[0001] La présente invention concerne des micropeptides (peptides codés par des microARNs ou « miPEPs ») et leur utilisation pour moduler l'expression de gènes.
[0002] Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non codants, d'environ 21 nucléotides après maturation, qui contrôlent l'expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel, en dégradant l'ARNm cible ou en inhibant sa traduction. Les miRs sont rencontrés chez les plantes et les animaux.
[0003] Les gènes cibles sont souvent des gènes clés de processus développementaux. Ils codent par exemple des facteurs de transcription ou des protéines du protéasome.
[0004] La régulation de l'expression des miRs est très peu connue, mais on sait notamment que celle-ci fait intervenir, à l'instar de la plupart des gènes codants, une ARN polymerase II : cette enzyme produit un transcrit primaire, appelé «
pri-miR », qui est ensuite maturé par un complexe protéique contenant notamment les enzymes type Dicer. Cette maturation conduit tout d'abord à la formation d'un précurseur de miR appelé «
pre-miR », ayant une structure secondaire en forme tige-boucle contenant le
miR et sa séquence
miR∗ complémentaire. Puis le précurseur est maturé, ce qui conduit à la formation d'un ARN double brin plus court contenant le miR et le miR
∗. Le miR est ensuite pris en charge par le complexe RISC qui clive l'ARNm du gène cible ou bien inhibe sa traduction.
[0005] Par ailleurs, il a été montré que la présence d'introns dans le transcrit primaire du microARN augmente l'expression du microARN mature (
Schwab et al., EMBO Rep., 14(7) :615-21, 2013). Cependant, du fait de difficultés expérimentales, les transcrits primaires de microARNs, ou pri-miRs, sont très peu étudiés.
[0006] Environ 50% des gènes eucaryotes possèdent, au sein de leur région 5'UTR (5' UnTranslated Region) en amont de la séquence codante, de petits cadres ouverts de lecture. Ces petits cadres ouverts de lecture (ou « uORFs » pour upstream ORFs) peuvent jouer un rôle de régulateur de la traduction, principalement en
cis, en modulant la fixation et la vitesse des ribosomes sur l'ARNm, mais également en
trans selon un mécanisme encore inconnu, par l'intermédiaire de peptides codés par lesdits uORFs (
Combier et al., Gene Dev, 22 :1549-1559, 2008). Par définition, les uORFS sont présents en amont de gènes codants.
[0007] Récemment, il a également été découvert de petits ORFs dans de longs ARN non codants intergéniques (lincRNAs) dont la fonction putative, si elle existe, n'est pas connue (
Ingolia et al., Cell, 147(4) :789-802, 2011 ;
Guttman & Rinn, Nature, 482(7385) :339-46, 2012). Toutefois, aucun exemple n'a encore été rapporté concernant l'existence d'ORFs codant des peptides au sein de microARNs non codants. Jusqu'à présent, les microARNs, et par extension leur transcrit primaire, ont toujours été considérés, de par leur mode d'action particulier, comme des ARNs régulateurs non codants ne produisant aucun peptide.
[0008] L'un des aspects de l'invention est de proposer des peptides capables de moduler l'expression des microARNs.
[0009] Un autre aspect de l'invention est de proposer un moyen permettant de moduler l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles d'un microARN
[0010] La présente invention présente l'avantage de permettre un contrôle plus facile et plus efficace de l'expression de gènes ciblés par les microARNs, à l'aide d'un moyen autre que le microARN
[0011] L'invention concerne ainsi un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0012] L'invention concerne en particulier un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0013] L'invention concerne en particulier un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides, ou de 12 nucléotides, contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0014] L'invention concerne en particulier un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0015] Dans une première étape, le procédé de détection et d'identification d'un micropeptide consiste donc à détecter sur le transcrit primaire d'un microARN l'existence d'un cadre ouvert de lecture codant potentiellement un peptide.
[0016] La deuxième étape permet, quant à elle, de caractériser ledit peptide, c'est-à-dire de déterminer si ledit peptide correspond a un peptide réellement produit dans la cellule, en recherchant un effet dudit peptide sur l'accumulation dudit microARN
[0017] Pour mettre en évidence un effet du peptide sur l'accumulation du microARN, une quantité importante de peptide est introduite dans une première cellule exprimant ledit microARN. L'accumulation du microARN dans cette première cellule est ensuite mesurée et comparée avec l'accumulation du microARN dans une deuxième cellule identique à la première, mais ne contenant pas ledit peptide.
[0018] L'observation d'une variation des quantités de microARN entre les cellules en présence et en absence du peptide indique ainsi (i) qu'il existe un peptide codé sur le transcrit primaire dudit microARN, (ii) que la séquence de ce peptide est codée par le cadre ouvert de lecture identifié sur le transcrit primaire dudit microARN, et (iii) que ledit peptide agit sur l'accumulation dudit microARN
[0019] L'invention repose donc sur la double observation inattendue faite par les Inventeurs que d'une part, il existe des cadres ouverts de lecture susceptibles de coder des micropeptides présents sur les transcrits primaires de microARNs, et d'autre part que lesdits micropeptides sont capables de moduler l'accumulation desdits microARNs.
[0020] En particulier, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN, en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0021] En particulier, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides, ou de 12 nucléotides, contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN, en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0022] En particulier, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un micropeptide (miPEP) codé par une séquence nucléotidique contenue dans la séquence du transcrit primaire d'un microARN,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 12 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN, en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un micropeptide codé par ledit cadre ouvert de lecture.
[0023] Dans l'invention, les termes
« microARN », « microARN non codant » et
« miR » sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent des petites molécules d'ARN d'environ 21 nucléotides, qui ne sont pas traduites et ne conduisent pas à un peptide ou une protéine.
[0024] Cependant, sous cette forme mature, les microARNs assurent une fonction de régulation de certains gènes
via des mécanismes post-transcriptionnels, comme par exemple par l'intermédiaire du complexe RISC.
[0025] Le transcrit primaire du microARN ou
« pri-miR » correspond lui à la molécule d'ARN directement obtenue à partir de la transcription de la molécule d'ADN. Généralement, ce transcrit primaire subit une ou plusieurs modifications post-transcriptionnelles, qui entraînent par exemple une structure particulière de l'ARN ou un clivage de certaines parties de l'ARN par des phénomènes d'épissage, et qui conduisent à la forme précurseur du microARN ou
« pre-miR », puis à la forme mature du microARN ou
« miR ».
[0026] Les termes
« micropeptides » et
« miPEPs » (microRNA encoded PEPtides) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils définissent un peptide qui est codé par un cadre ouvert de lecture présent sur le transcrit primaire d'un microARN, et qui est capable de moduler l'accumulation dudit microARN. Les micropeptides au sens de la présente invention ne doivent être entendus comme étant nécessairement des peptides de petite taille, dans la mesure où « micro » ne correspond pas à la taille du peptide.
[0027] Selon l'invention, un miPEP peut être également assimilé à un modulateur de transcription, et notamment un activateur transcriptionnel. Un tel modulateur de transcription peut agir au niveau de la transcription pour moduler l'accumulation du pri-miR, du pre-miR et du miR. Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, un même micropeptide peut être codé par plusieurs séquences nucléotidiques. De telles séquences nucléotidiques, différentes entre elles d'au moins un nucléotide mais codant un même peptide, sont appelées «
séquences dégénérées »
.
[0028] Les termes «
cadre ouvert de lecture » ou «
ORF » (
open reading frame) sont équivalents et peuvent être utilisés l'un pour l'autre. Ils correspondent à une séquence de nucléotides dans une molécule d'ADN ou d'ARN pouvant potentiellement coder un peptide ou une protéine : ledit cadre ouvert de lecture débute par un codon start (le codon start codant généralement une méthionine), suivi d'une série de codons (chaque codon codant un acide aminé), et se termine par un codon stop (le codon stop n'étant pas traduit).
[0029] Dans l'invention, les ORFs peuvent être dénommés de manière spécifique «
miORFs » lorsque ceux-ci sont présents sur les transcrits primaires de microARN.
[0030] Les miORFs tels que définis dans l'invention particulier peuvent avoir une taille de 12 à 303 nucléotides et coder des peptides de 3 à 100 acides aminés.
[0031] En particulier, les miORFs tels que définis dans l'invention peuvent avoir une taille de 15 à 303 nucléotides. Un acide aminé étant codé par un codon de 3 nucléotides, les miORFs de 15 à 303 nucléotides codent des miPEPS de 4 à 100 acides aminés.
[0032] En particulier, les miORFs ont une taille de :
15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 47, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300 ou 303 nucléotides, et codent respectivement des miPEPs ayant une taille de :
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 acides aminés.
[0033] Dans l'invention, par «
accumulation », on entend la production d'une molécule, telle qu'un microARN ou un micropeptide, dans la cellule.
[0034] Ainsi, la
« modulation » de l'accumulation d'une molécule dans une cellule correspond à une modification de la quantité de cette molécule présente dans la cellule.
[0035] Par ailleurs, l'effet d'un miPEP peut être observé via la modulation de l'accumulation du miR, mais également à travers la modulation de l'accumulation du pri-miR ou du pre-miR correspondant.
[0036] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit microARN, en particulier une augmentation.
[0037] Une
«diminution de l'accumulation » correspond à une baisse de la quantité de ladite molécule dans la cellule.
[0038] A l'inverse, une
« augmentation de l'accumulation » correspond à une hausse de la quantité de ladite molécule dans la cellule.
[0039] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une augmentation de l'accumulation dudit microARN Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel la présence dudit peptide dans la cellule résulte :
- de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit peptide, ou
- de l'introduction dans la cellule dudit peptide.
[0040] De manière à caractériser un miPEP, il est nécessaire de disposer d'un modèle cellulaire exprimant un microARN et dans lequel ledit peptide à tester est présent. Pour cela, il est possible d'introduire un peptide dans la cellule, soit en mettant la cellule en contact avec le dit peptide, soit en introduisant dans la cellule un acide nucléique codant ledit peptide, lequel acide nucléique sera alors traduit en peptide à l'intérieur de la cellule.
[0041] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel le dit cadre ouvert de lecture de l'étape a) est contenu dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire du microARN, de préférence dans la partie 5'.
[0042] Les parties 5' ou 3' du transcrit primaire du microARN correspondent aux parties terminales de la molécule de l'ARN qui sont clivées au cours de la maturation du microARN
[0043] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est présent dans une cellule végétale sauvage.
[0044] Dans l'invention, une cellule végétale sauvage correspond à une cellule végétale qui n'a pas été modifiée génétiquement par l'homme.
[0045] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est présent dans une cellule animale sauvage, et notamment une cellule humaine sauvage ou une cellule de drosophile sauvage.
[0046] Dans l'invention, une cellule animale sauvage correspond à une cellule animale, et notamment humaine, qui n'a pas été modifiée génétiquement par l'homme.
[0047] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote déterminée et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b, sont des cellules végétales d'une plante crucifère telle
qu'Arabidopsis thaliana, d'une plante légumineuse telle que
Glycine max (soja),
Medicago truncatula et
Medicago sativa (luzerne) ou d'une plante solanacée telle que
Nicotiana benthamiana (tabac),
Solanum tuberosum (pomme de terre),
Solanum lycopersicum (tomate) ou
Solanum melongena (aubergine).
[0048] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote déterminée et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b, sont des cellules végétales, de préférence des cellules de
Medicago truncatula, de Nicotiana benthamiana ou
d'Arabidopsis thaliana.
[0049] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote déterminée et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b, sont des cellules animales, de préférence des cellules humaines ou de drosophile. Dans le procédé de détection et d'identification d'un micropeptide tel que défini ci-dessus, après avoir identifié un ORF susceptible de coder un peptide sur le transcrit primaire d'un microARN, il est nécessaire de disposer d'un modèle cellulaire possédant ledit microARN et ledit peptide, pour pouvoir démontrer un effet éventuel du peptide sur ledit microARN Deux options sont donc envisageables :
- le modèle cellulaire dans lequel a été identifié le miORF et celui dans lequel est mis en évidence l'effet du peptide sur le miR sont identiques, ou
- le modèle cellulaire dans lequel a été identifié le miORF et celui dans lequel est mis en évidence l'effet du peptide sur le miR sont différents.
[0050] Dans la première option, le modèle cellulaire utilisé pour observer un effet du peptide est le même que celui dans lequel le transcrit primaire dudit microARN a été isolé. Dans ce modèle cellulaire, les cellules eucaryotes déterminées contiennent naturellement ledit microARN et seul le peptide à tester doit être introduit dans ces cellules. Dans ce contexte, ledit microARN est qualifié « d'origine endogène » car celui-ci existe naturellement dans les cellules. Néanmoins, dans une cellule, d'autres copies d'un microARN d'origine endogène peuvent être ajoutées, comme par exemple en introduisant dans la cellule un vecteur codant ledit microARN d'origine endogène.
[0051] Dans la deuxième option, le modèle cellulaire utilisé pour observer un effet du peptide est différent de celui dans lequel le transcrit primaire dudit microARN a été isolé. Dans ce modèle cellulaire, les cellules eucaryotes déterminées ne contiennent ni le microARN, ni le peptide à tester. Ces deux éléments doivent donc être introduits dans ces cellules. Dans ce contexte, ledit microARN est qualifié « d'origine exogène » car celui-ci n'existe pas naturellement dans les cellules.
[0052] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b).
[0053] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN est d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b), lesdites cellules eucaryotes contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN
[0054] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en œuvre une RT-PCR quantitative ou un Northern blot.
[0055] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un miPEP tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en œuvre une puce à ADN ou à ARN
[0056] L'accumulation dudit microARN peut être déterminée à l'aide des techniques de biologie moléculaire permettant le dosage de molécules d'acides nucléiques spécifiques.
[0057] Dans un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de détection et d'identification d'un microARN dont la séquence du transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un miPEP,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote, de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant ledit microARN,
en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un microARN dont le transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un micropeptide.
[0058] En particulier, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN dont la séquence du transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un miPEP,
comprenant :
- a) une étape de détection d'un cadre ouvert de lecture de 15 à 303 nucléotides contenu dans la séquence du transcrit primaire dudit microARN, puis
- b) une étape de comparaison entre :
- l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN,
en présence d'un peptide codé par une séquence nucléotidique identique ou dégénérée par rapport à celle dudit cadre ouvert de lecture, ledit peptide étant présent dans la cellule indépendamment de la transcription du transcrit primaire dudit microARN, et - l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote, de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée exprimant le transcrit primaire dudit microARN, en absence dudit peptide,
dans lequel, une modulation de l'accumulation dudit microARN en présence dudit peptide par rapport à l'accumulation dudit microARN en absence dudit peptide indique l'existence d'un microARN dont le transcrit primaire contient une séquence nucléotidique codant un micropeptide.
[0059] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel la modulation de l'accumulation dudit microARN est une diminution ou une augmentation de l'accumulation dudit microARN, en particulier une augmentation.
[0060] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel la présence dudit peptide dans la cellule résulte :
- de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit peptide, ou
- de l'introduction dans la cellule de ledit peptide.
[0061] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel le dit cadre ouvert de lecture de l'étape a) est contenu dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire du microARN, de préférence dans la partie 5'.
[0062] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est présent dans une cellule végétale sauvage.
[0063] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est présent dans une cellule animale, et notamment humaine, sauvage.
[0064] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote, et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b) sont des cellules végétales, de préférence des cellules de
Medicago truncatula.
[0065] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite cellule eucaryote, et ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b) sont des cellules animales, de préférence des cellules de drosophile.
[0066] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit microARN est d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b).
[0067] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN est d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote et dans ladite cellule eucaryote de même type que la susdite cellule eucaryote déterminée, utilisées à l'étape b), lesdites cellules eucaryotes contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN.
[0068] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en œuvre une RT-PCR quantitative ou un Northern blot.
[0069] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'un microARN tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit microARN est déterminée en mettant en œuvre une puce à ADN ou à ARN
[0070] Dans un autre aspect, l'invention concerne un miPEP tel qu'obtenu par la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus.
[0071] Plus particulièrement, l'invention concerne un miPEP codé par une séquence nucléotidique telle qu'obtenue par la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus. En d'autres termes, l'invention concerne un miPEP codé par une séquence nucléotidique détectée et identifiée par la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus.
[0072] Un autre aspect de l'invention concerne également un miPEP de 3 à 100 acides aminés, en particulier de 4 à 100 acides aminés, notamment de 4 à 60 acides aminés, de préférence de 4 à 40 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote.
[0073] Un autre aspect de l'invention concerne également un miPEP de 4 à 100 acides aminés, ou de 3 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote.
[0074] Un autre aspect de l'invention concerne également un miPEP de 3 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote.
[0075] En particulier, le miPEP tel que défini dans l'invention est codé par un miORF de 15 à 303 nucléotides et a une taille de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 acides aminés, en particulier 5, 8, 10, 18, 19, 23, 37, 50 ou 59 acides aminés.
[0076] En particulier, le miPEP de l'invention a une taille allant de 4 à 10 acides aminés, 4 à 20 acides aminés, 4 à 30 acides aminés, 4 à 40 acides aminés, 4 à 50 acides aminés, 4 à 60 acides aminés, 4 à 70 acides aminés, 4 à 80 acides aminés, 4 à 90 acides aminés, ou 4 à 100 acides aminés.
[0077] Par ailleurs, il convient de noter que plusieurs miORFS peuvent être identifiés sur le transcrit primaire d'un microARN, indiquant qu'un transcrit primaire de microARN peut potentiellement coder plusieurs miPEPs.
[0078] Il convient également de noter que l'effet d'un miPEP est généralement spécifique d'un seul microARN, à savoir celui résultant du transcrit primaire codant ledit miPEP.
[0079] La modulation du microARN par ledit miPEP peut être mise en évidence après observation d'une variation de quantités de microARN entre les cellules en présence et en absence de miPEP.
[0080] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ladite séquence nucléotidique étant contenue dans la partie 5' ou 3' dudit transcrit primaire d'un microARN, de préférence dans la partie 5'.
[0081] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant au premier cadre ouvert de lecture présent sur ledit transcrit primaire d'un microARN.
[0082] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ledit miPEP possédant un point isoélectrique basique, de préférence supérieur à 8.
[0083] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ledit miPEP possédant un point isoélectrique acide.
[0084] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, et SEQ ID NO : 355 (Table 1).
[0085] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, ledit miPEP étant choisi parmi le groupe de peptides consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104 et SEQ ID NO : 355,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0086] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un miPEP tel que défini ci-dessus, consistant en la séquence d'acides aminés MVT.
[0087] Dans un autre aspect, l'invention concerne une molécule d'acide nucléique codant un miPEP tel que défini ci-dessus.
[0088] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, ladite molécule étant choisie parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en SEQ ID NO : 105 à SEQ ID NO 208, SEQ ID NO : 387 à SEQ ID NO : 399 et SEQ ID NO : 356 (Table 2).
[0089] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, ladite molécule étant choisie parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en :
- SEQ ID NO : 105 à SEQ ID NO 208 et SEQ ID NO : 356,
- SEQ ID NO : 387 à SEQ ID NO : 399, ou
- SEQ ID NO: 425.
[0090] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO : 59) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 163) contenue dans le transcrit primaire du miR171b (SEQ ID NO : 319), ledit MtmiPEP171b1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR171b dans une cellule eucaryote.
[0091] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO : 24) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 128) contenue dans le transcrit primaire du miR164a (SEQ ID NO : 297), ledit AtmiPEP164a1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR164a dans une cellule eucaryote.
[0092] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le AtmiPEP165a (SEQ ID NO : 43) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 147) contenue dans le transcrit primaire du miR165a (SEQ ID NO : 305), ledit miPEP165a étant capable de moduler l'accumulation dudit miR165a dans une cellule eucaryote.
[0093] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO : 76) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 180) contenue dans le transcrit primaire du miR319a (SEQ ID NO : 331), ledit AtmiPEP319a1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR319a dans une cellule eucaryote.
[0094] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO : 77) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 181) contenue dans le transcrit primaire du miR319a (SEQ ID NO : 331), ledit AtmiPEP319a2 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR319a dans une cellule eucaryote.
[0095] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO : 14) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 118) contenue dans le transcrit primaire du miR160b (SEQ ID NO : 291), ledit AtmiPEP160b1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR160b dans une cellule eucaryote.
[0096] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le MtmiPEP169d (SEQ ID NO : 424) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 425) contenue dans le transcrit primaire du miR169d (SEQ ID NO : 427), ledit MtmiPEP169d étant capable de moduler l'accumulation dudit miR169d dans une cellule eucaryote.
[0097] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le MtmiPEP171e (SEQ ID NO : 63) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 167) contenue dans le transcrit primaire du miR171e (SEQ ID NO : 322), ledit MtmiPEP171e étant capable de moduler l'accumulation dudit miR171e dans une cellule eucaryote.
[0098] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le DmmiPEPla (SEQ ID NO : 102) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 206) contenue dans le transcrit primaire du miR1 (SEQ ID NO : 353), ledit dmmiPEPla étant capable de moduler l'accumulation dudit miR1 dans une cellule eucaryote.
[0099] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le DmmiPEP1b (SEQ ID NO : 103) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 207) contenue dans le transcrit primaire du miR1 (SEQ ID NO : 353), ledit dmmiPEP1b étant capable de moduler l'accumulation dudit miR1 dans une cellule eucaryote.
[0100] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le dmmiPEP8 (SEQ ID NO : 104) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 208) contenue dans le transcrit primaire du miR8 (SEQ ID NO : 354), ledit dmmiPEP8 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR8 dans une cellule eucaryote.
