[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ungulatenembryonen.
[0002] Tiere, insbesondere Nutztiere, werden vom Menschen seit langem für die verschiedensten
Zwecke weitergezüchtet und im Hinblick auf bestimmte Eigenschaften fortentwickelt.
So wurden beispielsweise Kühe und Stiere mit hohem Zuchtwert für Milchleistung weiterverpaart,
um Tiere mit hohem Milchertrag zu erhalten.
[0003] In den letzten Jahren gerieten Tiere, insbesondere Vertreter der Ungulaten, wie Schafe,
Rinder bzw. Kühe auch als Produktionsstätten ernährungsphysiologisch bzw. pharmazeutisch
bedeutender Stoffe in den Mittelpunkt des Forschungsinteresses, da es mit der Entwicklung
der Gentechnologie möglich wurde gezielt Tiere herzustellen, denen eine neue Eigenschaft,
beispielsweise die Fähigkeit zur Produktion eines bestimmten Arzneimittels, verliehen
werden konnte. Das Problem bei der wirtschaftlichen Nutzung derartiger Tiere besteht
jedoch darin, daß das ihnen transferierte Genkonstrukt integriert und stabil an die
Nachkommen weitergegeben wird.
[0004] Zu diesem Zweck wurde versucht, das Problem des Gentransfers dadurch zu lösen, daß
dieser in Zellen vorgenommen wird, wobei aus diesen Zellen mittels Klonierung wieder
Tiere generiert werden.
[0005] In der Fachwelt wird der Begriff des "Klonierens" allgemeinen als Vervielfältigung
eines genetischen Materials, abgeleitet von einer einzigen Zelle definiert, was übertragen
auf die Embryologie als Erstellung von Embryonen bzw. Tieren mit identischem Genotyp
verstanden werden kann. In der Embryologie wird der Keimling während der Blastogenese,
also bis zur Entwicklung der Anlage von Primitivorganen als Embryo, in den nachfolgenden
Entwicklungsstufen als Fetus bezeichnet. Embryonale Phasen verlaufen je nach Spezies
in unterschiedlich langen Zeiträumen ab, so beispielsweise beim Rind in einem Zeitraum
von etwa 4 Wochen; wobei bei anderen Spezies innerhalb der Ungulaten kürzere oder
auch längere Zeiträume dafür erforderlich sein können.
[0006] Zur Klonierung von Tieren, also zur Vervielfältigung eines einem bestimmten Tier
eigenen Genotyps wurden bis dato mehrere Wege beschritten.
[0007] Einerseits wurden frühe Embryonalstadien und Fortentwicklungen einem mikrochirurgischen
Eingriff unterworfen und die jeweils daraus isolierten Teile wurden in vitro bzw.
in vivo weitergezüchtet.
[0008] Weiter wurde eine als "Chimäres Klonen" bezeichnete mikromanipulatorische Kombination
asynchroner Entwicklungsstadien durchgeführt, bei der Blastomere(n) aus Embryonen
weiter fortgeschrittener Stadien mit Blastomeren aus früheren Stadien zusammengebracht
wurden, mit dem Ziel, die erstgenannten in ihrer Weiterentwicklungskapazität zu unterstützen
und somit identische Viellinge zu erzeugen. Die größte Anzahl damit erhaltener Klone
lag jedoch lediglich in einer Größenordnung von maximal 5-8.
[0009] Eine weitere Vorgehensweise war die parthenogenetische Aktivierung oder die Verpaarung
homozygoter Elterntiere, um hinsichtlich bestimmter Eigenschaften Klone zu erhalten.
[0010] Da sich die oben genannten Verfahren hinsichtlich Ihrer Effektivität und Zuverlässigkeit
jedoch als relativ schlecht erwiesen, wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, das
generell als Kerntransfer bezeichnet wird.
[0011] Dabei werden Zellkerne, die von mehrzelligen Embryonen stammen, in entsprechend vorbereitete
Eizellen überführt, wobei genetisch identische Embryonen erstellt werden konnten.
