Fermentationsmedium wurde zellfrei über ein geeignetes Membranfilter kontinuierlich aus dem Reaktor abgezogen. Zu diesem Zweck wurde mit Beginn der kontinuierlichen Betriebsweise der Reaktordruck auf 0,5 MPa erhöht. Die Glucoserestkonzentration in der zellfreien wäßrigen Gluconsäurelösung betrug 0,5 %.

    [0028] Nach einer kontinuierlichen Verfahrensführung von etwa 300 h wurde der Prozeß unterbrochen und mit frischer Biomasse erneut gestartet.

    Beispiel 4



    [0029] Die zur Produktion von Gluconsäure verwendete Bakterienbiomasse des Bakterienstamms IMET B 346 (vgl Beisp.1) wurde zentrifugiert, so daß ein Bakterienkonzentrat mit einem Feststoffgehalt von etwa 80 g/kg anfiel. Mit diesem Bakterienkonzentrat wurden in einem 12-1-Rührkesselfermenter 4 1 einer Glucose/ Fructose-Mischung mit jeweils 95 g/1 Glucose und Fructose angeimpft, so daß sich eine Zellkonzentration von 5 g/1 ergab. Anschließend wurde dieses Medium bei 30 °C mit einer Belüftungsrate von 10 1/1 - h belüftet und mit einer Rührerdrehzahl von 900 min-1 gerührt. Nach einer Fermentationsdauer von 11 h war eine vollständige Oxidation der eingesetzten Glucose zu Gluconsäure erfolgt und eine Säurekonzentration von 90,2 g, entsprechend einer Ausbeute von 95 %, bezogen auf Glucose, bei einer Produktivität von 8,2 g Säure/1 - h erreicht. Während dieser Produktbildungsphase wurde die aktuelle Sauerstoffkonzentration größer 10 % des Sättigungswerts gehalten. Die Fructose wurde hierbei von den Mikroorganismen nicht angegriffen.

    [0030] Nach Abtrennung der Biomasse sowie der Gluconsäure kann die fructosehaltige Mutterlauge je nach Verfahrensziel weiterverarbeitet werden.


    Ansprüche

    1. Verfahren zur bakteriellen Herstellung von Gluconsäure durch Oxidation von Glucose mit Hilfe von Bakterien der Art Acetobacter, gekennzeichnet

    - Verwendung von Bakterien der Art Acetobacter methanolicus
    und

    - diskontinuierliche oder kontinuierliche Verfahrensführung bei Verweilzeiten zwischen 5 und 60 h und

    - im pH-Bereich von 1 bis 6 und bei Temperaturen von 10 bis 35 °C.


     
    2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Verwendung von Bakterien des beim Zentralinsitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, DDR, unter der Hinterlegungsbezeichnung IMET B 346 hinterlegten Stamms von Acetobacter methanolicus.
     
    3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Anwendung einer Zellkonzentration ≥ 0,5 g.1-1.
     
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß neben Glucose als Substrat auch Glucose/Fructose-Gemische und/oder bei der Hydrolyse pflanzlicher Produkte wie Stärke oder Cellulose anfallende glucosehaltige End- und Zwischenprodukte eingesetzt werden.
     
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß während der Produktbildung die aktuelle Glucosekonzentration nicht höher als 25 % ist und in Abhängigkeit von der erreichten Produktkonzentration Biomasse nachgeführt wird.
     
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur kontinuierlichen Produktbildung der Produzentenstamm bzw die entsprechende Biomasse zurückgehalten oder zugeführt wird.