[0101] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le HsmiPEP155 (SEQ ID NO : 355) codé par la séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 356) contenue dans le transcrit primaire du miR155 (SEQ ID NO : 358), ledit HsmiPEP155 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR155 dans une cellule eucaryote.
[0102] Dans un autre aspect, l'invention concerne un peptide isolé, ou un peptide isolé et purifié, ou un peptide synthétique ou un peptide recombinant, comprenant ou consistant en une séquence identique à celle d'un miPEP, ledit miPEP étant notamment présent naturellement chez une plante, ou chez un animal, tel que l'Homme.
[0103] Dans autre aspect, l'invention concerne un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique tel que définie ci-dessus.
[0104] Dans un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique,
pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP,
l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN
[0105] Dans un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
- un miPEP de 4 à 100 acides aminés, de préférence de 4 à 40 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique,
pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP,
l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN
[0106] Dans un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
- un miPEP de 4 à 100 acides aminés, ou de 3 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique,
pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP,
l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN
[0107] Dans un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation d'au moins :
- un miPEP de 3 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique,
pour moduler l'expression d'au moins un gène dans une cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée étant capable d'exprimer un microARN, dont le transcrit primaire contient au moins une séquence nucléotidique codant ledit au moins un miPEP et dont l'accumulation est modulée par ledit au moins un miPEP,
l'expression dudit au moins un gène étant régulée par ledit microARN
[0108] L'invention repose sur l'observation surprenante faite par les Inventeurs qu'il est possible de moduler l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles d'un même microARN en modulant l'accumulation dudit microARN à l'aide d'un miPEP.
[0109] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule végétale.
[0110] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule végétale d'une plante crucifère telle qu'
Arabidopsis thaliana, d'une plante légumineuse telle que
Glycine max (soja),
Medicago truncatula et
Medicago sativa (luzerne) ou d'une plante solanacée telle que
Nicotiana benthamiana (tabac),
Solanum tuberosum (pomme de terre),
Solanum lycopersicum (tomate) ou
Solanum melongena (aubergine).
[0111] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule animale, notamment humaine.
[0112] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule animale, notamment humaine, ledit miPEP n'étant pas utilisé pour le traitement chirurgical ou thérapeutique du corps humain ou animal, ni pour modifier l'identité génétique de l'être humain.
[0113] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite cellule eucaryote déterminée est une cellule animale, ledit miPEP étant utilisé pour le traitement chirurgical ou thérapeutique du corps humain ou animal.
[0114] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN et ledit gène sont d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote déterminée.
[0115] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN et ledit gène sont d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée contenant au moins un vecteur permettant l'expression dudit microARN et dudit gène.
[0116] Dans l'invention, les expressions «
d'origine endogène » et
« d'origine exogène » sont utilisées pour distinguer lesdits microARNs et/ou les gènes d'espèces différentes, étant donné la conservation des séquences entre espèces.
[0117] Ainsi, le terme
« d'origine endogène » indique que le microARN et/ou le gène peuvent être présents de manière naturelle dans la cellule en question. De manière artificielle, d'autres copies du microARN et/ou du gène d'origine endogène peuvent néanmoins être ajoutées dans la cellule en question, comme par exemple par clonage.
[0118] A l'inverse, le terme
« d'origine exogène » indique que le microARN et/ou le gène ne sont jamais présents naturellement dans la cellule en question. Il s'agit d'un microARN et/ou d'un gène identifié dans un autre type cellulaire ou dans un organisme d'une autre espèce, ce microARN et/ou ce gène sont donc nécessairement introduits artificiellement dans la cellule en question.
[0119] Dans l'invention, une cellule transformée génétiquement peut donc contenir 2 groupes de microARNs et/ou de gènes potentiellement proches en termes de séquence, l'un d'origine endogène et l'autre d'origine exogène.
[0120] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle le transcrit primaire du miARN et ledit gène sont d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote déterminée, ladite cellule eucaryote déterminée contenant au moins un vecteur permettant l'expression du transcrit primaire du microARN
[0121] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle le transcrit primaire du miARN est codé par un vecteur introduit articiellement dans la cellule.
[0122] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386 et SEQ ID NO : 355 (Table 1). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe de peptides consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104 et SEQ ID NO : 355,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0123] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO : 59), le AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO : 24), le AtmiPEP165a (SEQ ID NO : 43), le AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO : 76) et le AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO : 77).
[0124] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi : le MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO : 59), le AtmiPEP164a1 (SEQ ID NO : 24), le AtmiPEP165a (SEQ ID NO : 43), le AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO : 76), le AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO : 77), le AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO : 14), le MtmiPEP171e (SEQ ID NO : 63) et le MtmiPEP169d (SEQ ID NO : 424).
[0125] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le DmmiPEPla (SEQ ID NO : 102), le DmmiPEP1b (SEQ ID NO : 103) et le DmmiPEP8 (SEQ ID NO : 104).
[0126] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est le HsmiPEP155a (SEQ ID NO : 355).
[0127] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en SEQ ID NO : 105 à SEQ ID NO : 208 et SEQ ID NO : 356 (Table 2).
[0128] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en :
- SEQ ID NO : 105 à SEQ ID NO : 208 et SEQ ID NO : 356,
- SEQ ID NO : 387 à SEQ ID NO : 399, ou
- SEQ ID NO: 425.
[0129] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le miORF171b (SEQ ID NO : 163), le miORF164a1 (SEQ ID NO : 128), le miORF165a(SEQ ID NO : 147), le miORF319a1 (SEQ ID NO : 180) et le miORF319a2 (SEQ ID NO : 181).
[0130] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le miORF171b (SEQ ID NO : 163), le miORF164a1 (SEQ ID NO : 128), le miORF165a (SEQ ID NO : 147), le miORF319a1 (SEQ ID NO : 180), le miORF319a2 (SEQ ID NO : 181), le miORF160b1 (SEQ ID NO : 118), le miORF169d (SEQ ID NO : 425) et le miORF171e (SEQ ID NO : 167).
[0131] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le miORFla (SEQ ID NO : 206), le miORF1b (SEQ ID NO : 207) et le miORF8 (SEQ ID NO : 208).
[0132] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est choisi parmi le miORF155 (SEQ ID NO : 356). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en SEQ ID NO : 282 à SEQ ID NO : 354 et SEQ ID NO : 358.
[0133] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le groupe d'acides nucléiques consistant en :
- SEQ ID NO : 282 à SEQ ID NO : 354 et SEQ ID NO : 358,
- SEQ ID NO : 412 à SEQ ID NO : 423, ou
- SEQ ID NO : 427.
[0134] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le miR171b (SEQ ID NO : 319), le miR165a (SEQ ID NO : 305) et le miR319a (SEQ ID NO : 331).
[0135] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le miR171b (SEQ ID NO : 319), le miR164a (SEQ ID NO : 297), le miR165a (SEQ ID NO : 305), le miR319a (SEQ ID NO : 331), le miR160b (SEQ ID NO : 291), le miR171e (SEQ ID NO : 322) et le miR169d (SEQ ID NO : 427).
[0136] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le miR1a (SEQ ID NO : 353) et le miR8 (SEQ ID NO : 354).
[0137] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est choisi parmi le miR155 (SEQ ID NO : 358).
[0138] Dans un autre aspect, l'invention concerne en particulier un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par un microARN dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation d'un miPEP dans ladite cellule eucaryote,
ledit miPEP ayant :
- une taille de 3 à 100 acides aminés, de préférence 4 à 20 acides aminés, et
- une séquence peptidique identique à celle codée par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN régulant l'expression dudit gène, et
- étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN,
dans lequel, l'accumulation dudit miPEP dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit miPEP.
[0139] Dans un autre aspect, l'invention concerne en particulier un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par un microARN dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation d'un miPEP dans ladite cellule eucaryote,
ledit miPEP ayant :
- une taille de 4 à 100 acides aminés, ou de 3 acides aminés, et
- une séquence peptidique identique à celle codée par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN régulant l'expression dudit gène, et
- étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN,
dans lequel, l'accumulation dudit miPEP dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit miPEP.
[0140] Dans un autre aspect, l'invention concerne en particulier un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par un microARN dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation d'un miPEP dans ladite cellule eucaryote,
ledit miPEP ayant :
- une taille de 3 acides aminés, et
- une séquence peptidique identique à celle codée par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN régulant l'expression dudit gène, et
- étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN,
dans lequel, l'accumulation dudit miPEP dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit miPEP.
[0141] En particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par un microARN dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation d'un miPEP dans ladite cellule eucaryote,
ledit miPEP ayant :
- une taille de 4 à 100 acides aminés, de préférence 4 à 20 acides aminés, et
- une séquence peptidique identique à celle codée par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN régulant l'expression dudit gène, et
- étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN,
dans lequel, l'accumulation dudit miPEP dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit miPEP.
[0142] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus, dans lequel l'accumulation dudit miPEP dans la cellule résulte :
- de l'introduction dans la cellule d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- de l'introduction dans la cellule dudit miPEP.
[0143] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ladite cellule eucaryote est une cellule végétale.
[0144] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ladite cellule eucaryote est une cellule animale et notamment humaine.
[0145] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ladite cellule eucaryote est une cellule animale et notamment humaine, ledit procédé n'étant pas utilisé pour le traitement chirurgical ou thérapeutique du corps humain ou animal, ni pour modifier l'identité génétique de l'être humain.
[0146] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN et ledit gène sont d'origine endogène dans ladite cellule eucaryote.
[0147] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit microARN et ledit gène sont d'origine exogène dans ladite cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote contenant au moins un vecteur permettant l'expression dudit microARN et dudit gène.
[0148] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit miPEP est choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104, SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386 et SEQ ID NO : 355.
[0149] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène tel que défini ci-dessus dans lequel ledit miPEP est choisi parmi le groupe de peptides consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 104 et SEQ ID NO : 355,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0150] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR171b (SEQ ID NO : 319) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO : 59) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit MtmiPEP171b1 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit MtmiPEP 171b1.
[0151] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR171b (SEQ ID NO : 319) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du MtmiPEP171b1 (SEQ ID NO : 59) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit MtmiPEP171b1 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit MtmiPEP 171b1,
dans lequel ledit gène est choisi parmi les gènes HAM1 (accession n° MtGI9- TC114268) et HAM2 (accession n° MtGI9- TC120850) (numéros d'accession selon la banque de donnees Medicago truncatula Gene Expression Atlas « MtGEA »).
[0152] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR164a (SEQ ID NO : 297) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du AtmiPEP165a1 (SEQ ID NO : 24) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit AtmiPEP164a1 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit AtmiPEP164a1.
[0153] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR165a (SEQ ID NO : 305) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du AtmiPEP165a (SEQ ID NO : 43) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit AtmiPEP165a dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit AtmiPEP165a.
[0154] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR319a (SEQ ID NO : 331) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du AtmiPEP319a1 (SEQ ID NO : 76) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit AtmiPEP319a1 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit AtmiPEP319a1.
[0155] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR319a (SEQ ID NO : 331) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du AtmiPEP319a2 (SEQ ID NO : 77) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit AtmiPEP319a2 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit AtmiPEP319a2.
[0156] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR160b (SEQ ID NO : 291) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du AtmiPEP160b1 (SEQ ID NO : 14) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit AtmiPEP160b1 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit AtmiPEP160b1.
[0157] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR169d (SEQ ID NO : 427) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du MtmiPEP169d (SEQ ID NO : 424) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit MtmiPEP169d dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit MtmiPEP169d.
[0158] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR171e (SEQ ID NO : 322) dans une cellule eucaryote,
comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du MtmiPEP171e (SEQ ID NO : 63) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit MtmiPEP171e dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit MtmiPEP171e.
[0159] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR1 (SEQ ID NO : 353) dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du DmmiPEPla (SEQ ID NO : 102) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit DmmiPEPla dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit DmmiPEPla.
[0160] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR1 (SEQ ID NO : 353) dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du DmmiPEP1b (SEQ ID NO : 103) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit DmmiPEP1b dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit DmmiPEP1b.
[0161] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR8 (SEQ ID NO : 354) dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du DmmiPEP8 (SEQ ID NO : 104) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit DmmiPEP8 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit DmmiPEP8.
[0162] Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un procédé de modulation de l'expression d'un gène régulée par le miR155 (SEQ ID NO : 358) dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en œuvre d'une étape d'accumulation du hsmiPEP155 (SEQ ID NO : 355) dans ladite cellule eucaryote,
dans lequel, l'accumulation dudit hsmiPEP155 dans ladite cellule eucaryote induit une modulation de l'expression dudit gène par rapport à l'expression dudit gène sans accumulation dudit hsmiPEP155.
[0163] Dans un autre aspect, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée contenant un peptide identique à un miPEP tel que défini ci-dessus, lequel peptide est présent dans ladite cellule eucaryote indépendamment de la transcription du transcrit primaire du microARN portant la séquence nucléotidique codant ledit miPEP.
[0164] Dans l'invention, le terme «
cellule eucaryote modifiée » signifie que ladite cellule eucaryote contient un miPEP introduit artificiellement dans la cellule, que ce soit en tant que peptide, ou par l'intermédiaire d'un vecteur codant ledit miPEP.
[0165] En plus d'un miPEP introduit artificiellement dans la cellule, une cellule eucaryote modifiée selon l'invention contient également au moins un acide nucléique correspondant au miORF codant ledit miPEP.
[0166] En plus d'un miPEP introduit artificiellement dans la cellule et du miORF, une cellule eucaryote modifiée selon l'invention contient également au moins un miR, dont le transcrit primaire contient ledit miORF.
[0167] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit microARN est d'origine endogène.
[0168] Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit microARN est d'origine exogène, ladite cellule eucaryote modifiée contenant un vecteur permettant l'expression dudit microARN
[0169] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, ladite cellule étant une cellule végétale.
[0170] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle la dite cellule végétale est une cellule de
Medicago truncatula ou
d'Arabidopsis thaliana, ledit peptide est choisi parmi le groupe de peptides consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0171] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle la dite cellule végétale est une cellule de
Medicago truncatula ou
d'Arabidopsis thaliana, ledit peptide est choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 77.
[0172] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle la dite cellule végétale est une cellule de
Medicago truncatula ou
d'Arabidopsis thaliana, ledit peptide est choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 76, SEQ ID NO : 77, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 424 et SEQ ID NO : 63
[0173] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, ladite cellule étant une cellule animale.
[0174] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle la dite cellule animale est une cellule de drosophile et ledit peptide est choisi parmi le groupe de peptides consistant en SEQ ID NO : 102, SEQ ID NO : 103 et SEQ ID NO : 104.
[0175] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus, dans laquelle la dite cellule animale est une cellule humaine et ledit peptide consiste en SEQ ID NO : 355.
[0176] Dans un autre aspect, l'invention concerne une plante comprenant au moins une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus.
[0177] Dans un autre aspect, l'invention concerne également un organisme animal non humain comprenant au moins une cellule eucaryote modifiée telle que définie ci-dessus.
[0178] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0179] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins un miPEP choisi parmi le groupe consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0180] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pesticide comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0181] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition phytopharmaceutique comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0182] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition élicitrice comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0183] Par « composition élicitrice », on désigne une composition capable de conférer à la plante une meilleure aptitude à la symbiose ou une meilleure résistance à différents stress, qu'ils soient de nature thermiques, hydriques ou chimiques.
[0184] A cet effet, l'invention concerne également des compositions agissant sur la croissance (inhibition de la croissance ou au contraire augmentation de la croissance) et la physiologie (meilleure aptitude à mycorhizer, noduler, meilleure tolérance à différents stress) de la plante.
[0185] En particulier, l'invention concerne des compositions pour favoriser la croissance des plantes.
[0186] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition herbicide comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0187] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition insecticide comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
[0188] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP164a en tant que substance active, ledit miPEP164a consistant de préférence en SEQ ID NO : 24.
[0189] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP319a en tant que substance active, ledit miPEP319a consistant de préférence en SEQ ID NO : 76.
[0190] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP171b en tant que substance active, ledit miPEP171b consistant de préférence en SEQ ID NO : 59.
[0191] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP165a en tant que substance active, ledit miPEP165a consistant de préférence en SEQ ID NO : 43.
[0192] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP319a2 en tant que substance active, ledit miPEP319a2 consistant de préférence en SEQ ID NO : 77.
[0193] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP160b1 en tant que substance active, ledit miPEP160b1 consistant de préférence en SEQ ID NO : 14.
[0194] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP169d en tant que substance active, ledit miPEP169d consistant de préférence en SEQ ID NO : 424.
[0195] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition, en particulier une composition phytosanitaire, comprenant le miPEP171e en tant que substance active, ledit miPEP171e consistant de préférence en SEQ ID NO : 63.
[0196] Les propriétés solubles des miPEPs sont déterminées notamment par leur composition en acides aminés. Les miPEPs hydrophiles peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solutions aqueuses, telles que l'eau. Les miPEPs hydrophobes peuvent être solubilisés et conditionnés dans des solvants, tels que les solvants organiques.
[0197] Pour un traitement des plantes par les miPEPS, les solvants organiques sont des solvants non toxiques pour les plantes en faibles quantités, c'est-à-dire qu'ils n'ont pas d'effet délétères sur le développement de la plante. De manière non limitative, les solvants organiques peuvent être choisis parmi l'acétonitrile et l'acide acétique.
[0198] Les miPEPs peuvent également être solubilisés et conditionnés dans des mélanges de solvants organiques, comme par exemple un mélange d'acétonitrile et d'acide acétique. En particulier, les miPEPs peuvent être solubilisés dans une solution comprenant 50 % d'acétonitrile, 10% d'acide acétique et 40% d'eau (volume/volume/volume).
[0199] De préférence, les miPEPs 164a et 165a sont dissous dans de l'eau, et les miPEPs 171b et 319a sont dissous dans une solution comprenant 50 % d'acétonitrile, 10% d'acide acétique et 40% d'eau (volume/volume/volume).
[0200] De manière non limitative, les compositions, les compositions pesticides, les compositions phytopharmaceutiques, les compositions herbicides et les compositions insecticides telles que définies ci-dessus peuvent comprendre 10
-9 M à 10
-4 M de miPEP, notamment 10
-9 M, 10
-8 M, 10
-7 M, 10
-6 M, 10
-5 M ou 10
-4 M de miPEP.
[0201] Des compositions plus ou moins concentrées peuvent également être prévues selon les applications envisagées. Par exemple, des compositions comprenant 10
-1 M à 10
-3 M de miPEP, notamment 10
-1 M, 10
-2 M ou 10
-3 M de miPEP, peuvent être envisagées dans le cas où le miPEP doit être administré à la plante par épandage.
[0202] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'herbicide pour éliminer les plantes ou ralentir leur croissance, de préférence en tant qu'herbicide spécifique d'une espèce ou d'un genre de plantes.
[0203] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'agent phytopharmaceutique,
- pour favoriser la croissance et/ou le développement des plantes,
notamment pour la modulation des paramètres physiologiques d'une plante, en particulier la biomasse, la surface foliaire, la floraison, le calibre du fruit, la production et/ou la sélection de semence végétales, en particulier pour contrôler la parthénocarpie ou la monoecie d'une plante, ou pour la modification des paramètres physiologiques de semences végétales, en particulier la germination, l'implantation racinaire et la résistance au stress hydrique,
- ou pour prévenir ou traiter les maladies des plantes,
en particulier pour favoriser la résistance aux maladies infectieuses.
[0204] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour moduler les paramètres physiologiques d'une plante, en particulier la biomasse, la surface foliaire, ou le calibre du fruit.
[0205] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour l'éclaircissage de vergers afin d'augmenter le calibre des fruits. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour la production et/ou la sélection de semences végétales, ladite composition étant utilisée pour contrôler la parthénocarpie ou la monœcie d'une plante. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, ladite composition étant administrée à ladite plante par la voie foliaire ou par la voie racinaire.
[0206] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour la production et/ou la sélection de semences végétales.
[0207] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est utilisée pour modifier les paramètres physiologiques desdites semences végétales, en particulier l'implantation racinaire, la germination et la résistance au stress hydrique.
[0208] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est appliquée par enrobage ou pelliculage sur lesdites semences végétales.
[0209] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant que pesticide, pour éliminer les organismes nuisibles des plantes ou susceptibles d'être classés comme tels, notamment en tant qu'insecticide, arachnicide, limacide ou rodonticide.
[0210] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant qu'insecticide.
[0211] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour éliminer les insectes ravageurs.
[0212] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, pour éliminer les espèces animales classées nuisibles ou susceptibles d'être classées comme telles, en particulier les muridae, notamment le rat.
[0213] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, en tant que pesticide pour éliminer les organismes nuisibles des plantes ou susceptibles d'être classés comme tels,
notamment en tant qu'insecticide, arachnicide, limacide, ou rodonticide,
en particulier par application de ladite composition sur une plante ou sur un support en contact avec la plante.
[0214] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite composition est appliquée sur une plante pour la protéger d'insectes ravageurs.
[0215] Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide pour favoriser la croissance d'une plante, ledit peptide étant introduit dans la plante, ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés comprenant ou consistant en une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent dans ladite plante,
ledit miPEP naturellement présent dans ladite plante étant un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs.
[0216] Les Inventeurs ont constaté de manière surprenante que l'utilisation de peptides dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle de miPEPs codés sur les transcrits primaires de miRs, permet de favoriser la croissance des plantes.