[0012] Um eine Klonierung mittels Kerntransfer erfolgreich durchführen zu können, müssen
jedoch einige unabdingbare Parameter berücksichtigt werden.
[0013] Die Eizelle, die als Empfängerzelle eingesetzt wird, muß das Metaphase-Stadium in
der 2. Reifeteilung (Metaphase II) vollendet haben und soll keine eigene nukleare
DNA mehr enthalten, d.h. sie soll als sogenannte enukleierte Eizelle vorliegen. Des
weiteren sollte das Cytoplasma der Eizelle so wenig wie möglich beeinflußt werden,
da die in dem Cytoplasma selbst enthaltenen Stoffe für die Weiterentwicklung, beispielsweise
die Teilung der Zelle, von Bedeutung sein können.
[0014] Weiterhin muß die nukleare DNA des übertragenen Kerns reprogrammiert werden. Da der
(Spender-) Kern von einem mehrzelligen Embryo stammt, hat die jeweilige Spenderzelle
bereits einige Teilungszyklen durchlaufen. Dies bedeutet, daß sich die Zelle in einem
gegenüber einer totipotenten befruchteten Eizelle fortgeschrittenen Entwicklungsstadium
befindet, in dem möglicherweise bereits bestimmte, für die frühe Entwicklung erforderliche
Gene abgeschaltet sind.
[0015] Aus diesem Grund muß die verwendete Kern-DNA derart reprogrammiert werden, daß die
vollständige genetische Information der Kern-DNA wieder zur Verfügung steht und das
Teilungsschema des Embryos wieder beim Stadium der Zygote beginnt. Je besser somit
diese Reprogrammierung bzw. Aktivierung erreicht werden kann, desto höher liegt die
Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Klonierung, mit der dann auch ein fertig entwickeltes,
d.h. lebend geborenes geklontes Tier erhalten werden kann.
[0016] Neben der Kern-DNA ist u.a. auch die in dem Cytoplasma vorhandene mRNA von Bedeutung,
da diese im Zeitpunkt der Vereinigung von Eizelle und Spenderzelle die für das gegenwärtige
Entwicklungs- bzw. Differenzierungsstadium der Spenderzelle erforderlichen Botschaften
darstellt und die damit hergestellten Proteine einen Einfluß auf die weitere Entwicklung
der Zelle nehmen können.
[0017] Das Verfahren des Kerntransfers wurde bereits mit bescheidenem Erfolg eingesetzt.
So berichteten Willadsen et al. (Nature
320 (1986), 63-65) über die Klonierung von Lämmern, wobei die Kerne aus Kern-Spenderzellen
aus dem 8-Zell-Stadium stammten. Robl et al. (J. Anim. Sci.
64 (1987), 642-647) berichteten über die ersten Kerntransferexperimente beim Rind, wobei
ausschließlich mit ex vivo gewonnenen Rinderembryonen als Kernspender gearbeitet wurde.
Bei diesen Versuchen war immer eine in vivo Zwischenkultur in Schafeileitern erforderlich.
In den folgenden Jahren konnte auch gezeigt werden, daß das Embryonalklonen beim Rind
rein in vitro, also unter Verwendung von in vitro produzierten Embryonen und in vitro
gereiften Eizellen, erfolgreich durchgeführt werden kann (Sims et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA
91 (1991), 6143-6147).
[0018] In der WO 97/07668 wird weiter ein Verfahren zur Wiederherstellung eines tierischen
Embryos beschrieben, bei dem generell ein Kern mit einem diploiden Chromosomensatz
in eine enukleierte Eizelle überführt wird, die in dem Metaphasenstadium II gehalten
wird, wobei die Eizelle beim Einbringen des Kerns erst nach einer gewissen Zeit aktiviert
wird. Durch später erfolgende Aktivierung der Eizelle nach Einbringen der Kern-DNA
soll eine verbesserte Reprogrammierung der eingebrachten Kern-DNA erreicht werden.