[0217] Dans l'invention, le terme «
plante » fait référence de manière générale à tout ou partie d'une plante quel que soit son stade de développement (y compris la plante sous forme de graine ou de jeune pousse), à un ou plusieurs organes de la plante (comme par exemple les feuilles, les racines, la tige, les fleurs), à une ou plusieurs cellules de la plante, ou encore à un amas de cellules de la plante.
[0218] Dans l'invention, le terme «
croissance » fait référence au développement de tout ou partie d'une plante au cours du temps. La croissance de la plante peut ainsi être déterminée et quantifiée par le suivi de paramètres évolutifs observables pour certaines parties, cellules ou organes de la plante, tels que les feuilles, les racines, les tiges ou encore les fleurs.
[0219] De manière non limitative, les paramètres permettant de déterminer et quantifier la croissance d'une plante peuvent être notamment :
- la taille, la surface, le volume, la masse et le nombre de feuilles,
- la taille et le nombre de fleurs,
- la taille de la tige (ou de la hampe florale),
- la longueur et le nombre de racines,
- la précocité de la germination,
- la précocité du bourgeonnement,
- la précocité de l'induction florale (ou transition florale),
- ou encore le nombre de cellules.
[0220] Dans le cas des plantes légumineuses, la croissance de la plante peut également être liée à la vitesse de nodulation, ou encore à la taille et au nombre de nodules sur les racines.
[0221] Par ailleurs, dans l'invention, l'expression «
favoriser la croissance de la plante », ou «
améliorer la croissance de la plante », indique :
- soit une accélération du développement (comme par exemple une taille des feuilles plus importante pour une plante à un instant donné par rapport à une plante de référence),
- soit à un accroissement du développement (comme par exemple une taille de feuilles plus importante pour une plante qui ne peut être atteinte par une plante de référence),
- soit à une accélération et un accroissement du développement de la plante.
[0222] Il est important de noter que l'utilisation selon l'invention possède l'avantage d'être écologique, en comparaison des méthodes chimiques classiquement utilisées dans l'industrie botanique ou dans l'agriculture, car le miPEP est un peptide qui est présent naturellement chez la plante.
[0223] L'invention concerne également l'utilisation d'un miPEP introduit dans une plante pour en favoriser la croissance,
ledit miPEP introduit étant un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent dans ladite plante,
lequel miPEP naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés, dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR,
ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs,
la somme de la quantité dudit miPEP introduit et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement présent.
[0224] Dans l'invention, l'expression «
miPEP introduit» fait référence à un miPEP introduit artificiellement dans la plante par opposition au «
miPEP présent naturellement dans la plante ». L'introduction d'un miPEP dans la plante implique donc une étape technique, laquelle étape n'est pas un phénomène naturel et ne correspond ni à un croisement, ni à une sélection.
[0225] Le miPEP introduit peut être soit un peptide produit hors de la plante (comme par exemple un peptide isolé et/ou purifié, un peptide synthétique ou un peptide recombinant), soit un peptide produit dans la plante suite à l'introduction non naturelle d'un acide nucléique codant ledit miPEP dans ladite plante.
[0226] La plante dans laquelle le miPEP n'a pas été introduit possède une quantité basale dudit miPEP, qui correspond à celle dudit miPEP naturellement présent. L'utilisation d'un miPEP comprenant, ou consistant en, une séquence identique à celle dudit miPEP entraîne une augmentation de la quantité totale de miPEP, ce qui module l'accumulation du miR dont le transcrit primaire contient la séquence codant ledit miPEP.
[0227] Par ailleurs, le miPEP introduit se retrouve dans la plante et son introduction n'a pas d'impact sur sa stabilité.
[0228] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
NAC1 (Accession n°AT1G56010.1),
NAC4 (Accession n° AT5G07680.1),
NAC5 (Accession n° AT5G61430.1),
CUC1 (Accession n° AT3G15170.1),
CUC2 (Accession n° AT5G53950.1),
TCP3 (Accession n°AT1G53230.1) et
TCP4 (Accession n°AT3G15030.1) (numéros d'accession selon la banque de données
The Arabidopsis Information Resource « TAIR »). En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 et
CUC2. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
TCP3 et
TCP4.
[0229] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miARN est choisi parmi le miR164a et le mir319a.
[0230] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miR est choisi parmi le miR164a, le miR319a, le miR171b, le miR165a, le miR160b, le miR169d et le miR171e.
[0231] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le AtmiPEP164a1, le AtmiPEP319a1, le AtmiPEP319a2, le MtmiPEP171b1, le AtmiPEP165a1, le AtmiPEP160b1, le MtmiPEP169d, le MtmiPEP171e.
[0232] En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle, ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 297.
[0233] En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit ledit miR164a possède une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90 % d'identité, avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 297. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est le AtmiPEP164a1, en particulier, dans laquelle ledit AtmiPEP164a1 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 24.
[0234] En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle, ledit miR319a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 331.
[0235] En particulier, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit ledit miR319a possède une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90 % d'identité, avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 331. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est le AtmiPEP319a1, en particulier, dans laquelle ledit AtmiPEP319a1 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 76. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est une plante crucifère telle qu'
Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que
Glycine max (soja),
Medicago truncatula et
Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que
Nicotiana benthamiana (tabac),
Solanum tuberosum (pomme de terre),
Solanum lycopersicum (tomate) ou
Solanum melongena (aubergine). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est une plante crucifère.
[0236] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ladite plante est
Arabidopsis thaliana.
[0237] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante
Arabidopsis thaliana, dans laquelle le AtmiPEP164a1 est introduit dans ladite plante
Arabidopsis thaliana, ledit AtmiPEP164a1 étant également naturellement présent dans ladite plante
Arabidopsis thaliana,
ledit AtmiPEP164a1 introduit étant un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent, ladite séquence du AtmiPEP164a1 naturellement présent étant codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana,
la somme de la quantité dudit AtmiPEP164a1 introduit et de celle dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent chez ladite plante Arabidopsis thaliana.
[0238] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante
Arabidopsis thaliana, dans laquelle le AtmiPEP319a1 est introduit dans ladite plante
Arabidopsis thaliana, ledit AtmiPEP319a1 étant également naturellement présent dans ladite plante
Arabidopsis thaliana,
ledit AtmiPEP319a1 introduit étant un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent, ladite séquence du AtmiPEP319a1 naturellement présent étant codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR319a, lequel miR319a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana,
la somme de la quantité dudit AtmiPEP319a1 introduit et de celle dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent chez ladite plante Arabidopsis thaliana.
[0239] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l'ajout d'un engrais, d'un terreau, d'un substrat de culture ou d'un support inerte.
[0240] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par arrosage et par pulvérisation.
[0241] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par arrosage et par l'ajout d'un engrais.
[0242] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit par pulvérisation et par l'ajout d'un engrais.
[0243] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit, par arrosage, par pulvérisation et par l'ajout d'un engrais.
[0244] Les Inventeurs ont en effet constaté de manière inattendue qu'il est possible d'appliquer directement une composition comprenant un miPEP sur la plante pour moduler l'accumulation du miR correspondant dans la plante, ce qui indique que le miPEP est capté par la plante.
[0245] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la plante est traitée avec une composition comprenant 10
-9 M à 10
-4 M dudit miPEP, notamment 10
-9 M, 10
-8 M, 10
-7 M, 10
-6 M, 10
-5 M ou 10
-4 M dudit miPEP.
[0246] De préférence, les compositions ont une concentration de 10
-8 M à 10
-5 M pour une application par arrosage ou par pulvérisation sur la plante.
[0247] De manière complémentaire, des compositions plus ou moins concentrées peuvent être envisagées pour traiter la plante avec le miPEP. Par exemple, et de manière non limitative, des compositions plus concentrées comprenant 10
-1 M à 10
-3 M, notamment 10
-2 M de miPEP, peuvent être utilisées dans le cas où le miPEP introduit par voie exogène est administré à la plante par épandage.
[0248] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante.
[0249] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0250] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0251] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0252] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0253] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la vitesse de nodulation est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0254] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle le nombre de nodules est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. L'augmentation des paramètres permettant de déterminer et quantifier la croissance chez la plante dans laquelle a été introduit le miPEP (tels que la taille de la tige, le nombre et la taille des feuilles, le nombre et la longueur des racines, la vitesse de nodulation ou encore le nombre de nodules sur les racines) est de préférence mis en évidence par comparaison avec une plante identique (c'est-à-dire une plante de la même espèce et/ou variété), de même âge et cultivée dans les mêmes conditions mais dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour favoriser la croissance d'une plante, comprenant une étape d'introduction d'un miPEP dans une plante, ledit miPEP étant également présent naturellement dans ladite plante,
ledit miPEP introduit étant un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle dudit miPEP naturellement présent, laquelle séquence du miPEP naturellement présent est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs,
la somme de la quantité dudit miPEP introduit et de celle dudit miPEP naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit miPEP naturellement présent.
[0255] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
NAC1 (Accession n°AT1G56010.1),
NAC4 (Accession n° AT5G07680.1),
NAC5 (Accession n° AT5G61430.1),
CUC1 (Accession n° AT3G15170.1),
CUC2 (Accession n° AT5G53950.1),
TCP3 (Accession n°AT1G53230.1) et
TCP4 (Accession n°AT3G15030.1).
[0256] En particulier, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
NAC1, NAC4, NAC5, CUC1 et
CUC2.
[0257] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
TCP3 et
TCP4.
[0258] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miR est choisi parmi le miR164a, le miR319a, le miR171b, le miR165a, le miR160b, le miR169d et le miR171e.
[0259] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est choisi parmi le AtmiPEP164a1, le AtmiPEP319a1, le AtmiPEP319a2, le MtmiPEP171b1, le AtmiPEP165a1, le AtmiPEP160b1, le MtmiPEP169d, le MtmiPEP171e.
[0260] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR164a, en particulier, dans lequel ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 297.
[0261] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le AtmiPEP164a1, en particulier, dans lequel ledit AtmiPEP164a1possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 24. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR319a, en particulier, dans lequel ledit miR319a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 331.
[0262] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le AtmiPEP319a1, en particulier, dans lequel ledit AtmiPEP319a1 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 76.
[0263] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est une plante crucifère telle
qu'Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que
Glycine max (soja),
Medicago truncatula et
Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que
Nicotiana benthamiana (tabac),
Solanum tuberosum (pomme de terre),
Solanum lycopersicum (tomate) ou
Solanum melongena (aubergine). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est une plante crucifère.
[0264] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est
Arabidopsis thaliana.
[0265] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante
Arabidopsis thaliana, dans lequel le AtmiPEP164a1 est introduit dans ladite plante
Arabidopsis thaliana, ledit AtmiPEP164a1 étant également naturellement présent dans ladite plante
Arabidopsis thaliana,
ledit AtmiPEP164a1 introduit étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence identique à celle dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent, lequel le AtmiPEP164a1 naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a,
ledit AtmiPEP164a1 étant capable d'augmenter l'accumulation dudit miR164a, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana,
la somme de la quantité dudit AtmiPEP164a1 introduit et de celle dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit AtmiPEP164a1 naturellement présent.
[0266] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, pour favoriser la croissance d'une plante
Arabidopsis thaliana, dans lequel le AtmiPEP319a1 est introduit dans ladite plante
Arabidopsis thaliana, ledit AtmiPEP319a1 étant également naturellement présent dans ladite plante
Arabidopsis thaliana,
ledit AtmiPEP319a1 introduit étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence identique à celle dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent, lequel le AtmiPEP319a1 naturellement présent est un peptide de 4 à 100 acides aminés dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR319a,
ledit AtmiPEP319a1 étant capable d'augmenter l'accumulation dudit miR319a, lequel miR319a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana,
la somme de la quantité dudit AtmiPEP319a1 introduit et de celle dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent étant strictement supérieure à la quantité dudit AtmiPEP319a1 naturellement présent.
[0267] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit par voie externe dans la plante, de préférence par arrosage, par pulvérisation ou par l'ajout d'un engrais, d'un terreau, d'un substrat de culture ou d'un support inerte.
[0268] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est administré à la plante sous la forme d'une composition comprenant 10
-9 M à 10
-4 M dudit miPEP, en particulier 10
-9, 10
-8, 10
-7, 10
-6, 10
-5 ou 10
-4 M dudit miPEP. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante.
[0269] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0270] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0271] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0272] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0273] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle la vitesse de nodulation est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de nodules est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0274] Dans un autre aspect, l'invention concerne une plante dans laquelle a été introduit un miPEP selon l'utilisation ou le procédé pour favoriser la croissance d'une plante décrits ci-dessus. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique comprenant :
- a) une étape d'introduction d'un acide nucléique codant un miPEP de 4 à 100 acides aminés dans une plante, ou dans au moins une cellule de ladite plante, dans des conditions permettant l'expression dudit miPEP,
ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et - b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante transgénique.
[0275] Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique comprenant :
- a) une étape d'introduction d'un acide nucléique codant un miPEP de 4 à 100 acides aminés, ou de 3 acides aminés, dans une plante, ou dans au moins une cellule de ladite plante, dans des conditions permettant l'expression dudit miPEP,
ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et - b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante transgénique.
[0276] Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique comprenant :
- a) une étape d'introduction d'un acide nucléique codant un miPEP de 3 acides aminés, dans une plante, ou dans au moins une cellule de ladite plante, dans des conditions permettant l'expression dudit miPEP,
ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et - b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante transgénique.
[0277] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique obtenue à l'étape b) a une croissance améliorée par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit.
[0278] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel l'expression dudit miPEP codé par l'acide nucléique introduit dans la plante entraîne une croissance améliorée par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit.
[0279] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel l'étape a) est réalisée à l'aide d'un vecteur contenant ledit acide nucléique, de préférence un plasmide.
[0280] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel l'expression dudit acide nucléique de l'étape a) est placée sous le contrôle d'un promoteur fort, de préférence un promoteur fort constitutif tel que le promoteur 35S.
[0281] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit gène, impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, est choisi parmi le groupe consistant en :
NAC1 (Accession n°AT1G56010.1),
NAC4 (Accession n° AT5G07680.1),
NAC5 (Accession n° AT5G61430.1),
CUC1 (Accession n° AT3G15170.1),
CUC2 (Accession n° AT5G53950.1),
TCP3 (Accession n°AT1G53230.1) et
TCP4 (Accession n°AT3G15030.1). Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEPpossède une séquence d'acides aminés comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi le groupe constitué de SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101 et SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386.
[0282] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEPpossède une séquence d'acides aminés comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi le groupe constitué de :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0283] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR164a, en particulier, dans lequel ledit miR164a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 297.
[0284] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le AtmiPEP164a1, en particulier, dans lequel ledit AtmiPEP164a1 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 24.
[0285] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miARN est le miR319a, en particulier, dans lequel ledit miR319a possède une séquence nucléotidique consistant en SEQ ID NO : 331.
[0286] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est le AtmiPEP319a1, en particulier, dans lequel ledit AtmiPEP319a1 possède une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO : 76.
[0287] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit acide nucléique introduit à l'étape a) comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID NO : 128 et SEQ ID NO : 180. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante est une plante crucifère telle qu'
Arabidopsis thaliana, une plante légumineuse telle que
Glycine max (soja),
Medicago truncatula et
Medicago sativa (luzerne) ou une plante solanacée telle que
Nicotiana benthamiana (tabac),
Solanum tuberosum (pomme de terre),
Solanum lycopersicum (tomate) ou
Solanum melongena (aubergine).
[0288] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique est une plante crucifère.
[0289] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans lequel ladite plante transgénique est
Arabidopsis thaliana.
[0290] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, comprenant :
- a) une étape d'introduction d'un acide nucléique contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 128, codant le AtmiPEP164a1 consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 24, dans une plante Arabidopsis thaliana, ou dans au moins une cellule de ladite plante Arabidopsis thaliana, dans des conditions permettant l'expression du AtmiPEP164a1,
ledit AtmiPEP164a1 étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR164a, ledit AtmiPEP164a1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR164, lequel miR164a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana, et - b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante Arabidopsis thaliana transgénique.
[0291] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, comprenant :
- a) une étape d'introduction d'un acide nucléique contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 180, codant le AtmiPEP319a1 consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 76, dans une plante Arabidopsis thaliana, ou dans au moins une cellule de ladite plante Arabidopsis thaliana, dans des conditions permettant l'expression du AtmiPEP319a1,
ledit AtmiPEP319a1 étant également naturellement présent dans ladite plante Arabidopsis thaliana, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire du miR319a, ledit AtmiPEP319a1 étant capable de moduler l'accumulation dudit miR319, lequel miR319a régule l'expression d'au moins un gène impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices d'Arabidopsis thaliana, et - b) une étape de culture de la plante, ou d'au moins une cellule de ladite plante, obtenues à l'étape a) dans des conditions permettant l'obtention d'une plante Arabidopsis thaliana transgénique.
[0292] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit miPEP est introduit dans la plante par le biais d'un acide nucléique codant ledit miPEP, ledit acide nucléique étant introduit dans la plante.
[0293] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille de la tige est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille de la tige d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0294] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de feuilles est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0295] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la taille des feuilles est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la taille des feuilles d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0296] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de racines est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0297] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la longueur des racines est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport à la longueur des racines d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0298] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle la vitesse de nodulation est augmentée chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a pas été introduit, ou bien par rapport à la vitesse de nodulation d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0299] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de production d'une plante transgénique tel que défini ci-dessus, dans laquelle le nombre de nodules est augmenté chez la plante dans laquelle a été introduit ledit miPEP par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle aucun miPEP n'a été introduit, ou bien par rapport au nombre de nodules d'une plante identique et de même âge dans laquelle ledit miPEP n'a pas été introduit.
[0300] Dans un aspect, l'invention concerne également une plante transgénique telle qu'obtenue par le procédé de production tel que défini ci-dessus.
[0301] Dans un autre aspect, l'invention concerne une plante transgénique contenant un vecteur codant un miPEP, ledit miPEP étant également naturellement présent dans ladite plante, ledit miPEP naturellement présent étant un peptide dont la séquence est codée par un cadre ouvert de lecture situé en 5' sur le transcrit primaire d'un miR, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans la plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène,
l'expression dudit miPEP codé par le vecteur introduit dans la plante entraînant une modulation de l'expression dudit gène par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit.
[0302] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit gène est impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et l'expression dudit miPEP codé par l'acide nucléique introduit dans la plante entraîne une croissance améliorée de la plante transgénique par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit.
[0303] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0304] Dans un autre aspect, l'invention concerne une plante transgénique comprenant un vecteur, ledit vecteur contenant un acide nucléique permettant l'expression d'un transcrit primaire de miR,
ledit transcrit primaire de miR contenant un cadre ouvert de lecture codant un miPEP, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit miR dans ladite plante, lequel miR régule l'expression d'au moins un gène dans ladite plante,
l'expression dudit miPEP codé par le vecteur introduit dans la plante entraînant une modulation de l'expression dudit gène par rapport à une plante identique dans laquelle ledit vecteur n'a pas été introduit.
[0305] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est d'origine endogène.
[0306] Si ledit acide nucléique est d'origine endogène, au moins une copie dudit acide nucléique est déjà présente naturellement dans la plante, indépendamment du vecteur introduit dans la plante.
[0307] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit acide nucléique est d'origine exogène.
[0308] Si ledit acide nucléique est d'origine exogène, aucune copie dudit acide nucléique n'est présente naturellement dans la plante.
[0309] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit gène est impliqué dans le développement des parties végétatives ou reproductrices de la plante, notamment les racines, la tige, les feuilles ou les fleurs, et l'expression dudit miPEP codé par l'acide nucléique introduit dans la plante entraîne une croissance améliorée de la plante transgénique par rapport à une plante identique dans laquelle ledit acide nucléique n'a pas été introduit.
[0310] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante transgénique telle que définie ci-dessus dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0311] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle d'un miPEP naturellement présent chez ladite plante.
[0312] Dans un mode de ralisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus, dans laquelle ledit miPEP est choisi parmi le groupe consistant en :
- SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 101,
- SEQ ID NO : 375 à SEQ ID NO : 386, ou
- SEQ ID NO : 424.
[0313] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante, notamment
A. thaliana, et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle du AtmiPEP164a1.
[0314] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante, notamment
A. thaliana, et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle du AtmiPEP319a1.
[0315] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant en combinaison une quantité de semences d'une plante, notamment
M. truncatula, et une quantité d'un peptide dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle du MtmiPEP171b.
[0316] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former une semence enrobée.
[0317] L'enrobage peut être réalisé selon les procédés classiquement utilisées dans l'industrie agroalimentaire et peut être obtenu en utilisant un matériau apte à se désagréger dans un solvant ou dans la terre, tel qu'un liant ou de l'argile.
[0318] Selon l'invention, l'enrobage peut être utilisé pour par exemple conférer des propriétés particulières à une composition de miPEP, ou encore à une composition de semences en combinaison avec un miPEP.
[0319] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former une semence enrobée comprenant le MtmiPEP171b. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former une semence enrobée comprenant le AtmiPEP164a1. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition telle que définie ci-dessus formulée de façon à former une semence enrobée comprenant le AtmiPEP319a1. Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique,
et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0320] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
pour son utilisation en tant que médicament, notamment pour l'Homme ou pour les animaux.
[0321] L'utilisation des compositions de l'invention est applicable en médecine humaine et en médecine vétérinaire.