[0019] Die WO 97/0669 betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Wiederherstellung eines tierischen
Embryos, bei dem der Kern einer "quiescent" (ruhenden) Donorzelle in eine geeignete
Empfängerzelle transferiert wird. Gemäß dieser Druckschrift wird es als erforderlich
angesehen, daß die Donorzelle vor Vereinigung mit der Empfängerzelle in der G0-Phase
festgesetzt wird, was durch Hungern der Zellen oder Kontaktinhibition erreicht werden
kann.
[0020] Schnieke et. al. (Science 278, 2130-2133, 1997) berichten über humane Faktor-IX transgene
Schafe, die durch den Kerntransfer transformierter fetaler Fibroblasten erzeugt wurden.
Dazu wurden geklonte Transfektanten als Spender für den Kerntransfer auf enukleierte
Eizellen verwendet. Das genomische Konstrukt für den humanen Koagulationsfaktor IX
war derart konstruiert, dass es in der Schafsmilch exprimiert wurde.
[0021] Wilmut et al. (Nature, 385, 810-813, 1997) beschreiben die Verwendung ruhender differenzierter
Zellen für den Kemtransfer in eine geeignete Empfängerzelle. Implantation in ein Muttertier
führte zur Geburt eines lebenden Lamms, was darauf hinwies, dass die Differenzierung
von Zellen keine irreversiblen Veränderungen des genetischen Materials zu Folge hat,
das zur Entwicklung erforderlich ist.
[0022] Cibelli et al. (Science, 280, 1256-1258, 1998) berichten die Erzeugung klonierter
transgener Kälber aus nicht ruhenden "non-quiescent" fetalen Fibroblasten. Dazu wurden
sich aktiv teilende fetale Fibroblasten genetisch verändert und mit enukleierten reifen
Eizellen fusioniert. Beim Transfer von 28 Embryonen auf 11 Empfängerkühe wurden 3
gesunde, identische transgene Kälber erzeugt.
[0023] In der WO 98/30683 wird ein Verfahren beschrieben, das Kerne differenzierter Spenderzellen
in enukleierte Eizellen bereitstellt. Die sich daraus ergebenden Kerntransfereinheiten
werden zur Vermehrung von Genotypen und transgenen Genotypen durch Erzeugen von Feten
und Nachkommen und zur Erzeugung isogener CICM-Zellen, einschließlich humaner isogener
embryonaler Zellen oder Stammzellen, eingesetzt.
[0024] Die WO 99/01163 beschreibt ein Verfahren, das Kerne nicht serumgehungerter Spenderzellen
nutzt, um sie in enukleierte Eizellen der gleichen Art einzubringen. Die sich daraus
ergebenden Kerntransfereinheiten werden zur Vermehrung von Genotypen und transgenen
Genotypen durch Erzeugen von Föten und Nachkommen und zur Erzeugung isogener CICM-Zellen,
einschließlich humaner isogener embryonaler Zellen oder Stammzellen, verwendet.
[0025] Ein Problem bei dieser Technologie besteht jedoch immer noch darin, geeignete Spender-Zellen
für den Kerntransfer zu finden, mit der sich ein tierischer Embryo am zweckmäßigsten
und wirtschaftlichsten herstellen läßt. Bekanntermaßen stellt die Reprogrammierung
der Kern-DNA aus der jeweils gewählten Spenderzelle die größte Schwierigkeit bei der
Embryoklonierung dar, da diese nicht nur Einfluß hat auf die weitere frühe Reifung
des Embryos, sondern auch auf die spätere Entwicklung nach einer gegebenenfalls durchgeführten
Einpflanzung in ein Muttertier. So bestehen trotz aller Erfolge auf diesem Gebiet
immer noch Probleme hinsichtlich einer effektiven Reprogrammierung der Spender-Kern-DNA,
um die manipulierte Eizelle mit neuem Kern dem Zustand einer natürlichen Zygote anzunähern.
Dies drückt sich u.a. in einer äußerst geringen Ausbeute hinsichtlich der Gewinnung
embryonaler Blastozysten und einer geringen Teilungsrate aus.
[0026] Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die Nachteile des Standes
der Technik zu überwinden und eine geeignete Kern-Spenderzelle zur Verfügung zu stellen,
mit der ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ungulatenembryonen bereitgestellt
werden kann.
[0027] Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Ungulatenembryosen,
bei dem als Spenderzelle für den Kerntransfer fetale Fibroblasten eines Ungulaten
aus einer sub-konfluenten Primärkultur eingesetzt werden. Der Kern dieser Zelle wird
mit einer geeigneten Empfängerzelle zusammengebracht wobei der fetale Fibroblast vor
der Vereinigung nicht durch externe Manipulation in der G0 Phase festgesetzt wird,
um einen Karyoplast-Zytoplast-Komplex (KZK) zu erzeugen. Die Aktivierung des KZK erfolgt
i) durch Inkubation des KZK für 5 Minuten in 7%igen Ethanol, ii) Inkubation des KZK
aus i) für 5 Stunden in 10µg/ml Cycloheximid und 5µg/ml Cytochalasin B, und die so
erhaltene Zelle wird für einen Zeitraum gezüchtet, damit sich eine Morula bildet.
Die daraus erhältliche Morula kann dann gegebenenfalls zum Klonieren wiederverwendet
werden.
[0028] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Empfängerzelle
eine enukleierte Eizelle, in die der Kern des fetalen Fibroblasten zum Kerntransfer
eingebracht werden kann oder mit der der fetale Fibroblast selbst fusioniert wird.
[0029] Die Tiere, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, sind
Ungulaten, insbesondere Schweine, Schafe, Ziegen, Rinder bzw. Kühe.
[0030] In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in dem Verfahren eingesetzten fetalen
Fibroblasten transgen, d.h. sie enthalten ein oder mehrere Gene, die entweder von
einer exogenen Quelle abgeleitet sind oder die ein endogenes, an einen anderen, nicht
natürlichen Locus im Genom eingebrachtes Gen darstellen. Diese Gene codieren vorzugsweise
für ein Arzneimittel, beispielsweise einen Antikörper oder einen ernährungsphysiologisch
interessanten Stoff, beispielsweise Chymosin oder Trypsin, wobei die Gene jeweils
unter der Kontrolle eines oder des endogenen oder eines exogenen Promotors liegen
können.
[0031] Zur Gewinnung fetaler Fibroblasten werden Feten aus graviden Ungulaten gewonnen,
beispielsweise durch einfaches Zerkleinern des Fetus. Die aus dem Fetus gewonnen Zellen
werden sodann auf die gewünschten fetalen Fibroblasten selektiert, wie beispielsweise
durch Anhaftenlassen an das Kulturgefäß und Abtrennen des Überstandes oder durch mechanische
Selektion mittels einer Pipette. Fetale Fibroblasten lassen sich aufgrund ihres Phänotyps
von anderen Zellen leicht unterscheiden.
[0032] Für die nachfolgenden Schritte kann der gewonnene fetale Fibroblast als solcher eingesetzt
werden, oder der Kern kann daraus isoliert und weiterverwendet werden.
[0033] Als Empfängerzellen werden in der Regel enukleierte Eizellen eingesetzt, die in vivo
oder in vitro gereift sind. So können beispielsweise in vitro gereifte, unbefruchtete
Eizellen eingesetzt werden, bei denen nach Erreichen der Metaphase II die umgebenden
Cumuluszellen entfernt wurden.
[0034] Die Empfängerzelle soll vorzugsweise keine eigene Kern-DNA aufweisen. Für die Entfernung
der Eizell-DNA sind im Stand der Technik mehrere Möglichkeiten vorhanden, wie beispielsweise
die Trennung der Eizelle in zwei Hälften, von denen eine Hälfte keinen Kern mehr aufweist
und weiterverwendet werden kann, oder eine Bestrahlung mit ultraviolettem Licht zur
Zerstörung der zelleigenen DNA. Eine Entfernung des Kerns bzw. der Pro-Nuclei oder
der Metaphasen-Platte mittels Mikromanipulation ist ebenfalls möglich. Als bevorzugt
hat sich eine Behandlung der Eizellen vor der Mikromanipulation mit Cytochalasin B
mit anschließendem Absaugen des in der Nähe des Polkörpers liegenden Zytoplasmas mit
Hilfe einer Pipette, beispielsweise mit einem Leitz-Micromanipulator (Leica, Bensheim,
Deutschland) geführt, erwiesen. Da die Kern-DNA der Eizelle zu diesem Zeitpunkt in
der Nähe der Polkörperchen lokalisiert ist, ist die Enukleationsrate bei dieser Methode
sehr hoch, wobei gleichzeitig nur ein kleiner Teil des Cytoplasmas mit abgesaugt wird.