[0322] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie impliquant la dérégulation de l'expression d'un gène du patient,
l'expression dudit gène étant régulée par un microARN dont l'accumulation est modulée par ledit miPEP.
[0323] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite pathologie est choisie parmi le cancer, le diabète, l'obésité, les maldies infectieuses et les maladies neurodégénératives.
[0324] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite pathologie est choisie parmi : le cancer, le diabète, l'obésité, les maladies infectieuses, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires et les maladies autoimmunes.
[0325] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite pathologie est choisie parmi : le cancer, le diabète, l'obésité, les maladies infectieuses et les maladies neurodégénératives, ou choisie parmi les maladies cardiovasculaires et les maladies autoimmunes.
[0326] Dans un mode de réalisation, l'invention concerne la composition telle que définie ci-dessus dans laquelle ladite pathologie est choisie parmi les maladies cardiovasculaires et les maladies autoimmunes.
[0327] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins :
- un miPEP tel que défini ci-dessus,
- un acide nucléique codant ledit miPEP, ou
- un vecteur contenant ledit acide nucléique.
pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une infection d'un animal ou d'un humain par un organisme parasitaire,
ledit organisme parasitaire possédant un gène dont l'expression est régulée par un microARN dont l'accumulation est modulée par ledit miPEP.
[0328] Dans un autre aspect, l'invention concerne un miPEP de 4 à 100 acides aminés, ou de 3 acides aminés, codé par une séquence nucléotidique contenue dans le transcrit primaire d'un microARN, ledit miPEP étant capable de moduler l'accumulation dudit microARN dans une cellule eucaryote, pour son utilisation comme médicament.
[0329] Dans un autre aspect, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP.
[0330] En particulier, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP165a.
[0331] En particulier, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement le MtmiPEP171b.
[0332] En particulier, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP164a1.
[0333] En particulier, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP319a1.
[0334] Un tel anticorps peut être obtenu à partir d'un procédé connu de l'homme du métier, comme par exemple en injectant ledit miPEP à un animal non humain pour déclencher une réaction d'immunisation et la production d'anticorps par ledit animal.
[0335] Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation d'un miPEP comprenant une étape de marquage d'un échantillon biologique d'une plante avec un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP.
[0336] En particulier, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation du AtmiPEP165a à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP165a.
[0337] En particulier, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation du MtmiPEP171b à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement le MtmiPEP171b.
[0338] En particulier, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation du AtmiPEP164a1 à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP164a1.
[0339] En particulier, l'invention concerne un procédé d'immunolocalisation du MtmiPEP319a1 à l'aide d'un anticorps reconnaissant spécifiquement le AtmiPEP319a1.
[0340] Dans un autre aspect, l'invention concerne un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP selon l'invention, pour son utilisation comme médicament.
[0341] Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps reconnaissant spécifiquement un miPEP selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0342] Dans un autre aspect, l'invention concerne un protocole de production d'un peptide recombinant, dont la séquence comprend ou consiste en une séquence identique à celle d'un miPEP tel que défini ci-dessus, comprenant une étape de transformation d'un organisme avec un vecteur d'expression codant ledit peptide recombinant.
[0343] Dans un mode de réalisation, ledit organisme est choisi parmi le groupe comprenant les bactéries, les levures, les champignons (autre que levures), les cellules animales, les plantes et les animaux.
[0344] Dans un mode de réalisation, ledit organisme est
Escherichia coli.
[0345] En particulier, l'invention concerne un protocole de production d'un peptide recombinant tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- l'acide nucléique codant ledit peptide recombinant est lié à un acide nucléique codant une étiquette, telle que la GST,
- le vecteur d'expression contenant ledit acide nucléique codant ledit peptide recombinant est introduit dans la bactérie E. coli,
- la bactérie E. coli contenant le vecteur d'expression est cultivée dans du milieu LB de préférence jusqu'à une DO comprise entre 0.2 et 0.4,
- la production du peptide recombinant est induite avec de l'IPTG, de préférence pendant 4 à 5 heures,
- les bactéries E. coli sont centrifugées et lysées,
- le surnageant est filtré,
- ledit peptide recombinant est purifié sur une colonne d'affinité glutathion sepharose,
- si nécessaire, cliver la GST avec une protéase.
[0346] L'ensemble des séquences des miPEPs, des miORFs, des miRs et des transcrits primaires de miRs est indiqué dans les tables 1, 2, 3, 4, 5 et 6.
[0347] La table 7 présente une analyse du polymorphisme de la séquence d'ADN des différentes régions du pri-miR171b (un haplotype est défini lorsqu'il diffère d'au moins un acide aminé des autres haplotypes).
Table 1. Liste des miPEPs (miPEPs) potentiels
miPEP (pI / taille MW) | miR | Organisme | Gènes cibles du miR | Séquence du miPEP | SEQ ID |
AtmiPEP156a1 (10,57/3824) |
miR156a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène SPL, impliqué dans le développement de la tige et la floraison |
|
SEQ ID NO : 1 |
AtmiPEP156a2 |
miR156a |
Arabidopsis thaliana |
MRRQTSVPFACKRDKESDKSHKER |
SEQ ID NO :2 |
AtmiPEP156a3 |
miR156a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :3 |
AtmiPEP156c1 (8,5 / 1359) |
miR156c |
Arabidopsis thaliana |
MKDNFPLLLRL |
SEQ ID NO :4 |
AtmiPEP156c2 |
miR156c |
Arabidopsis thaliana |
MSDD |
SEQ ID NO :5 |
AtmiPEP156e1 (4.03 / 1818) |
miR156e |
Arabidopsis thaliana |
MIYINKYGSISA VEDD |
SEQ ID NO :6 |
AtmiPEP156f1 (9,5 / 520) |
miR156f |
Arabidopsis thaliana |
MSQR |
SEQ ID NO :7 |
AlmiPEP159a |
miR159a |
Arabidopsis lyrata |
Famille du gène MYB, impliqué dans la germination et la floraison |
MTCPLLSLSFLLSKYI |
SEQ ID NO: 8 |
AtmiPEP159a1 (8,34/ 1898) |
miR159a |
Arabidopsis thaliana |
MTWPLLSLSFLLSKYV |
SEQ ID NO :9 |
CrmiPEP159a |
miR159a |
Capsella rubella |
MTCTLSALSLSLNMFRVN |
SEQ ID NO: 10 |
AtmiPEP159b1 (5,27 / 659) |
miR159b |
Arabidopsis thaliana |
MFYLS |
SEQ ID NO : 11 |
AtmiPEP159b2 |
miR159b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 12 |
AtmiPEP 160a1 (8,02 / 2936) |
miR160a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène ARF, impliqué dans la germination, le développement et la floraison |
MFCLLIPIFSFVFSPNRHLRLQEQ |
SEQ ID NO :13 |
AtmiPEP 160b 1 (5,28 / 608) |
miR160b |
Arabidopsis thaliana |
MFSPQ |
SEQ ID NO : 14 |
AtmiPEP160b2 |
miR160b |
Arabidopsis thaliana |
MKYIHILILFKSRSTYKLSTNHI |
SEQ ID NO : 15 |
AtmiPEP 161 (10/1199) |
miR161 |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène PPR |
MKIPLFLPKL |
SEQ ID NO : 16 |
AtmiPEP162a1 (4,03 / 3045) |
miR162a |
Arabidopsis thaliana |
Gène DCL1, impliqué dans le développement |
MVSGQEDSWLKLSSLCFLFLSLLDSLI |
SEQ ID NO : 17 |
AtmiPEP 162b1 (5,71 / 4114) |
miR162b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 18 |
AtmiPEP 163-1 (6,5 / 1076) |
miR163 |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène SAMT, impliqué dans la production de métabolites secondaires |
MSTTQEHRS |
SEQ ID NO : 19 |
AtmiPEP163-2 |
miR163 |
Arabidopsis thaliana |
MILKCWSSRFLRVSPYQNAHSLSLG |
SEQ ID NO :20 |
AlmiPEP164a1 |
miR164a |
Arabidopsis lyrata |
|
MPLAVIRQGIVWP |
SEQ ID NO :21 |
AlmiPEP164a2 |
miR164a |
Arabidopsis lyrata |
|
MPSWHDMVLLPYVKHTHANTRHIT |
SEQ ID NO :22 |
AlmiPEP 164a3 |
miR164a |
Arabidopsis lyrata |
|
MTWFFCLT |
SEQ ID NO :23 |
AtmiPEP 164a1 (7,05 / 4256) |
miR164a |
Arabidopsis thaliana |
|
|
SEQ ID NO :24 |
AtmiPEP 164a2 |
miR164a |
Arabidopsis thaliana |
|
MAWYGSFALRKTHSRQHTHTHT |
SEQ ID NO :25 |
AtmiPEP 164a3 |
miR164a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène NAC, impliqué dans le développement racinaire, foliaire et floral |
MVWFFCLT |
SEQ ID NO :26 |
BrmiPEP164a1 |
miR164a |
Brassica rapa |
|
MMIILWK |
SEQ ID NO :27 |
BrmiPEP164a2 |
miR164a |
Brassica rapa |
|
MLWAKLVSFSTLHSLVFLLSPSFA |
SEQ ID NO :28 |
BrmiPEP164a3 |
miR164a |
Brassica rapa |
|
|
SEQ ID NO :29 |
CpmiPEP164a1 |
miR164a |
Carica papaya |
|
|
SEQ ID NO :30 |
CpmiPEP 164a2 |
miR164a |
Carica papaya |
|
|
SEQ ID NO :31 |
CrmiPEP164a1 |
miR164a |
Capsella rubella |
|
MELKGLRTWQLLDKV |
SEQ ID NO :32 |
CrmiPEP164a2 |
miR164a |
Capsella rubella |
|
MPSWHGMACFYCLT |
SEQ ID NO :33 |
CrmiPEP164a3 |
miR164a |
Capsella rubella |
|
MAWHGMFLLPYVKHTHANTY SLYM |
SEQ ID NO :34 |
GrmiPEP164a1 |
miR164a |
Gossypium raimondii |
|
|
SEQ ID NO :35 |
GrmiPEP164a2 |
miR164a |
Gossypium raimondii |
|
MSNSRSYQLK |
SEQ ID NO :36 |
GrmiPEP164a3 |
miR164a |
Gossypium raimondii |
|
MNEDLEISTRKRTPQLC |
SEQ ID NO :37 |
MtmiPEP 164a1 |
miR164a |
Medicago truncatula |
|
MPKFDIFFYIFV |
SEQ ID NO :38 |
MtmiPEP 164a2 |
miR164a |
Medicago truncatula |
|
|
SEQ ID NO :39 |
OsmiPEP 164a1 |
miR164a |
Oryza sativa |
|
MQTHSNTPQSTYSLSLSLSE |
SEQ ID NO :40 |
OsmiPEP 164a2 |
miR164a |
Oryza sativa |
|
MCV CDINMHSMLMLL |
SEQ ID NO :41 |
AlmiPEP165a |
miR165a |
Arabidopsis lyrata |
Famille du gène HD-ZIPIII, impliqué dans développement vasculaire, racinaire, foliaire, floral, nodulation |
MRIKLFQLRGMLSGSRILYIYTCVC |
SEQ ID NO :42 |
AtmiPEP 165a (12,3 / 2105) |
miR165a |
Arabidopsis thaliana |
MRVKLFQLRGMLSGSRIL |
SEQ ID NO :43 |
BcmiPEP165a |
miR165a |
Brassica carinata |
|
SEQ ID NO :44 |
BjmiPEP165a |
miR165a |
Brassica juncea |
|
SEQ ID NO :45 |
BnmiPEP165a |
miR165a |
Brassica napus |
|
SEQ ID NO :46 |
BomiPEP165a |
miR165a |
Brassica oleracea |
|
SEQ ID NO :47 |
BrmiPEP165a |
miR165a |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO :48 |
AtmiPEP 166a (4, 68 / 2372) |
miR166a |
Arabidopsis thaliana |
MLDLFRSNNRIEPSDFRFD |
SEQ ID NO :49 |
AtmiPEP 166b (9,35 / 576) |
miR166b |
Arabidopsis thaliana |
MRDR |
SEQ ID NO :50 |
AtmiPEP167a (11 / 1148) |
miR167a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène ARF, impliqué dans le développement racinaire et floral |
MNRKISLSLS |
SEQ ID NO :51 |
AtmiPEP167b1 (5,27/891) |
miR167b |
Arabidopsis thaliana |
MMGCFVGF |
SEQ ID NO :52 |
AtmiPEP167b2 |
miR167b |
Arabidopsis thaliana |
|
MQEETYEG |
SEQ ID NO :53 |
AtmiPEP 169c1 (9,3 / 7110) |
miR169c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène du facteur CCAAT-bing, impliqué dans la nodulation, la résistance à la sécheresse, la résistance à la carence azotée |
|
SEQ ID NO :54 |
AtmiPEP 169c2 |
miR169c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :55 |
AtmiPEP 1691 (8,52/ 786) |
miR1691 |
Arabidopsis thaliana |
MRHKES |
SEQ ID NO :56 |
AtmiPEP171a1 (11,05/4057) |
miR171a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène GRAS, impliqué dans le développement floral, foliaire, racinaire, la mycorhization, la nodulation |
|
SEQ ID NO :57 |
AtmiPEP 171b (8,5 / 995) |
miR171b |
Arabidopsis thaliana |
MVLSGKLTF |
SEQ ID NO :58 |
MtmiPEP171b1 |
miR171b |
Medicago truncatula |
MLLHRLSKFCKIERDIVYIS |
SEQ ID NO :59 |
MtmiPEP171b2 |
miR171b |
Medicago truncatula |
MKIEE |
SEQ ID NO :60 |
ZmmiPEP171b |
miR171b |
Zea mays |
|
SEQ ID NO :61 |
AtmiPEP 171c1 (6,68 / 1187) |
miR171c |
Arabidopsis thaliana |
MLSLSHFHIC |
SEQ ID NO :62 |
MtmiPEP171e |
miR171e |
Medicago truncatula |
MMVFGKPKKAMLVRFNPKTDLHV |
SEQ ID NO :63 |
MtmiPEP171h |
miR171h |
Medicago truncatula |
MASAAKVYMA |
SEQ ID NO :64 |
AtmiPEP 172a1 (8,5 / 734) |
miR172a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène AP2, impliqué dans le développement floral |
MASKIW |
SEQ ID NO :65 |
AtmiPEP 172a3 |
miR172a |
Arabidopsis thaliana |
MVRFQLSIRD |
SEQ ID NO :66 |
AtmiPEP 172b 1 (7,9/1621) |
miR172b |
Arabidopsis thaliana |
MCTYYYLINKYF |
SEQ ID NO :67 |
AtmiPEP 172c1 (7,98 / 1367) |
miR172c |
Arabidopsis thaliana |
MFPAKWCRLES |
SEQ ID NO :68 |
AtmiPEP 172e1 (8,35 / 2452) |
miR172e |
Arabidopsis thaliana |
MGSLSLFKSQLEILMLLLSLSK |
SEQ ID NO :69 |
AtmiPEP 172e2 |
miR172e |
Arabidopsis thaliana |
|
MSVYIHVPISLNCFSPKSSC |
SEQ ID NO :70 |
AtmiPEP 172e3 |
miR172e |
Arabidopsis thaliana |
MGVPNFRPRNR |
SEQ ID NO :71 |
AcmiPEP319a1 |
miR319a |
Arabidopsis cebennensis |
|
MRSRVSFFFFKIMLFRLLGYRSM |
SEQ ID NO :72 |
AcmiPEP319a2 |
miR319a |
Arabidopsis cebennensis |
|
|
SEQ ID NO :73 |
AhmiPEP319a |
miR319a |
Arabidopsis halleri |
|
MRSRVSLFLSFSSNFAAYSPRS |
SEQ ID NO :74 |
AlmiPEP319a |
miR319a |
Arabidospis lyrata |
|
|
SEQ ID NO :75 |
AtmiPEP319a1 (6,56/5917) |
miR319a |
Arabidopsis thaliana |
|
|
SEQ ID NO :76 |
AtmiPEP319a2 |
miR319a |
Arabidopsis thaliana |
|
MFQTLYLFIYIHTNILLLS |
SEQ ID NO :77 |
BrmiPEP319a |
miR319a |
Brassica rapa |
|
|
SEQ ID NO :78 |
CpmiPEP319a |
miR319a |
Carica papaya |
Famille du gène TCP, impliqué dans le développement floral et foliaire |
MKIKLGFSLIKIIILLDKNS |
SEQ ID NO :79 |
CrmiPEP319a |
miR319a |
Capsella rubella |
|
MHPHTYIHIPSSSFLISSFCL |
SEQ ID NO :80 |
EgmiPEP319a |
miR319a |
Eucalyptus grandis |
|
|
SEQ ID NO : 81 |
GrmiPEP319a |
miR319a |
Gossypium raimondii |
|
|
SEQ ID NO : 82 |
MtmiPEP319a |
miR319a |
Medicago truncatula |
|
MHVYLELFMVIKGLGFLLLVK |
SEQ ID NO : 83 |
OsmiPEP319a |
miR319a |
Oryza sativa |
|
MEMIQRPCLILKFFFKLSTLYIP |
SEQ ID NO : 84 |
PpmiPEP319a |
miR319a |
Physcomitrella patens |
|
|
SEQ ID NO :85 |
ThmiPEP319a1 |
miR319a |
Thellungiella halophila |
|
|
SEQ ID NO :86 |
ThmiPEP319a2 |
miR319a |
Thellungiella halophila |
|
|
SEQ ID NO :87 |
AtmiPEP319b1 (8,04/5120) |
miR319b |
Arabidopsis thaliana |
|
|
SEQ ID NO :88 |
AtmiPEP394al (9,7 / 1977) |
miR394a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène F-box, impliqué dans le développement foliaire et résistance à la sécheresse |
MSLQFYERVSFKNTVK |
SEQ ID NO :89 |
AtmiPEP395c1 (3,58 / 1429) |
miR395c |
Arabidopsis thaliana |
Famille des gènes APS et AST, impliqués dans la germination et le métabolisme du soufre |
MTEQEEESQMST |
SEQ ID NO :90 |
AtmiPEP395e1 (9,98 / 4700) |
miR395e |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :91 |
AtmiPEP397b1 (4,53 / 1418) |
miR397b |
Arabidopsis thaliana |
Famille des gènes de laccases, impliqués dans le métabolisme du cuivre, leur surexpression améliore la croissance |
MSKEIFFSPGFE |
SEQ ID NO :92 |
AtmiPEP398c1 |
miR398c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène CSD, impliqué dans le métabolisme du cuivre, sa surexpression améliore la croissance |
|
SEQ ID NO :93 |
AtmiPEP399b (11 / 678) |
miR399b |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène PHO2, impliqué dans le métabolisme du phosphore |
MKRNM |
SEQ ID NO :94 |
AtmiPEP399d1 (4 / 622) |
miR399d |
Arabidopsis thaliana |
MQCEI |
SEQ ID NO :95 |
AtmiPEP403 (5,27470) |
miR403 |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène AGO |
MFCA |
SEQ ID NO :96 |
AtmiPEP447a1 (6,69 / 724) |
miR447a |
Arabidopsis thaliana |
Famille des gènes de phosphoglycérate kinase |
MVMAHH |
SEQ ID NO :97 |
AtmiPEP447a2 |
miR447a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :98 |
AtmiPEP447b 1 (4 / 1155) |
miR447b |
Arabidopsis thaliana |
MLLIIVELVL |
SEQ ID NO :99 |
AtmiPEP447b2 |
miR447b |
Arabidopsis thaliana |
|
MLCFNFRCVRRFAE |
SEQ ID NO : 100 |
AtmiPEP447c |
miR447c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :101 |
DmmiPEPla |
miR1 |
Drosophila melanogaster |
Differenciation musculaire |
|
SEQ ID NO : 102 |
DmmiPEP1b |
miR1 |
Drosophila melanogaster |
Differenciation musculaire |
|
SEQ ID NO :103 |
DmmiPEP8 |
miR8 |
Drosophila melanogaster |
Croissance |
|
SEQ ID NO : 104 |
HsmiPEP155 |
miR155 |
Homo sapiens |
inflammation |
MEMALMVAQTRKGKSVV |
SEQ ID NO :355 |
AtmiPEP157c (5,95 / 1776) |
miR157c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène SPL, impliqué dans le développement de la tige et la floraison |
MMLHITHRFESDVGC |
SEQ ID NO : 375 |
AtmiPEP157d (5,27 / 524) |
miR157d |
Arabidopsis thaliana |
MLYV |
SEQ ID NO : 376 |
AtmiPEP 160c (9,98 / 1790) |
miR160c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène ARF, impliqué dans la germination, le développement et la floraison |
MFMRRGLVYNNIYI |
SEQ ID NO : 377 |
AtmiPEP 164b (4,72 / 1949) |
miR164b |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène NAC, impliqué dans le développement racinaire, foliaire et floral |
MMKVCDEQDGEAGHVHY |
SEQ ID NO : 378 |
AtmiPEP 166c (10,42 / 3407) |
miR166c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène HD-ZIPIII, impliqué dans développement vasculaire, racinaire, foliaire, floral, nodulation |
|
SEQ ID NO : 379 |
AtmiPEP 166d (8,35 / 1125) |
miR166d |
Arabidopsis thaliana |
MKKIGSIDSF |
SEQ ID NO : 380 |
AtmiPEP 169a (9,5 / 784) |
miR169a |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène du facteur CCAAT-bing, impliqué dans la nodulation, la résistance à la sécheresse, la résistance à la carence azotée |
MTCRFK |
SEQ ID NO : 381 |
AtmiPEP169h1 (5,28 / 349) |
miR169h |
Arabidopsis thaliana |
MVT |
|
AtmiPEP 169h2 |
miR169h |
Arabidopsis thaliana |
MKNENLCGSQG |
SEQ ID NO : 382 |
AtmiPEP 169n (8,96 / 5315) |
miR169n |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 383 |
AtmiPEP 170 (5,75 / 879) |
miR170 |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène GRAS, impliqué dans le développement floral, foliaire, racinaire, la mycorhization, la nodulation |
MFPRESL |
SEQ ID NO : 384 |
AtmiPEP396a (5,3 / 3636) |
miR396a |
Arabidopsis thaliana |
Famille des genes GRF impliqués dans le développement racinaire et la prolifération cellulaire, la mycorhization |
|
SEQ ID NO : 385 |
AtmiPEP399c (8,66/2703) |
miR399c |
Arabidopsis thaliana |
Famille du gène PHO2, impliqué dans le métabolisme du phosphore |
MSLAKGELPCHCFRLNTVYNRFC |
SEQ ID NO : 386 |
MtmiPEP169d |
miR169d |
Medicago tuncatula |
Famille des gènes NF-YA (ou HAP2) |
MVKESFMERLKVR |
SEQ ID NO : 424 |
Table 2. Liste des miORFs