[0035] Nach Gewinnen der jeweils beim Kerntransfer beteiligten Zellen können generell zwei
Wege beschritten werden. Der Kern des fetalen Fibroblasten wird anhand im Stand der
Technik bekannter und etablierter Verfahren isoliert und in die vorbereitete Empfängerzelle
eingebracht, wie beispielsweise mittels Injektion oder der fetale Fibroblast selbst
wird mit der Empfängerzelle fusioniert.
[0036] Bei einer Fusion kann ein fetaler Fibroblast mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung,
wie einer Transferpipette unter die Zona pellucida der enukleierten Eizelle geschoben
und dort abgesetzt werden. Zur Integration des Zellkerns des fetalen Fibroblasten
in das Zellplasma der Eizelle wird die Membran der Fibroblast mit der Membran der
Eizelle fusioniert. Techniken zur Fusion von Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt,
beispielsweise Fusion unter Verwendung des Sendai-Viruses, Behandlung mit PEG (Polyethylenglycol),
Laserfusion oder Elektroschock. Die letztgenannte Methode, die sogenannte Elektrofusion,
bei der durch gegebenenfalls mehrmalige, beispielsweise 2 bis 10 mal, kurzzeitige
Gleichstrompulse von etwa 1 bis 5 kV/cm, vorzugsweise 1 bis 3 kV/cm, mit einer jeweiligen
Dauer von 2 µsek. bis 1 sek., Poren induziert werden, die ein Zusammenfließen des
Zytoplasmas ermöglichen, ist in dem vorliegenden Verfahren bevorzugt, da die elektrischen
Pulse bei geeigneter Stärke gleichzeitig eine Aktivierung der (fusionierten) Eizelle
mit sich bringen können. Die Aktivierung kann auch einige Stunden (ca. 2-5 Std.) nach
der Fusion erfolgen, beispielsweise durch eine Inkubation der fusionierten Zelle in
einer 7 %igen Alkohollösung, vorzugsweise einer 7 %igen Ethanollösung, oder anhand
anderer im Stand der Technik bekannten Verfahren.
[0037] Die Aktivierung der fusionierten Zelle ist ein wichtiger Schritt, da sie die Voraussetzung
für das Ingangkommen der Teilungsaktivität des Fusionsproduktes ist. Nach erfolgter
Fusion und Aktivierung werden die Fibroblasten-Eizellenkomplexe (Kerntransferembryonen)
gezüchtet, bis sie ein Stadium erreichen, in dem sie gegebenenfalls auf einen Empfänger
transferiert werden können. Dabei können dem verwendeten Kulturmedium nach Wahl Stoffe
zugesetzt werden, die die Aggregation von Mikrotubuli unterstützen oder inhibieren.
Nocadazol sowie Colcemid sind Beispiele für die Aggregation inhibierende Mittel, Taxol
ist ein Mikrotubuli-Stabilisator. Diese Stoffe verhindern eine gegebenenfalls auftretende
Bildung mehrerer Pro-Nuclei.