miPEP | Organisme | Séquence du miORF | SEQ ID |
AtmiPEP156a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 105 |
AtmiPEP156a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 106 |
AtmiPEP156a3 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 107 |
AtmiPEP156c1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAAGGACAACTTTCCTCTTCTCCTTCGGTTATAA |
SEQ ID NO : 108 |
AtmiPEP156c2 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAGTGATGACTGA |
SEQ ID NO : 109 |
AtmiPEP156e1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :110 |
AtmiPEP156f1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAGCCAAAGATAA |
SEQ ID NO : 111 |
AlmiPEP159a |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO : 112 |
AtmiPEP159a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 113 |
CrmiPEP159a |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO : 114 |
AtmiPEP159b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTTTATCTTTCATAA |
SEQ ID NO : 115 |
AtmiPEP159b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 116 |
AtmiPEP 160a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 117 |
AtmiPEP160b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTTTCCCCTCAATGA |
SEQ ID NO : 118 |
AtmiPEP 160b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 119 |
AtmiPEP 161 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAAAATTCCATTGTTTCTGCCGAAGCTTTGA |
SEQ ID NO : 120 |
AtmiPEP162a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 121 |
AtmiPEP162b1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 122 |
AtmiPEP 163-1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTCCACTACTCAAGAGCATAGGTCTTGA |
SEQ ID NO : 123 |
AtmiPEP163-2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 124 |
AlmiPEP164a1 |
Arabidopsis lyrata |
ATGCCCTTAGCAGTTATTAGACAAGGGATTGTTTGGCCCTAG |
SEQ ID NO : 125 |
AlmiPEP164a2 |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO : 126 |
AlmiPEP 164a3 |
Arabidopsis lyrata |
ATGACATGGTTCTTTTGCCTTACGTAA |
SEQ ID NO :127 |
AtmiPEP 164a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 128 |
AtmiPEP 164a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 129 |
AtmiPEP 164a3 |
Arabidopsis thaliana |
ATGGTATGGTTCTTTTGCCTTACGTAA |
SEQ ID NO : 130 |
BrmiPEP164a1 |
Brassica rapa |
ATGATGATAATTTTGTGGAAATAA |
SEQ ID NO :131 |
BrmiPEP164a2 |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO : 132 |
BrmiPEP164a3 |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO : 133 |
CpmiPEP164a1 |
Carica papaya |
|
SEQ ID NO : 134 |
CpmiPEP 164a2 |
Carica papaya |
|
SEQ ID NO : 135 |
CrmiPEP164a1 |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO : 136 |
CrmiPEP164a2 |
Capsella rubella |
ATGCCATCATGGCATGGCATGGCATGTTTCTATTGCCTTACGTAA |
SEQ ID NO : 137 |
CrmiPEP164a3 |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO : 138 |
GrmiPEP164a1 |
Gossypium raimondii |
|
SEQ ID NO :139 |
GrmiPEP164a2 |
Gossypium raimondii |
ATGTCAAATTCAAGGTCGTATCAGTTAAAATGA |
SEQ ID NO : 140 |
GrmiPEP164a3 |
Gossypium raimondii |
|
SEQ ID NO : 141 |
MtmiPEP 164a1 |
Medicago truncatula |
ATGCCCAAATTTGATATTTTTTTTTATATATTTGTATAG |
SEQ ID NO :142 |
MtmiPEP 164a2 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO : 143 |
OsmiPEP 164a1 |
Oryza sativa |
|
SEQ ID NO : 144 |
OsmiPEP 164a2 |
Oryza sativa |
|
SEQ ID NO :145 |
AlmiPEP165a |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO : 146 |
AtmiPEP 165a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 147 |
BcmiPEP165a |
Brassica carinata |
|
SEQ ID NO :148 |
BjmiPEP165a |
Brassica juncea |
|
SEQ ID NO : 149 |
BnmiPEP165a |
Brassica napus |
|
SEQ ID NO : 150 |
BomiPEP165a |
Brassica oleracea |
|
SEQ ID NO : 151 |
BrmiPEP165a |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO : 152 |
AtmiPEP 166a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 153 |
AtmiPEP 166b |
Arabidopsis thaliana |
ATGAGAGATAGATAA |
SEQ ID NO : 154 |
AtmiPEP167a |
Arabidopsis thaliana |
ATGAACAGAAAAATCTCTCTTTCTCTTTCTTGA |
SEQ ID NO : 155 |
AtmiPEP167b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGATGGGTTGTTTTGTGGGATTTTAA |
SEQ ID NO :156 |
AtmiPEP167b2 |
Arabidopsis thaliana |
ATGCAGGAGGAAACATATGAGGGGTGA |
SEQ ID NO : 157 |
AtmiPEP169c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 158 |
AtmiPEP 169c2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 159 |
AtmiPEP 16911 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAGACATAAAGAGAGTTAA |
SEQ ID NO : 160 |
AtmiPEP171a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 161 |
AtmiPEP 171b |
Arabidopsis thaliana |
ATGGTTCTCTCCGGTAAATTAACATTTTAG |
SEQ ID NO : 162 |
MtmiPEP171b1 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO : 163 |
MtmiPEP171b2 |
Medicago truncatula |
ATGAAGATTGAAGAGTAA |
SEQ ID NO : 164 |
ZmmiPEP171b |
Zea mays |
|
SEQ ID NO :165 |
AtmiPEP171c1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTGTCTCTTTCTCATTTTCATATCTGCTAA |
SEQ ID NO : 166 |
MtmiPEP171e |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO : 167 |
MtmiPEP171h |
Medicago truncatula |
ATGGCTTCAGCTGCAAAAGTATACATGGCGTGA |
SEQ ID NO : 168 |
AtmiPEP172al |
Arabidopsis thaliana |
ATGGCTTCCAAGATCTGGTAA |
SEQ ID NO : 169 |
AtmiPEP 172a3 |
Arabidopsis thaliana |
ATGGTTAGGTTCCAACTAAGTATACGAGATTAA |
SEQ ID NO : 170 |
AtmiPEP172b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTGTACGTACTATTATCTCATAAATAAATATTTTTAA |
SEQ ID NO : 171 |
AtmiPEP172c1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTTCCAGCAAAATGGTGCCGTCTTGAGTCTTGA |
SEQ ID NO : 172 |
AtmiPEP172e1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 173 |
AtmiPEP 172e2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 174 |
AtmiPEP 172e3 |
Arabidopsis thaliana |
ATGGGAGTTCCCAACTTTAGACCTCGAAACCGATAA |
SEQ ID NO : 175 |
AcmiPEP319a1 |
Arabidopsis cebennensis |
|
SEQ ID NO : 176 |
AcmiPEP319a2 |
Arabidopsis cebennensis |
|
SEQ ID NO : 177 |
AhmiPEP319a |
Arabidopsis halleri |
|
SEQ ID NO : 178 |
AlmiPEP319a |
Arabidospis lyrata |
|
SEQ ID NO :179 |
AtmiPEP319a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 180 |
AtmiPEP319a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 181 |
BrmiPEP319a |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO : 182 |
CpmiPEP319a |
Carica papaya |
|
SEQ ID NO : 183 |
CrmiPEP319a |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO : 184 |
EgmiPEP319a |
Eucalyptus grandis |
|
SEQ ID NO : 185 |
GrmiPEP319a |
Gossypium raimondii |
|
SEQ ID NO : 186 |
MtmiPEP319a |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO : 187 |
OsmiPEP319a |
Oryza sativa |
|
SEQ ID NO : 188 |
PpmiPEP319a |
Physcomitrella patens |
|
SEQ ID NO : 189 |
ThmiPEP319a1 |
Thellungiella halophila |
|
SEQ ID NO : 190 |
ThmiPEP319a2 |
Thellungiella halophila |
|
SEQ ID NO : 191 |
AtmiPEP319b1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 192 |
AtmiPEP394a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 193 |
AtmiPEP395c1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGACAGAGCAAGAAGAAGAAAGTCAAATGTCCACATGA |
SEQ ID NO : 194 |
AtmiPEP395e1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :195 |
AtmiPEP397b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAGCAAGGAGATATTTTTTTCCCCTGGGTTTGAATGA |
SEQ ID NO : 196 |
AtmiPEP398c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 197 |
AtmiPEP399b |
Arabidopsis thaliana |
ATGAAGAGAAACATGTAA |
SEQ ID NO : 198 |
AtmiPEP399d1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGCAATGTGAAATATGA |
SEQ ID NO :199 |
AtmiPEP403 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTTTGTGCTTGA |
SEQ ID NO :200 |
AtmiPEP447a1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGGTCATGGCTCATCATTAG |
SEQ ID NO :201 |
AtmiPEP447a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :202 |
AtmiPEP447b1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGCTGCTTATCATCGTGGAGTTGGTTCTGTAA |
SEQ ID NO :203 |
AtmiPEP447b2 |
Arabidopsis thaliana |
ATGCTTTGTTTCAATTTCAGGTGCGTTAGAAGGTTTGCAGAGTAG |
SEQ ID NO :204 |
AtmiPEP447c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :205 |
dmmiPEP1a |
Drosophila melanogaster |
|
SEQ ID NO :206 |
DmmiPEP1b |
Drosophila melanogaster |
|
SEQ ID NO :207 |
DmmiPEP8 |
Drosophila melanogaster |
|
SEQ ID NO :208 |
HsmiPEP155 |
Homo sapiens |
|
SEQ ID NO :356 |
AtmiPEP157c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 387 |
AtmiPEP157d |
Arabidopsis thaliana |
ATGCTGTATGTATAG |
SEQ ID NO : 388 |
AtmiPEP 160c |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTCATGCGTAGAGGTTTGGTATACAACAATATATACATATAA |
SEQ ID NO : 389 |
AtmiPEP 164b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 390 |
AtmiPEP 166c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 391 |
AtmiPEP 166d |
Arabidopsis thaliana |
ATGAAGAAGATCGGTAGtATTGATTCATTTTAA |
SEQ ID NO :392 |
AtmiPEP 169a |
Arabidopsis thaliana |
ATGACTTGCCGATTTAAATGA |
SEQ ID NO : 393 |
AtmiPEP169h1 |
Arabidopsis thaliana |
ATGGTGACATGA |
SEQ ID NO : 394 |
AtmiPEP 169h2 |
Arabidopsis thaliana |
ATGAAGAATGAGAACTTGTGTGGTAGCCAAGGATGA |
SEQ ID NO : 395 |
AtmiPEP 169n |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 396 |
AtmiPEP 170 |
Arabidopsis thaliana |
ATGTTTCCGAGAGAGTCCCTCTGA |
SEQ ID NO : 397 |
AtmiPEP396a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 398 |
AtmiPEP399c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 399 |
MtmiPEP169d |
Medicago truncatula |
ATGGTCAAAGAGTCTTTCATGGAGAGGTTGAAAGTGAGATGA |
SEQ ID NO : 425 |
Table 3. Liste des transcrits primaires (pri-miRs)
miPEP | Organisme | Séquence du Pri-miR | SEQ ID |
AtmiPEP156a1 AtmiPEP156a2 AtmiPEP156a3 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :209 |
AtmiPEP156c1 AtmiPEP156c2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :210 |
AtmiPEP156e1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :211 |
AtmiPEP156f1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :212 |
AlmiPEP159a |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO :213 |
AtmiPEP159a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :214 |
CrmiPEP159a |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO :215 |
|
|
|
|
AtmiPEP159b1 AtmiPEP159b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :216 |
AtmiPEP 160a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :217 |
AtmiPEP160b1 AtmiPEP 160b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :218 |
AtmiPEP 161 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :219 |
|
|
|
|
AtmiPEP162a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :220 |
AtmiPEP162bl |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :221 |
AtmiPEP 163-1 AtmiPEP163-2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :222 |
AlmiPEP164a1 AlmiPEP164a2 AlmiPEP 164a3 |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO :223 |
|
|
|
|
AtmiPEP 164a1 AtmiPEP 164a2 AtmiPEP 164a3 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :224 |
BrmiPEP164a1 BrmiPEP164a2 BrmiPEP164a3 |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO :225 |
CpmiPEP 164a1 CpmiPEP 164a2 |
Carica papaya |
|
SEQ ID NO :226 |
CrmiPEP164a1 CrmiPEP164a2 CrmiPEP164a3 |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO :227 |
|
|
|
|
GrmiPEP164a1 GrmiPEP164a2 GrmiPEP164a3 |
Gossypium raimondii |
|
SEQ ID NO :228 |
MtmiPEP 164a1 MtmiPEP 164a2 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :229 |
OsmiPEP 164a1 OsmiPEP 164a2 |
Oryza sativa |
|
SEQ ID NO :230 |
|
|
|
|
AlmiPEP165a |
Arabidopsis lyrata |
|
SEQ ID NO :231 |
AtmiPEP 165a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :232 |
BcmiPEP165a |
Brassica carinata |
|
SEQ ID NO :233 |
|
|
|
|
BjmiPEP165a |
Brassica juncea |
|
SEQ ID NO :234 |
BnmiPEP165a |
Brassica napus |
|
SEQ ID NO :235 |
BomiPEP165a |
Brassica oleracea |
|
SEQ ID NO :236 |
|
|
|
|
BrmiPEP165a |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO :237 |
AtmiPEP 166a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :238 |
AtmiPEP 166b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :239 |
AtmiPEP167a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :240 |
AtmiPEP167b1 AtmiPEP167b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :241 |
|
|
|
|
AtmiPEP169c1 AtmiPEP169c2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :242 |
AtmiPEP16911 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :243 |
AtmiPEP171a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :244 |
|
|
|
|
AtmiPEP171b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :245 |
MtmiPEP171b1 MtmiPEP171b2 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :246 |
ZmmiPEP171b |
Zea mays |
|
SEQ ID NO :247 |
AtmiPEP171c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :248 |
MtmiPEP171e |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :249 |
MtmiPEP171h |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :250 |
AtmiPEP 172a1 AtmiPEP 172a3 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :251 |
AtmiPEP172b1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :252 |
AtmiPEP172c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :253 |
AtmiPEP172e1 AtmiPEP 172e2 AtmiPEP 172e3 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :254 |
AcmiPEP319a1 AcmiPEP319a2 |
Arabidopsis cebennensis |
|
SEQ ID NO :255 |
AhmiPEP319a |
Arabidopsis halleri |
|
SEQ ID NO :256 |
|
|
|
|
AlmiPEP319a |
Arabidospis lyrata |
|
SEQ ID NO :257 |
AtmiPEP319a1 AtmiPEP319a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :258 |
BrmiPEP319a |
Brassica rapa |
|
SEQ ID NO :259 |
CpmiPEP319a |
Carica papaya |
|
SEQ ID NO :260 |
CrmiPEP319a |
Capsella rubella |
|
SEQ ID NO :261 |
|
|
|
|
EgmiPEP319a |
Eucalyptus grandis |
|
SEQ ID NO :262 |
GrmiPEP319a |
Gossypium raimondii |
|
SEQ ID NO :263 |
|
|
|
|
MtmiPEP319a |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :264 |
OsmiPEP319a |
Oryza sativa |
|
SEQ ID NO :265 |
PpmiPEP319a |
Physcomitrella patens |
|
SEQ ID NO :266 |
|
|
|
|
ThmiPEP319a1 ThmiPEP319a2 |
Thellungiella halophila |
|
SEQ ID NO :267 |
AtmiPEP319b1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :268 |
|
|
|
|
AtmiPEP394a1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :269 |
AtmiPEP395c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :270 |
AtmiPEP395e1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :271 |
AtmiPEP397b1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :272 |
AtmiPEP398c1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :273 |
AtmiPEP399b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :274 |
AtmiPEP399d1 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :275 |
AtmiPEP403 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :276 |
AtmiPEP447a1 AtmiPEP447a2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :277 |
AtmiPEP447b1 AtmiPEP447b2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :278 |
|
|
|
|
AtmiPEP447c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO :279 |
DmmiPEPla DmmiPEP1b |
Drosophila melanogaster |
|
SEQ ID NO :280 |
|
|
|
|
DmmiPEP8 |
Drosophila melanogaster |
|
SEQ ID NO :281 |
HsmiPEP155 |
Homo sapiens |
|
SEQ ID NO :357 |
|
|
|
|
AtmiPEP157c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 400 |
AtmiPEP157d |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 401 |
AtmiPEP 160c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 402 |
AtmiPEP 164b |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 403 |
AtmiPEP 166c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 404 |
|
|
|
|
AtmiPEP 166d |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 405 |
AtmiPEP 169a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 406 |
AtmiPEP169h1 AtmiPEP 169h2 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 407 |
AtmiPEP 169n |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 408 |
AtmiPEP 170 |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 409 |
AtmiPEP396a |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 410 |
|
|
|
|
AtmiPEP399c |
Arabidopsis thaliana |
|
SEQ ID NO : 411 |
MtmiPEP169d |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO : 426 |
Table 4. Liste des microARNs (miRs)
miPEP | Organisme | Séquence du miR | SEQ ID |
AtmiPEP156a1 |
Arabidopsis thaliana |
ugacagaagagagugagcac |
SEQ ID NO :282 |
AtmiPEP156a2 |
AtmiPEP156a3 |
AtmiPEP156c1 |
Arabidopsis thaliana |
ugacagaagagagugagcac |
SEQ ID NO :283 |
AtmiPEP156c2 |
AtmiPEP156e1 |
Arabidopsis thaliana |
ugacagaagagagugagcac |
SEQ ID NO :284 |
AtmiPEP156f1 |
Arabidopsis thaliana |
ugacagaagagagugagcac |
SEQ ID NO :285 |
AlmiPEP159a |
Arabidopsis lyrata |
uuuggauugaagggagcucua |
SEQ ID NO :286 |
AtmiPEP159a1 |
Arabidopsis thaliana |
uuuggauugaagggagcucua |
SEQ ID NO :287 |
CrmiPEP159a |
Capsella rubella |
uuuggauugaagggagcucua |
SEQ ID NO :288 |
AtmiPEP159b1 |
Arabidopsis thaliana |
uuuggauugaagggagcucuu |
SEQ ID NO :289 |
AtmiPEP159b2 |
AtmiPEP160a1 |
Arabidopsis thaliana |
ugccuggcucccuguaugcca |
SEQ ID NO :290 |
AtmiPEP160b1 |
Arabidopsis thaliana |
ugccuggcucccuguaugcca |
SEQ ID NO :291 |
AtmiPEP 160b2 |
AtmiPEP 161 |
Arabidopsis thaliana |
ucaaugcauugaaagugacua |
SEQ ID NO :292 |
AtmiPEP162a1 |
Arabidopsis thaliana |
ucgauaaaccucugcauccag |
SEQ ID NO :293 |
AtmiPEP162b1 |
Arabidopsis thaliana |
ucgauaaaccucugcauccag |
SEQ ID NO :294 |
AtmiPEP 163-1 |
Arabidopsis thaliana |
uugaagaggacuuggaacuucgau |
SEQ ID NO :295 |
AtmiPEP163-2 |
AlmiPEP164a1 |
Arabidopsis lyrata |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :296 |
AlmiPEP164a2 |
AlmiPEP164a3 |
AtmiPEP 164a1 |
Arabidopsis thaliana |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :297 |
AtmiPEP 164a2 |
AtmiPEP 164a3 |
BrmiPEP164a1 |
Brassica rapa |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :298 |
BrmiPEP164a2 |
BrmiPEP164a3 |
CpmiPEP 164a1 |
Carica papaya |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :299 |
CpmiPEP 164a2 |
CrmiPEP164a1 |
Capsella rubella |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :300 |
CrmiPEP164a2 |
CrmiPEP164a3 |
GrmiPEP164a1 |
Gossypium raimondii |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :301 |
GrmiPEP164a2 |
GrmiPEP164a3 |
MtmiPEP 164a1 |
Medicago truncatula |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO :302 |
MtmiPEP 164a2 |
OsmiPEP 164a1 |
Oryza sativa |
uggagaagcaggguacgugca |
SEQ ID NO :303 |
OsmiPEP 164a2 |
AlmiPEP165a |
Arabidopsis lyrata |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :304 |
AtmiPEP 165a |
Arabidopsis thaliana |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :305 |
BcmiPEP165a |
Brassica carinata |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :306 |
BjmiPEP165a |
Brassica juncea |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :307 |
BnmiPEP165a |
Brassica napus |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :308 |
BomiPEP165a |
Brassica oleracea |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :309 |
BrmiPEP165a |
Brassica rapa |
ucggaccaggcuucauccccc |
SEQ ID NO :310 |
AtmiPEP 166a |
Arabidopsis thaliana |
ucggaccaggcuucauucccc |
SEQ ID NO :311 |
AtmiPEP 166b |
Arabidopsis thaliana |
ucggaccaggcuucauucccc |
SEQ ID NO :312 |
AtmiPEP167a |
Arabidopsis thaliana |
ugaagcugccagcaugaucua |
SEQ ID NO :313 |
AtmiPEP167b1 |
Arabidopsis thaliana |
ugaagcugccagcaugaucua |
SEQ ID NO :314 |
AtmiPEP167b2 |
AtmiPEP169c1 |
Arabidopsis thaliana |
cagccaaggaugacuugccgg |
SEQ ID NO :315 |
AtmiPEP 169c2 |
AtmiPEP 16911 |
Arabidopsis thaliana |
uagccaaggaugacuugccug |
SEQ ID NO :316 |
AtmiPEP171a1 |
Arabidopsis thaliana |
ugauugagccgcgccaauauc |
SEQ ID NO :317 |
AtmiPEP 171b |
Arabidopsis thaliana |
uugagccgugccaauaucacg |
SEQ ID NO :318 |
MtmiPEP171b1 |
Medicago truncatula |
ugauugagccgcgucaauauc |
SEQ ID NO :319 |
MtmiPEP171b2 |
ZmmiPEP171b |
Zea mays |
ggauugagccgcgucaauauc |
SEQ ID NO :320 |
AtmiPEP 171 c1 |
Arabidopsis thaliana |
uugagccgugccaauaucacg |
SEQ ID NO :321 |
MtmiPEP171e |
Medicago truncatula |
agauugagccgcgccaauauc |
SEQ ID NO :322 |
MtmiPEP171h |
Medicago truncatula |
cgagccgaaucaauaucacuc |
SEQ ID NO :323 |
AtmiPEP 172a1 |
Arabidopsis thaliana |
agaaucuugaugaugcugcau |
SEQ ID NO :324 |
AtmiPEP 172a3 |
AtmiPEPI72bl |
Arabidopsis thaliana |
gcagcaccauuaagauucac |
SEQ ID NO :325 |
AtmiPEP172c1 |
Arabidopsis thaliana |
agaaucuugaugaugcugcag |
SEQ ID NO :326 |
AtmiPEP172e1 |
Arabidopsis thaliana |
ggaaucuugaugaugcugcau |
SEQ ID NO :327 |
AtmiPEP 172e2 |
AtmiPEP 172e3 |
AcmiPEP319a1 |
Arabidopsis cebennensis |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :328 |
AcmiPEP319a2 |
AhmiPEP319a |
Arabidopsis halleri |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :329 |
AlmiPEP319a |
Arabidospis lyrata |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :330 |
AtmiPEP319a1 |
Arabidopsis thaliana |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :331 |
AtmiPEP319a2 |
BrmiPEP319a |
Brassica rapa |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :332 |
CpmiPEP319a |
Carica papaya |
uuggacugaagggagcuccuu |
SEQ ID NO :333 |
CrmiPEP319a |
Capsella rubella |
uuggacugaagggagcucc |
SEQ ID NO :334 |
EgmiPEP319a |
Eucalyptus grandis |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :335 |
GrmiPEP319a |
Gossypium raimondii |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :336 |
MtmiPEP319a |
Medicago truncatula |
uuggacugaagggagucucccu |
SEQ ID NO :337 |
OsmiPEP319a |
Oryza sativa |
uuggacugaagggugcucccu |
SEQ ID NO :338 |
PpmiPEP319a |
Physcomitrella patens |
cuuggacugaagggagcucc |
SEQ ID NO :339 |
ThmiPEP319a1 |
Thellungiella halophila |
uggacucaaggaagcucucu |
SEQ ID NO :340 |
ThmiPEP319a2 |
AtniiPEP319b1 |
Arabidopsis thaliana |
uuggacugaagggagcucccu |
SEQ ID NO :341 |
AtmiPEP394a1 |
Arabidopsis thaliana |
uuggcauucuguccaccucc |
SEQ ID NO :342 |
AtmiPEP395c1 |
Arabidopsis thaliana |
cugaaguguuuggggggacuc |
SEQ ID NO :343 |
AtmiPEP395e1 |
Arabidopsis thaliana |
cugaaguguuugggggaacuc |
SEQ ID NO :344 |
AtmiPEP397b1 |
Arabidopsis thaliana |
ucauugagugcaucguugaug |
SEQ ID NO :345 |
AtmiPEP398c1 |
Arabidopsis thaliana |
uguguucucaggucaccccug |
SEQ ID NO :346 |
AtmiPEP399b |
Arabidopsis thaliana |
ugccaaaggagaguugcccug |
SEQ ID NO :347 |
AtmiPEP399d1 |
Arabidopsis thaliana |
ugccaaaggagauuugccccg |
SEQ ID NO :348 |
AtmiPEP403 |
Arabidopsis thaliana |
uuagauucacgcacaaacucg |
SEQ ID NO :349 |
AtmiPEP447a1 |
Arabidopsis thaliana |
uuggggacgagauguuuuguug |
SEQ ID NO :350 |
AtmiPEP447a2 |
Arabidopsis thaliana |
uuggggacgagauguuuuguug |
AtmiPEP447b1 |
Arabidopsis thaliana |
uuggggacgagauguuuuguug |
SEQ ID NO :351 |
AtmiPEP447b2 |
Arabidopsis thaliana |
uuggggacgagauguuuuguug |
AtmiPEP447c |
Arabidopsis thaliana |
ccccuuacaaugucgaguaaa |
SEQ ID NO :352 |
DmmiPEP1a |
Drosophila melanogaster |
uggaauguaaagaaguauggag |
SEQ ID NO :353 |
DmmiPEP 1b |
DmmiPEP8 |
Drosophila melanogaster |
uaauacugucagguaaagauguc |
SEQ ID NO :354 |
HsmiPEP155 |
Homo sapiens |
uuaaugcuaaucgugauaggggu |
SEQ ID NO :358 |
AtmiPEP157c |
Arabidopsis thaliana |
uugacagaagauagagagcac |
SEQ ID NO : 412 |
AtmiPEP157d |
Arabidopsis thaliana |
ugacagaagauagagagcac |
SEQ ID NO : 413 |
AtmiPEP 160c |
Arabidopsis thaliana |
ugccuggcucccuguaugcca |
SEQ ID NO : 414 |
AtmiPEP 164b |
Arabidopsis thaliana |
uggagaagcagggcacgugca |
SEQ ID NO : 415 |
AtmiPEP 166c |
Arabidopsis thaliana |
ucggaccaggcuucauucccc |
SEQ ID NO : 416 |
AtmiPEP 166d |
Arabidopsis thaliana |
ucggaccaggcuucauucccc |
SEQ ID NO : 417 |
AtmiPEP 169a |
Arabidopsis thaliana |
cagccaaggaugacuugccga |
SEQ ID NO : 418 |
AtmiPEP 169h |
Arabidopsis thaliana |
uagccaaggaugacuugccug |
SEQ ID NO : 419 |
AtmiPEP 169n |
Arabidopsis thaliana |
uagccaaggaugacuugccug |
SEQ ID NO : 420 |
AtmiPEP 170 |
Arabidopsis thaliana |
ugauugagccgugucaauauc |
SEQ ID NO : 421 |
AtmiPEP396a |
Arabidopsis thaliana |
uuccacagcuuucuugaacug |
SEQ ID NO : 422 |
AtmiPEP399c |
Arabidopsis thaliana |
ugccaaaggagaguugcccug |
SEQ ID NO : 423 |
AtmiPEP 169d |
Medicago truncatula |
aagccaaggaugacuugccgg |
SEQ ID NO : 427 |
Table 5. Liste des Pre-miRs témoins
Pre-miR | Organisme | Séquence du Pre-miR | SEQ ID |
Pre-miR169 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :359 |
Pre-miR169a |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :360 |
Pre-miR171a MI 0001753 |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :361 |
Pre-miR171h |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :362 |
Pre-miR393a |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :363 |
Pre-miR393b |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :364 |
Pre-miR396a |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :365 |
Pre-miR396b |
Medicago truncatula |
|
SEQ ID NO :366 |
Table 6. Liste des miRs témoins
miR | Organisme | Séquence du miR | SEQ ID |
miR169 |
Medicago truncatula |
CAGCCAAGGAUGACUUGCCGG |
SEQ ID NO :367 |
miR169a |
Medicago truncatula |
CAGCCAAGGAUGACUUGCCGA |
SEQ ID NO :368 |
miR171a |
Medicago truncatula |
UGAUUGAGUCGUGCCAAUAUC |
SEQ ID NO :369 |
miR171h |
Medicago truncatula |
GAGCCGAAUCAAUAUCACUC |
SEQ ID NO :370 |
miR393a |
Medicago truncatula |
UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC |
SEQ ID NO :371 |
miR393b |
Medicago truncatula |
UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC |
SEQ ID NO :372 |
miR396a |
Medicago truncatula |
UUCCACAGCUUUCUUGAACUU |
SEQ ID NO :373 |
miR396b |
Medicago truncatula |
UUCCACAGCUUUCUUGAACUG |
SEQ ID NO :374 |
Table 7. Polymorphisme de la séquence d'ADN des différentes régions du pri-miR171b
| Taille | # SNPs | # mutations | %SNP | # haplotypes |
pri-mir171b |
1127 |
91 |
100 |
8,07 |
161 |
5' pri-miR171b |
129 |
4 |
4 |
3,1 |
5 |
miPEP171b |
62 |
2 |
2 |
3,22 |
3 |
Pre-miR171b |
118 |
1 |
1 |
0,85 |
2 |
miR171b+miR171b∗ |
42 |
0 |
0 |
0 |
1 |
3' pri-miR171b |
259 |
39 |
42 |
15,06 |
89 |
[0348] Les figures et les exemples suivants illustreront mieux l'invention, sans pour autant en limiter sa portée.
LEGENDES DES FIGURES
[0349] FIGURE 1. Effets de la surexpression du MtmiR171b (miR171b identifié chez Medicago truncatula) sur l'expression des gènes HAM1 et HAM2 (A) ou sur le nombre de racines latérales (B) chez M. truncatula.
- (A) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b (colonnes de gauche), de HAM1 (colonnes du milieu) ou de HAM2 (colonnes de droite) chez une plante témoin (colonnes blanches) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé MtmiR171b (colonnes noires). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10). La surexpression de MtmiR171b induit une diminution de l'expression des gènes HAM1 et HAM2.
- (B) L'axe des ordonnées indique le nombre moyen de racines latérales observées chez une plante témoin (colonne blanche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé MtmiR171b (colonne noire). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 100). La surexpression de MtmiR171b entraîne une réduction du nombre de racines latérales.
[0350] FIGURE 2. Effets de la surexpression du MtmiPEP171b1 sur l'expression du MtmiR171b et des gènes HAM1 et HAM2 (A) ou sur le nombre racines latérales (B) chez M. truncatula.
- (A) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiPEP171b1 (graphique de gauche), du miR171b (graphique de droite, colonnes de gauche), de HAM1 (accession n°MtGI9- TC114268) (graphique de droite, colonnes du milieu) ou de HAM2 (accession n° MtGI9- TC120850) (graphique de droite, colonnes de droite) chez une plante témoin (colonnes blanches) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé MtmiPEP171b1 (colonnes noires). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10). La surexpression de MtmiPEP171b1 induit une augmentation de l'accumulation de MtmiR171b, ainsi qu'une diminution de l'expression des gènes HAM1 et HAM2.
- (B) L'axe des ordonnées indique le nombre moyen de racines latérales observées chez une plante témoin (colonne blanche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé MtmiPEP171b1 (colonne noire). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 100). La surexpression de MtmiPEP171b1 entraîne une réduction du nombre de racines latérales.
[0351] FIGURE 3. Effets du MtmiPEP171b1 sur l'expression du MtmiR171b et des gènes HAM1 et HAM2 (A) et sur le nombre racines latérales (B) chez M. truncatula.
- (A) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b (colonnes de gauche), de HAM1 (colonnes du milieu) ou de HAM2 (colonnes de droite) chez une plante témoin (colonnes blanches) ou chez une plante traitée par arrosage pendant 5 jours et 1 fois par jour avec le MtmiPEP171b1 à 0,01 µM (colonnes gris clair), 0,1 µM (colonnes gris foncé) ou 1µM (colonnes noires). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10). L'application du MtmiPEP171b1 à différentes concentrations induit une augmentation de l'accumulation de MtmiR171b, ainsi qu'une diminution de l'expression des gènes HAM1 et HAM2.
- (B) L'axe des ordonnées indique le nombre moyen de racines latérales observées chez une plante témoin (colonne blanche) ou chez une plante traitée par arrosage avec le MtmiPEP171b1 à 0,1 µM pendant 5 jours et 1 fois par jour (colonne noire). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 100). L'application du MtmiPEP171b1 à 0,1 µM entraîne une réduction du nombre de racines latérales.
- (C) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b (colonnes de gauche), de HAM1 (colonnes du milieu) ou de HAM2 (colonnes de droite) chez une plante témoin (colonnes blanches) ou chez une plante traitée par arrosage pendant 5 jours et 1 fois par jour avec le MtmiPEP171b1 à 0,01 µM (colonnes gris), 0,1 µM (colonnes gris foncé) ou 1µM (colonnes noires) ou avec 0,01 µM d'un peptide mélange (LIVSHLYSEKFDCMRKILRI, SEQ ID NO : 428)(colonnes gris clair) dont la composition en acides aminés est identique au miPEP171b mais dont la séquence est différente. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0352] FIGURE 4. Effets du MtmiPEP171b1 sur l'expression du pre-MtmiR171b (A) et du MtmiR171b (B) chez M. truncatula.
[0353] L'axe des ordonnées indique l'expression relative des précurseurs des différentes formes du microARN chez des plantes contrôles (colonne de gauche) ou chez des plantes traitées par arrosage pendant 5 jours et 1 fois par jour avec le MtmiPEP 171b1 à 0,01 µM, 0,1 µM ou 1 µM (colonnes de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 200). L'application du MtmiPEP171b1 à différentes concentrations entraîne une augmentation de l'accumulation du pre-MtmiR171b (A) et du MtmiR171b (B).
[0354] FIGURE 5. Effets de la surexpression du MtmiPEP171b1 (A) et effets du MtmiPEP171b1 (B) sur l'expression de différents précurseurs de microARNs chez M. truncatula.
[0355] L'axe des ordonnées indique le ratio de l'expression des précurseurs de microARNs dans des plantes surexprimant le MtmiPEP171b1 sur l'expression de ces mêmes précurseurs dans des racines contrôle (A), ou le ratio de l'expression des précurseurs de microARNs dans des plantes traitées avec le MtmiPEP171b1 (0,1 µM) sur l'expression de ces mêmes précurseurs dans des racines contrôle (B). Les différents précurseurs de microARNs testés sont indiqués de gauche à droite sur l'axe des abscisses, à savoir pre-MtmiR171b (SEQ ID NO : 246), pre-MtmiR169 (SEQ ID NO : 359), pre-MtmiR169a (SEQ ID NO : 360), pre-MtmiR171a (SEQ ID NO : 361), pre-MtmiR171h (SEQ ID NO : 362), pre-MtmiR393a (SEQ ID NO : 363), pre-MtmiR393b (SEQ ID NO : 364), pre-MtmiR396a (SEQ ID NO : 365) et pre-MtmiR396b (SEQ ID NO : 366). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10). On constate que le MtmiPEP 171b1 n'entraîne un effet que sur l'accumulation du MtmiR171b et pas sur les autres miRs.
[0356] FIGURE 6. Effets de la traduction du MtmiPEP171b1 sur l'expression du MtmiR171b mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana. L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b chez des plantes de tabac transformées pour exprimer le pri-MtmiR171b (colonne blanche) ou un pri-MtmiR171b muté dans lequel le codon ATG a été remplacé par ATT (colonne noire). Le pri-MtmiR171b muté est donc incapable de produire le MtmiPEP171b1. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). On constate que l'absence de la traduction du MtmiPEP171b1 entraîne une forte diminution de l'accumulation du miR171b.
[0357] FIGURE 7. Effets de la surexpression du MtmiPEP171b1 sur l'expression du pre-MtmiR171b mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana.
[0358] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du pre-MtmiR171b chez des plantes de tabac qui ont été transformées pour exprimer le MtmiR171b (colonne de gauche), le MtmiR171b et le MtmiPEP171b1 (colonne du centre), ou le MtmiR171b et une version mutée du MtmiORF171b dans laquelle le codon d'initiation ATG a été remplacé ATT (colonne de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). On constate que l'expression du MtmiPEP171b1 augmente l'expression du MtmiR171b, et cet effet est dépendant de la traduction du MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
[0359] FIGURE 8. Effets du MtmiPEP171b1 sur l'expression du pre-MtmiR171b mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana.
[0360] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b chez des plantes de tabac transformées pour exprimer le MtmiR171b sur lesquelles le MtmiPEP171b1 a été pulvérisé (0,1 µM) 2 fois, 12h puis 30min avant prélèvement (colonne de droite) ou non (colonne de gauche). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 6). Le peptide MtmiPEP171b1 utilisé par pulvérisation induit une augmentation de l'accumulation du MtmiR171b.
[0361] FIGURE 9. Effets du MtmiPEP171b1 sur l'expression du pri-miR171b (A), du pre-MtmiR171b (B) et
du MtmiR171b (C) mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana.
[0362] L'axe des ordonnées indique l'expression relative des précurseurs des différentes formes du microARN chez des plantes de tabac modifiées pour exprimer le MtmiR171b (colonne de gauche) ou modifiées pour exprimer le MtmiR171b et surexprimer le MtmiPEP171b1 (colonnes de droite, fig. 9A) ou traitées par 0.1µM de miPEP171b1 (Fig. 9B et C). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). La surexpression du MtmiPEP171b1 ou l'application du miPEP171b1 augmente l'accumulation du pri-MtmiR171b (A), du pre-MtmiR171b (B) et du MtmiR171b (C).
[0363] FIGURE 10. Localisation du MtmiPEP171b1 dans les cellules de feuilles de tabac qui ont été modifiées pour exprimer le MtmiPEP171b1.
[0364] Les photographies représentent des cellules de feuilles de tabac modifiées pour exprimer la protéine GFP seule (cadre de gauche) ou la protéine GFP fusionnée au MtmiPEP171b1 (cadre de droite). Ces observations indiquent que le MtmiPEP171b1 est localisé dans des petits corps nucléaires.
[0365] FIGURE 11. Effets de l'expression du AtmiPEP165a (identifié chez Arabidopsis thaliana) sur l'expression du AtmiR165a (A) et de l'expression du AtmiPEP319a2 (identifié chez Arabidopsis thaliana) sur le AtmiR319a (B), mis en évidence chez la plante modèle du tabac.
- (A) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du AtmiR165a chez des plantes de tabac modifiées pour exprimer le AtmiR165a (colonne de gauche) ou pour exprimer le AtmiR165a et le AtmiPEP165a (colonne de droite).
- (B) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du AtmiR319a chez des plantes de tabac modifiées pour exprimer le AtmiR319a (colonne de gauche) ou pour exprimer le AtmiR319a et le AtmiPEP319a (colonne de droite).
La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). Dans les deux cas, on constate que l'expression du miORF, et donc la production du miPEP, entraîne une augmentation de l'accumulation du pre-miR.
[0366] FIGURE 12. Effets du traitement par le AtmiPEP165a sur la croissance des racines d'Arabidopsis thaliana.
[0367] La photographie présente deux plantes de même âge : une plante contrôle (plante de gauche) et une plante traitée par le AtmiPEP165a (plante de droite). Le traitement par le AtmiPEP165a entraine un phénotype de croissance racinaire très accélérée chez
Arabidopsis thaliana. Le graphique montre l'expression du pre-miR165 en réponse au traitement par des doses croissantes de AtmiPEP165a.
[0368] FIGURE 13. Conservation de la séquence du miPEP8 identifié chez la drosophile.
[0369] Les séquences du miPEP8 (SEQ ID NO : 104) ont été déduites à partir des séquences du miORF8 (SEQ ID NO : 208) de 12 espèces de drosophile différentes et ont été alignées. Un histogramme représente la conservation de chaque acide aminé entre les séquences du miORF8 chez les 12 espèces analysées.
[0370] FIGURE 14. Evolution de la masse (kDa) et du point isoélectrique (pI) du miPEP8 chez les espèces de drosophile.
[0371] L'axe des ordonnées de gauche indique la taille du miPEP8 (en kD). L'axe des ordonnées de droit indique le point isoélectrique du miPEP. L'axe des abscisses indique l'origine du miPEP, c'est-à-dire l'espèce de drosophile. On constate que malgré une modification importante de leur taille (plus d'un facteur 3), la charge des miPEPs reste très basique (>9,8) chez les 12 espèces étudiées.
[0372] FIGURE 15. Effet de l'ajout de séquences sur la fonction du miPEP.
[0373] Les feuilles de tabac ont été transformées pour surexprimer le miPEP171b. Ces graphiques montrent que l'ajout de séquences (tag His, HA ou GFP) n'altère pas la fonction du miPEP. L'axe des ordonnées indique l'expression relative du pre-MtmiR171b chez des plantes de tabac qui ont été transformées pour exprimer le MtmiR171b (colonne de gauche), le MtmiR171b et le MtmiPEP171b1 avec ou sans ajout de tags proteiques (colonnes de droite) La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 6). On constate que l'expression du MtmiPEP171b1 augmente l'expression du MtmiR171b, et cet effet est indépendant de la présence de tags.
[0374] FIGURE 16. Expression du MtmiPEP171b1 dans le système racinaire de Medicago truncatula.
[0375] Les racines de
Medicago truncatula ont été transformées pour exprimer des fusions entre la protéine GUS (en bleu) et le promoteur du miR17b (A, E), l'ATG du miPEP171b1 (B, F), le miPEP171b1 entier (C, G) ou bien l'ATG2 (deuxième ATG se trouvant sur le précurseur, après le miPEP) (D, H). On voit bien une expression du miR dans les pointes racinaires (A) ainsi que les racines latérales (E). Les fusions transcriptionnelles (B, F) et traductionnelles (C, G) montrent une expression du miPEP171b dans les mêmes tissus, alors que l'ATG suivant n'est pas actif (D, H).
[0376] FIGURE 17. Expression du DmmiPEP8 dans des cellules de Drosophila melanogaster Les cellules de
Drosphila melanogaster ont été transfectées pour surexprimer le DmmiPEP8 (OE miPEP8) ou bien le miPEP8 dont les codons d'initiation de traduction ont été mutés (OE miPEP8 mut). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du Pre-miR8. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'expériences indépendantes = 6). On constate que l'expression du DmmiPEP8 augmente l'expression du DmmiR8, et cet effet est lié à la traduction de l'ARNm.
[0377] FIGURE 18. Impact du DmmiPEP8 sur l'accumulation du DmmiR8 dans des cellules de D. melanogaster
[0378] Les cellules de
Drosphila melanogaster ont été transfectées pour surexprimer le DmmiR8 sauvage (OE miR8) ou bien le DmmiR8 dans lequel les codons d'intitiation de la traduction ont été mutés (OE miR8 miPEP8 mut) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du Pre-miR8. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'expériences indépendantes = 2). On constate que la présence du DmmiPEP8 augmente l'expression du DmmiR8.
[0379] FIGURE 19. Impact du HsmiPEP155 sur l'accumulation du HsmiR155 dans des cellules d'Homo sapiens
[0380] Les cellules HeLA d'Homo sapiens ont été transfectées pour surexprimer le HsmiPEP155 (OE miPEP155). L'axe des ordonnées indique l'expression relative du Pre-miR155. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'expériences indépendantes = 2). On constate que l'expression du HsmiPEP155 augmente l'expression du HsmiR155.
[0381] FIGURE 20. Effets de la traduction du MtmiPEP171b1 sur l'expression du MtmiR171b mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana.
[0382] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b chez des plantes de tabac transformées pour exprimer le pri-miR171b (colonne de gauche), un pri-miR171b dans lequel le miORF171b a été délété (colonne du milieu) ou un pri-miR171b muté dans lequel le codon ATG a été remplacé par ATT (colonne de droite). Le pri-miR171b muté est donc incapable de produire le miPEP171b1. La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). On constate que l'absence de la traduction du miPEP171b1 entraîne une forte diminution de l'accumulation du miR171b.
[0383] FIGURE 21. Effets de la surexpression du MtmiPEP171b1 sur l'expression du MtmiR171b mis en évidence chez la plante modèle Nicotiana benthamiana.
[0384] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR171b chez des plantes de tabac qui ont été transformées avec un vecteur permettant l'expression du miPEP171b et soit un second vecteur vide (colonne blanche), soit un vecteur permettant l'expression du mtmiPEP171b (colonne noire de gauche), soit un vecteur dans lequel le codon ATG de l'ORF codant le mtmiPEP171b a été remplacé par ATT (colonne noire du milieu), soit un vecteur dans lequel la séquence nucléotidique de l'ORF a été mutée sans modifier la séquence d'acides aminés du peptide traduit (miPEP codé par un ORF dégénéré) (colonne noire de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 30). On constate que l'expression du MtmiPEP171b1 augmente l'expression du MtmiR171b, et cet effet est dépendant de la traduction du MtmiORF171b en MtmiPEP171b1.
[0385] FIGURE 22. Effets du AtmiPEP165a sur l'accumulation du AtmiR165a et de ses gènes cibles (PHAVOLUTA : PHV, PHABOLUSA : PHB et REVOLUTA : REV).
[0386] L'axe des ordonnées indique l'expression relative de AtmiR165a, PHV, PHB et REV dans des racines d'
Arabidopsis thaliana traitées avec de l'eau (contrôle) ou différentes concentrations de AtmiPEP165a (0,01 µM, 0,1 µM, 1 µM ou 10 µM). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0387] Le traitement des plantes avec des concentrations de plus en plus importantes de AtmiPEP165a met en évidence un effet dose-dépendant de l'accumulation du AtmiR165a et de la régulation négative de ses gènes cibles en fonction de la quantité de AtmiPEP165a.
[0388] FIGURE 23. Effets d'un traitement avec le AtmiPEP164a sur l'expression du AtmiR164a chez A. thaliana.
[0389] Les photographies représentent les résultats d'une analyse par Northern blot de l'accumulation du AtmiR164a dans des racines traitées avec de l'eau (contrôle, photographie de gauche) ou avec 0,1 µM d'un peptide synthétique, ayant une séquence identique à celle du AtmiPEP164a, dissout dans de l'eau (0,1 µM miPEP164a). L'ARN U6 est utilisé comme témoin de charge permettant de quantifier la quantité de AtmiR164a.
[0390] Cette expérience a été répétée 4 fois de manière indépendante et a abouti à des résultats similaires.
[0391] Le traitement des pousses d'A.
thaliana avec 0,1 µM de miPEP164a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR164a.
[0392] FIGURE 24. Effets du traitement par le AtmiPEP164a sur la croissance d'Arabidopsis thaliana.
[0393] Les photographies présentent deux plantes (vues de dessus et vues de côté) après 3 semaines de croissance : une plante contrôle arrosée avec de l'eau (A), et une plante arrosée avec une composition de 0,1 µM de peptide synthétique correspondant à AtmiPEP164a (B). L'arrosage des plantes d'
Arabidopsis thaliana avec AtmiPEP164a augmente significativement la croissance de la plante.
[0394] FIGURE 25. Effets d'un traitement avec le AtmiPEP165a sur l'expression du AtmiR165a chez A. thaliana.
[0395] Les photographies représentent les résultats d'une analyse par Northern blot de l'accumulation du AtmiR165a dans des racines traitées avec de l'eau (contrôle, photographie de gauche) ou avec 0,1 µM d'un peptide synthétique, ayant une séquence identique à celle du AtmiPEP165a, dissout dans de l'eau (0,1 µM miPEP165a). L'ARN U6 est utilisé comme témoin de charge permettant de quantifier la quantité de AtmiR165a.
[0396] Cette expérience a été répétée 4 fois de manière indépendante et a abouti à des résultats similaires.
[0397] Le traitement des pousses d'A.
thaliana avec 0,1 µM de miPEP165a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR165a.
[0398] FIGURE 26. Effets de la surexpression du AtmiPEP319a1 sur l'expression du AtmiR319a chez A. thaliana.
[0399] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du AtmiR319a chez une plante témoin (colonne de gauche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé AtmiPEP319a1 (colonne de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10). La surexpression de AtmiPEP319a1 induit une augmentation de l'accumulation de Atmir319a.
[0400] FIGURE 27. Effets du traitement par le AtmiPEP319a sur la croissance d'Arabidopsis thaliana.
[0401] Les photographies présentent deux plantes (vues de dessus et vues de côté) après 3 semaines de croissance : une plante contrôle arrosée avec de l'eau (A), et une plante arrosée avec une composition de 0,1 µM de peptide synthétique correspondant à AtmiPEP319a1 (B). L'arrosage des plantes d'
Arabidopsis thaliana avec AtmiPEP319a1 augmente significativement la croissance de la plante.
[0402] FIGURE 28. Immunolocalisation.
[0403] Les racines de
Medicago truncatula ont été transformées pour exprimer des fusions entre la protéine GUS (en bleu) et l'ATG du miPEP171b (Pro
miR171b-ATG1 :GUS) ou bien l'ATG2 (deuxième ATG se trouvant sur le précurseur, après le miPEP) (Pro
miR171b-ATG2 :GUS). Un marquage a été également réalisé avec un anticorps anti-miPEP171b (miPEP171b). L'immunolocalisation du miPEP171b dans les racines de
M. truncatula révèle la présence du miPEP171b dans les sites d'initiation des racines latérales, montrant une co-localisation entre le microARN et le miPEP correspondant.
[0404] FIGURE 29. Effets de la surexpression du AtmiPEP160b1 sur l'expression du AtmiR160b chez A. thaliana.
[0405] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du AtmiR160b chez une plante témoin (barre de gauche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé AtmiPEP160b1 (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0406] La surexpression de AtmiPEP160b1 entraîne une augmentation de l'expression relative du AtmiR160b.
[0407] FIGURE 30. Effets du AtmiPEP164a1 sur l'expression du AtmiR164A .
[0408] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du AtmiR164a chez une plante témoin (barre de gauche) ou chez une plante traitée par arrosage 1 fois par jour avec le AtmiPEP164a1 à 0,1 µM (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0409] L'ajout de AtmiPEP164a1 entraîne une augmentation de l'expression relative du AtmiR164a.
[0410] FIGURE 31. Effets de la surexpression du AtmiPEP319a1 sur l'expression de AtmiR319a chez A. thaliana.
[0411] L'axe des ordonnées indique l'expression relative de AtmiR319a chez une plante témoin (barre de gauche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé AtmiPEP319a1 (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0412] La surexpression de AtmiPEP319a1 entraîne une augmentation de l'expression relative de AtmiR319a.
[0413] FIGURE 32. Effets du MtmiPEP169d sur l'expression du MtmiR169d chez M. truncatula.
[0414] L'axe des ordonnées indique l'expression relative du MtmiR169d chez une plante témoin (barre de gauche) ou chez une plante traitée par arrosage 1 fois par jour avec le MtmiPEP169d à 0,1 µM (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0415] L'ajout de MtmiPEP169d entraîne une augmentation de l'expression relative du MtmiR169d.
[0416] FIGURE 33. Effets de la surexpression du MtmiPEP171e sur l'expression de MtmiR171e chez M. truncatula
[0417] L'axe des ordonnées indique l'expression relative de MtmiR171e chez une plante témoin (barre de gauche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé MtmiPEP171e (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
[0418] La surexpression de MtmiPEP171e entraîne une augmentation de l'expression relative de MtmiR171e.
[0419] FIGURE 34. Localisation du MtmiPEP171b1 dans une plante M. truncatula sauvage. Différentes quantités de peptides synthétiques MtmiPEP171b1 (1, 0,5, ou 0,1 nmol) et un extrait total de racines de
M. truncatula ont été analysés par immunoblot avec un anticorps spécifique du MtmiPEP171b1.
[0420] Le MtmiPEP171b1 est naturellement produit dans les racines de
M.
truncatula.
[0421] FIGURE 35. Présence du AtmiPEP165a dans une plante A. thaliana sauvage.
[0422] La photographie du haut correpond à une analyse par western blot de la quantité de AtmiPEP165a chez un jeune plant d'A.
thaliana sauvage Col-0 (gauche) et un jeune plant
d'A. thaliana surexprimant AtmiPEP165a (droite).
[0423] La photographie du bas correspond à l'analyse par western blot de la quantité d'une protéine contrôle, la tubuline, chez un jeune plant d'A.
thaliana sauvage Col-0 (gauche) et un jeune plant d'A.
thaliana surexprimant AtmiPEP165a (droite).
[0424] Le AtmiPEP165a est naturellement produit chez
A. thaliana et est présent en plus grande quantité dans les plantes surexprimant AtmiPEP165a.
[0425] FIGURE 36. Mode d'action du AtmiPEP165a chez A. thaliana.
- (A) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du pri-miR165a dans des racines témoins (barre de gauche) ou traitées par arrosage 1 fois par jour avec le AtmiPEP165a à 10 µM (barre de droite). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 10).
L'ajout de AtmiPEP165a entraîne une augmentation de l'expression relative du AtmiR165a. - (B) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du pri-miR165a, en présence de cordycepine (inhibiteur de synthèse de l'ARN), dans des racines témoins (courbe grise) ou traitées par arrosage 1 fois par jour avec le AtmiPEP165a à 10 µM (courbe noire). L'axe des abscisses indique la durée du traitement à la cordycepine.
L'ajout de AtmiPEP165a n'entraîne pas une meilleure stabilité du pri-miR165a. - (C) L'axe des ordonnées indique l'expression relative du pri-miR165a, chez des plantes sauvages (Col-0) ou mutées avec un allèle faible de la seconde grande sous-unité de l'ARN polymerase II (nrpb2-3). L'axe des abscisses indique si les plantes ont été arrosées avec de l'eau ou avec le AtmiPEP165a à 10 µM.
[0426] Les plantes mutées, contrairement aux plantes sauvages, ne sont pas capables d'accumuler le AtmiR165a en réponse au AtmiPEP165a.
[0427] FIGURE 37. Effets du pri-miR171b sur le nombre de racines latérales chez M. truncatula.
[0428] L'axe des ordonnées indique le nomre moyen de racines latérales observées chez une plante témoin (barre blanche) ou chez une plante dans laquelle est surexprimé le pri-miR171b (barre noire). La barre d'erreur correspond à l'erreur standard à la moyenne (nombre d'individus = 100).
[0429] La surexpression du pri-miR171b entraîne une réduction du nombre de racines latérales.
[0430] FIGURE 38. Traductibilité du DmmiPEP8 dans les cellules de Drosophila melanogaster.
[0431] Des cellules de
Drosphila melanogaster ont été transfectées pour surexprimer le DmmiPEP8 (miPEP8 : :GFP) ou bien le DmmiPEP8 mt (dont les codons d'initiation de traduction ont été mutés (miPEP8 mt : :GFP)). Comme contrôle de transfection, un plasmide produisant la protéine moesin-RFP (images du bas) a été co-transfecté avec les plasmides codants les DmmiPEP8 (image de gauche) et DmmiPEP 8 mt (image de droite). On constate que les codons initiateurs présents dans la séquence DmmiPEP8 sont fonctionnels puisqu'ils permettent la synthèse de la GFP (image du haut a gauche) alors que les constructions mutées sur les ATG ne produisent quasiment plus de GFP (image du haut a droite).
[0432] Ces résultats suggèrent donc que l'ORF du miPEP est fonctionnel.
EXEMPLES
A : Analyse des miPEPS chez les plantes
EXEMPLE 1 - Caractérisation chez la plante modèle Medicago truncatula
Exemple 1A - MtmiPEP171b1
a) Identification et caractérisation du MtmiPEP171b1 (miPEP171b1 identifié chez Medicago truncatula)
[0433] Le microARN MtmiR171b est exprimé dans la région méristématique des racines. La surexpression de ce microARN conduit notamment à une réduction de l'expression des gènes
HAM1 (Accession n°. MtGI9- TC114268) et
HAM2 (Accession n°. MtGI9-TC120850) (Figure 1A), ainsi qu'à une réduction du nombre de racines latérales (Figures 1B). La surexpression du pri-miR171b entraîne également une réduction du nombre de racines latérales (Figure 37).
[0434] La séquence du transcrit primaire du MtmiR171b a été déterminée en utilisant la technique de RACE-PCR. L'analyse de la séquence du transcrit primaire a permis d'identifier la présence de plusieurs petits cadres ouverts de lecture (ORF) complètement inattendus. Ces ORFs ont été dénommés miORFs pour «
microRNA ORF ». Ces miORFs codent potentiellement des peptides courts, d'environ 4 à 100 acides aminés. Aucune homologie significative concernant ces miORFS n'a été trouvée dans les bases de données.
[0435] La surexpression du premier miORF, nommé MtmiORF171b, conduit à une augmentation de l'accumulation de MtmiR171b et une réduction de l'expression des gènes
HAM1 et
HAM2 (voir Figure 2A), ainsi qu'à une réduction du nombre de racines latérales (Figure 2B), comme cela a déjà été observé lors de la surexpression du MtmiR171b.
[0436] Pour déterminer si le MtmiORF171b conduit à la production réelle d'un peptide et si la fonction de régulation observée ci-dessus est bien portée par ledit peptide, un peptide synthétique, dont la séquence est identique à celle potentiellement codée par MtmiORF171b, a été appliqué sur les racines de
Medicago truncatula. L'application de ce peptide entraîne le phénotype déjà observé plus haut lors de la surexpression du MtmiORF171b, c'est-à-dire qu'il entraîne une augmentation de l'accumulation de MtmiR171b et une réduction de l'expression des gènes
HAM1 et
HAM2 (voir Figure 3A), ainsi qu'une réduction du nombre de racines latérales (Figure 3B).
[0437] Les résultats de ces expériences démontrent que le MtmiORF171b code un peptide capable de moduler l'accumulation du MtmiR171b, et l'expression des gènes cibles de MtmiR171b :
HAM1 et
HAM2. Ledit peptide a été dénommé MtmiPEP171b1 (« miPEP » correspondant à
microRNA encoded PEPtide).
[0438] Par ailleurs, le MtPEP171b1 entraîne une augmentation de l'accumulation du MtmiR171b (Figure 4A) et du pre-MtmiR171b (figure 4B).
b) Spécificité du miPEP171b1
[0439] L'expression de différents précurseurs microARNs de
Medicago truncatula (MtmiR171b SEQ ID NO: 319, MtmiR169 SEQ ID NO: 367, MtmiR169a SEQ ID NO: 368, MtmiR171a SEQ ID NO : 369, MtmiR171h SEQ ID NO : 370, MtmiR393a SEQ ID NO : 371, MtmiR393b SEQ ID NO : 372, MtmiR396a SEQ ID NO : 373 et MtmiR396b SEQ ID NO : 374) a été déterminée et comparée entre des plantes témoins et des plantes dans lesquelles a été surexprimé le MtmiORF171b codant le MtmiPEP171b1 (Figure 5A), ou entre des plantes témoins et des plantes cultivées sur milieu de culture contenant le MtmiPEP171b1 (Figure 5B).
[0440] Les résultats obtenus indiquent que le MtmiPEP171b1 n'entraîne une augmentation de l'accumulation que du MtmiR171b et pas des autres miRs, ce qui indique qu'un miPEP n'a d'effet que sur le microARN dont il est issu.
c) Localisation du miPEP171b1
[0441] Par ailleurs, l'immunolocalisation du miPEP171b1 dans les racines de
M.
truncatula révèle la présence du miPEP171b1 dans les sites d'initiation des racines latérales, montrant une co-localisation entre le microARN et le miPEP correspondant (Figures 28 et 34).
Exemple 1B - MtmiPEP169d
[0442] Concernant MtmiPEP169d, il a été démontré
in vivo chez
M. truncatula que l'ajout de MtmiPEP169d entraine une accumulation du MtmiR169d (Figure 32).
Exemple 1C - MtmiPEP171e
[0443] Concernant MtmiPEP171e, il a été démontré
in vivo chez
M. truncatula que la surexpression de ce miPEP entraine une accumulation du MtmiR171e (Figure 33).
EXEMPLE 2 - Caractérisation chez la plante modèle du tabac
a) Conservation du mécanisme chez le tabac
[0444] Pour déterminer si le mécanisme de régulation des microARNs est conservé chez d'autres espèces de plantes, la régulation du MtmiR171b par le MtmiPEP171b1 a été testée dans un modèle cellulaire différent. Pour cela, le MtmiR171b et le MtmiPEP171b1 ont été introduits dans des feuilles de tabac.
[0445] L'accumulation du MtmiR171b été mesurée chez des feuilles de tabac transformées pour exprimer le MtmiR171b de
Medicago truncatula à partir du pri-miR sauvage capable de produire le MtmiPEP171b1, ou à partir d'une version mutée du pri-miR incapable de produire le MtmiPEP171b1 (dans laquelle le codon d'initiation ATG du MtmiORF171b a été remplacé ATT) (Figure 6 et Figure 20). L'absence de traduction du MtmiPEP171b1 conduit à une forte diminution de l'accumulation du MtmiR171b.
[0446] L'accumulation de pre-MtmiR171b a été mesurée chez des feuilles de tabac transformées pour exprimer le MtmiR171b de
Medicago truncatula seul (témoin), ou exprimant en plus le MtmiORF171b sauvage de
Medicago truncatula (35SmiPEP171b1 ATG), ou une version mutée de MtmiORF171b dans laquelle le codon d'initiation ATG a été remplacé ATT (35SmiPEP171b1 ATT) (Figure 7 et Figure 21). L'expression de MtmiORF171b entraîne une augmentation de l'accumulation du pre-miR171b, et cette accumulation du pre-miR171b dépend de la traduction du MtmiORF171b en micropeptide.
[0447] De même, chez les feuilles de tabac transformées pour exprimer le MtmiR171b de
Medicago truncatula, traitées ou non par pulvérisation avec le MtmiPEP171b1 (0,1 µM) une première fois 12h avant prélèvement puis une seconde fois 30 minutes avant le prélèvement, il a été observé que le MtmiPEP171b1 peut être utilisé directement sous forme de peptide par le biais de pulvérisations foliaires (Figure 8).
[0448] Par ailleurs, il a été observé chez le tabac (comme chez
Medicago truncatula) que le MtmiPEP171b1 entraîne une augmentation de l'accumulation du mtmiR171b (Figure 9A) et du pre-MtmiR171b (Figure 9B), mais diminue l'accumulation du pri-MtmiR171b (Figure 9C).
[0449] L'ensemble de ces résultats indique que le mécanisme de régulation des microARNs et de leurs gènes cibles sous le contrôle de miPEPs est conservé entre les espèces.
b) Localisation intracellulaire du MtmiPEP171b1
[0450] Les feuilles de tabac ont été transformées pour surexprimer le MtmiPEP 171b1 de
Medicago truncatula fusionné à une protéine fluorescente (GFP) (Figure 10). Les résultats obtenus indiquent que le miPEP est localisé dans de petits corps nucléaires.
c) Identification de miPEPS à partir des bases de données
[0451] A partir des bases de données génomiques de plantes, il a été recherché la présence de cadres ouverts de lecture au sein des transcrits primaires de 70 miRs, nous avons identifié 101 miORFs susceptibles de coder un miPEP.
[0452] A l'heure actuelle, les AtmiPEP165a et AtmiPEP319a2, identifiés chez
Arabidopsis thaliana, ont déjà été caractérisés. Les expériences réalisées chez la plante modèle du tabac ont permis de démontrer que la surexpression de AtmiORF165a ou de AtmiORF319a entraîne respectivement une augmentation de l'accumulation du AtmiR165a ou du AtmiR319a (Figure 11).
[0453] miR165a régule des facteurs de transcription comme
Revoluta, Phavoluta et
Phabulosa. Le miR319 régule des gènes de la famille TCP.
EXEMPLE 3 - Caractérisation chez la plante modèle Arabidopsis thaliana
Exemple 3A - AtmiPEP165a
[0454] Concernant AtmiPEP165a, il a été démontré
in vivo chez
Arabidopsis thaliana que le traitement par le AtmiPEP165a entraine un phénotype de croissance racinaire très accélérée (Figure 12).
[0455] Par ailleurs, le traitement des plantes avec des concentrations de plus en plus importantes de miPEP165a indique un effet dose-dépendant de l'accumulation du miR165a et de la régulation négative de ses gènes cibles (PHAVOLUTA :
PHV, PHABOLUSA :
PHB et REVOLUTA :
REV) en fonction de la quantité de miPEP165A (voir figure 22).
Exemple 3B - AtmiPEP164a
[0456] Concernant AtmiPEP164a, celui-ci a été synthétisé et a été utilisé pour rechercher une augmentation de l'accumulation du miR164a chez des racines d'A.
thaliana traitées avec le peptide synthétique.
[0457] Les analyses par Northen blot indiquent que le traitement de la plante avec le peptide miPEP164a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR164a (Figure 23).
[0458] Le même type de résultat a été obtenu par qRT-PCR (Figure 30).
[0459] Il a également été démontré
in vivo chez
Arabidopsis thaliana que le traitement de la plante avec le AtmiPEP164a augmente significativement la croissance de la plante (Figure 24).
Exemple 3C - AtmiPEP165a
[0460] Concernant AtmiPEP165a, celui-ci a été synthétisé et a été utilisé pour rechercher une augmentation de l'accumulation du miR165a chez des racines d'A.
thaliana traitées avec le peptide synthétique.
[0461] Les analyses par Northen blot indiquent que le traitement de la plante avec le peptide miPEP165a entraîne une augmentation de l'accumulation du miR165a (Figure 25).
[0462] Par ailleurs, pour déterminer le mode d'action des miPEPs vis-à-vis de l'accumulation de leurs propres miRs, l'expression du pri-miR165a a été analysée chez des plantes sauvages et chez des plantes transformées pour surexprimer le miPEP165a (Figure 35).
[0463] L'expression du pri-miR165a est favorisée chez les plantes surexprimant le miPEP165a (Figure 36A).
[0464] En présence de cordycepine, un inhibiteur de la synthèse d'ARN, la quantité de pri-miR165a est identique chez les plantes sauvages et chez les plantes transformées (Figure 36B), ce qui indique que le miPEP165a n'agit pas comme un stabilisateur de l'ARN, mais plutôt comme un activateur transcriptionnel du pri-miR165a.
[0465] De plus, l'expression du pri-miR165a été analysée chez des plantes sauvages (plantes Col-0) et chez des plantes mutées portant un allèle faible de la seconde grande sous-unité de l'ARN polymerase II (plantes
nrpb2-3)
. Les résultats obtenus indiquent que les plantes mutées ne présentent pas d'augmentation de l'accumulation du pri-miR165 en réponse au miPEP165a, contrairement aux plantes sauvages. Ceci semble indiquer que le miPEP agit comme un régulateur transcriptionnel.
Exemple 3D - AtmiPEP319a1
[0466] Concernant AtmiPEP319a1, celui-ci a également été synthétisé et utilisé pour rechercher une augmentation de l'accumulation du miR319a chez des racines d'A.
thaliana traitées avec le peptide synthétique.
[0467] Les analyses par qRT-PCRindiquent que la surexpression du AtmiPEP319a1 entraîne une augmentation de l'accumulation du miR319a (Figures 26 et 31).
[0468] Il a également été démontré
in vivo chez
Arabidopsis thaliana que le traitement de la plante avec le AtmiPEP319a1 augmente significativement la croissance de la plante (Figure 27).
Exemple 3E - AtmiPEP160b1
[0469] Concernant AtmiPEP160b1, il a été démontré
in vivo chez
A. thaliana que la surexpression de ce miPEP entraine une accumulation du AtmiR160b (Figure 29).
Matériels et Méthodes
Matériel biologique
[0470] La surface des graines de
M. truncatula a été stérilisée et celles-ci ont été mises à germer sur des plaques d'agar pendant 5 jours à 4°C dans l'obscurité. Les jeunes pousses ont ensuite été cultivées sur des plaques carrées de 12 cm remplies de milieu Fahraeus sans nitrogène et contenant du phosphate 7,5 µM (
Lauresergues et al., Plant J, 72(3) :512-22, 2012). Les racines latérales ont été dénombrées chaque jour. En pots, les plantes ont été arrosées tous les deux jours avec du milieu Long Ashton modifié contenant peu de phosphore (
Balzergue et al., Journal of experimental botany, (62)1049-1060, 2011).
[0471] Les peptides ont été synthétisés par Eurogentec ou Smartox-Biotech. Le MtmiPEP171b1 a été remis en suspension dans une solution d'eau 40%/ acétonitrile 50%/ acide acétique 10% (v/v/v), et les autres peptides ont été remis en suspension dans de l'eau.
[0472] L'arrosage des feuilles par pulvérisations avec les peptides a été réalisé en utilisant des solutions de peptides à différentes concentrations (0,01, 0,1, 1 µM), une première fois 12h avant prélèvement puis une deuxième fois 30min avant prélèvement
Transcription inverse des microRNAs
[0473] L'ARN a été extrait en utilisant le réactif Tri-Reagent (MRC) selon les instructions du fabricant, à l'exception de la précipitation de l'ARN qui a été réalisée avec 3 volumes d'éthanol. La transcription inverse de l'ARN a été réalisée en utilisant l'amorce spécifique RTprimer171b tige boucle en combinaison avec des hexamères pour effectuer la transcription inverse de l'ARN de haut poids moléculaire.
[0474] En bref, 1 µg de RNA a été ajouté à l'amorce tige boucle MIR171b (0,2 µM), l'héxamère (500 ng), le tampon RT (1X), l'enzyme SuperScript Reverse transcriptase (SSIII) (une unité), les dNTPs (0,2 mM chacun), le DTT (0,8 mM) dans un mélange réactionnel final de 25 µl. Pour effectuer la transcription inverse, une réaction de transcription inverse pulsée a été réalisée (40 répétitions du cycle suivant : 16°C pendant 2 minutes, 42°C pendant une minute et 50°C pendant une seconde, suivies d'une inactivation finale de la transcription inverse à 85°C pendant 5 minutes).
Analyses par RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
[0475] L'ARN total des racines de
M. truncatula ou des feuilles de tabac a été extrait en utilisant le kit d'extraction RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). La transcription inverse a été réalisée en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen) à partir de 500 ng d'ARN total. Trois répétitions (n=3) ont été réalisées avec deux répétitions techniques chacune. Chaque expérience a été répétée de deux à trois fois. Les amplifications par qPCR ont été réalisées en utilisant un thermocycleur LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) selon la méthode décrite dans
Lauressergues et al. (Plant J., 72(3) :512-22, 2012).
Analyses statistiques
[0476] Les valeurs moyennes de l'expression relative des gènes ou de la production de racines latérales ont été analysées en utilisant le test de Student ou le test de Kruskal-Wallis. Les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM, Standard Error of the Mean). Les astérisques indiquent une différence significative (p<0,05).
Constructions plasmidiques
[0477] Les fragments d'ADN d'intérêt ont été amplifiés avec la Pfu polymerase (Promega). Les fragments d'ADN ont été clonés à l'aide des enzymes XhoI et NotI dans un plasmide pPEX-DsRED pour une surexpression sous le contrôle du promoteur fort constitutif 35S, et à l'aide des enzymes KpnI-NcoI dans un plasmide pPEX GUS pour les gènes rapporteurs, selon la méthode décrite dans
Combier et al. (Genes & Dev, 22 : 1549-1559, 2008).
Transformation des plantes
Northern blot
[0481] Les échantillons biologiques ont été homogénéisés dans un tampon contenant 0,1 M de NaCl, 2% de SDS, 50 mM de Tris-HCl (pH 9), 10 mM de EDTA (PH 8) et 20 mM de mercaptoéthanol, et l'ARN a été extrait 2 fois avec un mélange phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol.
[0482] L'ARN a été chargé sur gel PAGE 15% et transféré sur une membrane de nylon (HybondNX, Amersham). L'ARN a été hybridé avec une sonde d'oligonucléotides, radioactive marquée à son extrémité, pour détecter l'ARN U6 ou pour le miR164a.
[0483] Les hybridations ont été réalisées à 55°c. Les signaux d'hybridation ont été quantifiés en utilisant un phophorimager (Fuji) et normalisés avec le signal de la sonde spécifique de l'ARN U6.
Stabilité de l'ARN
[0484] Pour chaque condition, des plantes agées de 2 semaines et cultivées verticalement sur milieu MS solide ont été transférées dans des plaques 6 puits contenant 1 ml de milieu MS liquide. Après 16 heures d'incubation avec 1mM de miPEP, les plantes ont été traitées avec 100 µg/ml de cordycepine ou avec de l'eau (utilisée comme contrôle), et récoltées à différents moments pour extraire et quantifier l'ARN. Chaque expérience a été réalisée 3 fois.
Marquage histochimiques
Immunolocalisation
[0486] Des racines ou des plantules de tissus de Medicago ont été fixés pendant 2 heures dans 4% de formol (v / v) à 50 mM de tampon phosphate (pH 7,2), puis inclus dans de l'agarose LMP 5% dans de l'eau (à bas point de fusion). Des coupes fines (100 um) ont été obtenues et placées dans du Pbi (tampon phosphate pour l'immunologie) sur des lames coatées avec du téflon, bloquées dans Pbi, 2% Tween et 1% d'albumine de sérum bovin pendant 2 heures (PbiT-BSA), puis marquées épendant une nuit (12 h) à 4 ° C avec l'anticorps primaire dilué dans du BSA-PbiT. Les coupes ont été lavées avec du PBiT et incubées à température ambiante pendant 2 h avec un anticorps secondaire dilué dans PbiT-BSA. Les lames ont ensuite été lavées dans du Pbi pendant 30 min et montées dans du citifluor (milieu de montage). Les anticorps primaires et les dilutions ont été les suivants : 1716a (1 :500, v/v). L'anticorps secondaire était un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplé à la sonde fluorescente Alexa Fluor 633 (Molecular Probes), et a été utilisé à une dilution de 1 :1000 (v/v).
Western blot
B : Analyse des miPEPs chez l'animal
EXEMPLE 4 - Identification de candidats miPEPs chez la drosophile
a) Identification de candidats miPEPs
[0488] Une première étude réalisée par RACE-PCR chez l' animal modèle
Drosophila melanogaster montre l'existence de miRs qui sont exprimés au cours de l'embryogenèse, miR1 et miR8.
[0489] Comme chez les plantes, il a été identifié des miORFs dans chacun des deux miRs étudiés. Par exemple, le miR8, connu pour son rôle dans la régulation de la croissance des insectes, présente un miORF codant potentiellement le miPEP8.
[0490] Le DmmiR1 (identifié chez
Drosophila melanogaster) présente quant à lui deux DmmiORFs codant potentiellement le DmmiPEP1a et le DmmiPEP1b.
[0491] Une analyse phylogénétique montre la conservation évolutive de la présence des miORFs à travers la douzaine d'espèces de drosophile analysées, c'est à dire depuis leur divergence il y a plus de 60 millions d'années (Figure 13).
[0492] Les miPEPs identifiés chez la drosophile présentent par ailleurs plusieurs similitudes avec les miPEPs de plante. Si leur séquence primaire et donc leur taille évoluent rapidement entre espèces, on retrouve une taille réduite (de 32 à 104 aa), ainsi qu'une forte conservation pour une charge globale basique (pHi de 9,5 à 12) (Figure 14).
[0493] L'ensemble de ces résultats indiquent donc l'existence de miPEPs régulateurs, codés par les transcrits primaires des microRNAs, à travers un large spectre d'espèces eucaryotes. Ces peptides découverts représentent un réservoir encore inexploré de molécules naturelles, susceptibles de réguler une variété de fonctions biologiques fondamentales, aussi bien chez les végétaux que chez les animaux.
b) Expression des miPEPS
[0494] Des cellules de
Drosphila melanogaster ont été transfectées pour surexprimer le DmmiPEP8 (à partir de la séquence SEQ ID NO : 494) ou bien le DmmiPEP8 mt dont les codons d'initiation de traduction ont été mutés (à partir de la séquence SEQ ID NO : 495). Comme contrôle de transfection, un plasmide produisant la protéine moesin-RFP a été co-transfecté avec les plasmides codants les DmmiPEP8 et DmmiPEP 8 mt. On constate que les codons initiateurs présents dans la séquence DmmiPEP8 sont fonctionnels puisqu'ils permettent la synthèse d'une protéine de fusion miPEP::GFP visualisée par la GFP alors que les constructions mutées sur les ATG ne produisent quasiment plus de GFP.
[0495] Ces résultats suggèrent donc que l'ORF du miPEP est fonctionnel (Figure 38).
Matériels et Méthodes
Cellules de Drosophila melanogaster
[0496] Les cellules S2 sont cultivées dans un flask T75 dans 12mL de milieu Schneider's (GIBCO), contenant 1% de pénicilline 100U/mL et streptavidine 100mg/mL (Sigma) et 10% de sérum de veau foetal décomplémenté (30' à 56°C).
[0497] Les transfections transitoires sont réalisées à l'aide du kit de transfection FuGENE
® HD (Roche), selon leurs recommandations. Classiquement, 1,5 millions de cellules S2, préalablement ensemmencées dans des plaques 6 puits (3ml de milieu par puit), sont transfectées avec 250 ng d'ADN plasmidique total. L'ADN est mis en contact avec le Fugene (3 µl) dans 100 µl d'OPTIMEM (GIBCO). Apres 20 minutes, le réactif de transfection formé est mis en contact avec les cellules dans le milieu de culture. L'ARN des cellules est extrait 66h après transfection.
Clonage des fragments codant DmmiPEP8 et DmmiPEP8 muté
C : Caractérisation de miPEPs chez l'homme
EXEMPLE 5 - Caractérisation du HsmiPEP155
[0499] Les fragments d'ADN d'intérêt (le HsmiPEP155 et le miPEP muté) ont été synthétisés ou amplifiés par PCR à l'aide d'amorces spécifiques, puis clonés à l'aide des enzymes XhoI et NotI dans un plasmide pUAS permettant leur surexpression par le biais du facteur de transcription GAL4 dont l'expression est contrôlée par un promoteur fort constitutif.
[0500] Les différentes constructions ont été réalisées soit par amplification PCR sur de l'ADN génomique de cellules HeLa, soit par RT-PCR sur des ARN totaux de cellules humaines L428. Les fragments PCR amplifiés sont digérés par les enzymes de restriction HindIII/EcoRI puis clonés dans le vecteur pcDNA3.1. La souche
d'Escherichia coli DH5α est électroporée puis cultivée sur un milieu solide (2YT+agar+Ampicilline). L'ADN plasmidique de différents clones est alors préparé et séquencé pour vérification. Les constructions sont ensuite préparées à l'aide du QIAfilter Plasmid Midi kit (QIAGEN) et conservées à -20°C.
[0501] Les cellules HeLa (lignée tumorale établie, ATCC CCL-2.2) sont cultivées en plaque 6 puits dans du milieu complet [(DMEM (1x) +Glutamax +4.5g/L glucose sans pyruvate + 1x Pénicilline/Streptomycine + 1mM Na-pyruvate + 10% sérum de veau] et placées dans un incubateur à 37°C et 5% de CO2.
[0502] Les cellules sont transfectées lorsqu'elles sont à 50% de confluence. En début d'expérience, le milieu complet contenant les antibiotiques est remplacé par du milieu complet sans antibiotique.
[0503] Pour chaque puit, un mix A [250µl d'Optimem (+Glutamax) (Gibco) + 2µg d'ADN] et un mix B [250µl d'Optimem + 4µl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen)] est préparé, on laisse 5' à température ambiante. Puis le mix B est mélangé dans le mix A goutte à goutte, et laissé à incuber à 25' à température ambiante. Le mélange est alors déposé dans le puit, goutte à goutte. 4-5 heures après, le milieu est changé et remplacé par du milieu complet avec antibiotiques. 48 heures après transfection, les cellules sont arrêtées. Le milieu est aspiré et éliminé, les cellules sont rincées au PBS 1X. Il est alors possible de garder les cellules à - 20°C ou d'extraire directement les ARN totaux.
[0504] Pour chaque puit, les ARNs sont extraits en déposant 1ml de Tri-Reagent (Euromedex) sur les cellules. On aspire et refoule plusieurs fois le Tri-reagent afin de lyser correctement les cellules, puis on le transfère dans un tube de 1,5 ml. On rajoute 0,2 ml de chloroforme saturé en eau. On mélange par vortex, puis on laisse 2 à 3 minutes à température ambiante. On centrifuge 5 minutes à 15300rpm et à 4°C. La phase aqueuse est précipitée avec 0,5 ml d'isopropanol après une incubation de 10 minutes à température ambiante et une centrifugation de 15 minutes à 15300rpm et à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est rincé avec 1ml d'Ethanol 70% et centrifugation de 5 minutes à 15300rpm à 4°C. De nouveau on élimine le surnageant et le culot est séché quelques minutes à l'air.
[0505] Afin d'éliminer au mieux l'ADN génomique potentiellement restant, les ARNs sont traités à la DNase. Pour cela, le culot est resuspendu dans 170µl d'eau ultra pure, 20µl de tampon DNase 10x et 10µl de RQ1 RNase free-DNase et placé 30 minutes à 37°C. Puis, on rajoute 20µl de SDS10% et 5µl de protéinase K (20mg/ml) durant 20 minutes à 37°C.
[0506] Une dernière extraction phénol est réalisée avec 225µl d'un mélange Phénol/H
2O/Chloroforme, et centrifugée pendant 5 minutes à 15300 rpm à 4°C.
[0507] La phase aqueuse est alors précipitée avec 20µl de Sodium Acetate 3M et 600µl d'Ethanol 100% pendant 20 minutes à -80°C. Puis, on centrifuge 15' à 4°C à 15300rpm. On élimine le surnageant. On rince le culot dans 1ml d'Ethanol 70%, on centrifuge 5' 15300rpm 4°C, on élimine de nouveau le surnageant et on laisse quelques minutes le culot sécher à l'air.
[0508] Le culot est ensuite repris dans 15-20 µl d'eau ultra pure et les ARNs sont dosés.
[0509] 10-15µg d'ARN totaux sont ensuite analysés par Northern Blot sur un gel 15% acrylamide [solution d'acrylamide/bis-acrylamide 40%, ratio 19 :1], 7M Urée en TBE 1x. La migration est réalisée à 400V, dans du TBE1x comme tampon de migration, après avoir pré-chauffé le gel. Les ARN sont ensuite électro-transférés sur une membrane de nylon Biodyne Plus 0.45µm, pendant 2heures, à 1V et 4°C dans une cuve de transfert. A la fin du transfert, la membrane est irradiée aux UV à 0,124 J/cm2. La membrane est ensuite pré-hybridée dans un tampon 5xSSPE, 1xDenhardt's, 1%SDS et 150µg/ml de d'ARNt de levure, 1heure à 50°C dans un four à hybridation. Puis, on rajoute la sonde nucléotidique marquée en 5' au γ-
32P-ATP (0.5 à 1.10
6cpm/ml de tampon d'hybridation) et on hybride la nuit à 50°C. La membrane est alors lavée 2 fois dans du 0.1xSSPE/0.1%SDS à température ambiante et exposée dans une cassette d'autoradiographie contenant un ecran BioMax HE (Kodak) et un film BioMax MS (Kodak), pour détecter un microARN, durant 24-48 heures, à -80°C.