[0038] Bei den bestehenden Verfahren des Standes der Technik mußten zur weiteren Züchtung
der sich bildenden Embryonen diese sorgfältig in einen Zwischenempfänger überführt
werden. Dies wurde im allgemeinen dadurch erreicht, daß der Embryo in einem schützenden
Medium, wie Agar, verpackt in die Eileiter eines "einstweiligen Muttertiers" (temporärer
Empfänger) überführt wurde, in dem eine weitere Entwicklung bis zur Einpflanzung in
das (endgültige) Muttertier erforderlich war. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es jedoch auch möglich bestehende in-vitro-Systeme für die Kultivierung einzusetzen
ohne dabei die Ausbeuten zu verschlechtern. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein,
könnte diese Tatsache mit der getroffenen Auswahl der Spenderzelle einhergehen, mit
der Embryonen erhalten werden können, die hinsichtlich Ihrer Entwicklung natürlich
erzeugten Embryonen sehr nahe kommen. Die Zellen werden für einen Zeitraum in Kultur
gehalten, bis sich Blastozysten bilden. Dies umfaßt einen Zeitraum von bis zu 10 Tagen,
vorzugsweise 6 bis 7 Tagen.
[0039] Die fetalen Fibroblasten zum Einsatz in dem erfindurigsgemäßen Verfahren können aus
einer Vielzahl von Ungulaten gewonnen werden wie beispielsweise Rinder, Schafe, Ziegen,
Büffel, Kamele sowie Schweine. Am meisten bevorzugt sind Schafe bzw. Kühe.
[0040] Um die Isolierung des Genprodukts zu erleichtern kann das Genprodukt in ein Produkt
des Tieres selbst gerichtet werden, bei Kühen bzw. Schafen beispielsweise in die Milch
Dies kann durch Wahl geeigneter Promotoren zur organspezifischen Expression erreicht
werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Das Genprodukt kann jedoch gleichermaßen
aus dem Tier selbst gewonnen werden, beispielsweise aus dem Serum. Auch ist es möglich,
daß das/die Organ(e)/Gewebe der Tiere das gewünschte Produkt darstellen, wobei, beispielsweise
für eine (Xeno-)Transplantation.
[0041] Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten fetalen Fibroblasten bzw. die
Feten oder Tiere, von denen sie abgeleitet sind, können darüber hinaus transgen sein,
wobei das Transgen vorzugsweise für ein ernährungsphysiologisch oder pharmazeutisch
interessantes Produkt, beispielsweise einen Antikörper codiert. Beispielsweise können
bei Kühen oder Schafen die Gene für Chymosin oder Trypsin in ein Konstrukt eingebaut
werden, das die Produktion des entsprechenden Enzyms, bzw. eines seiner Vorläufer
in der Milch des Tieres ermöglicht. Das Transgen von Interesse kann dabei, je nach
Wunsch, unter der Steuerung eines exogenen, ebenfalls transgenen Promotors liegen,
oder ein bekannter endogener Promotor kann für diesen Zweck eingesetzt werden.
[0042] Eine ganze Reihe von Proteinen wird bislang aus tierischen Organen durch Aufreinigung
aus diesen Organen gewonnen und dann in der Medizin oder Technik eingesetzt. Probleme
dabei bestehen u.a. hinsichtlich der relativen Mengen, in denen sie in diesen Geweben
vorhanden sind (beispielsweise FSH aus Hypophysen), was zu hohen Produktionskosten
führt, da zur Gewinnung einerseits eine große Menge an Ausgangsmaterial, d.h. viele
Tiere, erforderlich sind, was aufgrund der Vielzahl von Tieren die Gefahr einer Kontamination,
mit beispielsweise Krankheitserregern, wie BSE oder Ehec, mit sich bringt.
[0043] Beispiele für interessierende Proteine aus Tierorganen sind Aprotinin aus der Lunge,
Chymosin aus dem Magen, Katalase aus der Leber, Elastase, Pankreatin, Insulin oder
Trypsin aus dem Pankreas, Hyaluronidase aus Hoden, Chondroitin aus Trachea, Kollagene
aus der Haut, Fibronectin oder Vitronectin aus Plasma, Epithelial Cell Growth suppl.
oder LH (Luteinisierendes Hormon) aus der Hypophyse, Fibroblast growth factor oder
Ganglioside aus dem Hirn, sowie Hämoglobin, Thrombin, Transferrin usw.. Diese Aufzählung
ist nicht als Einschränkung anzusehen.
[0044] Für alle diese Produkte kann eine ektotope Expression, d.h. eine Expression in einem
anderen Gewebe, beispielsweise in der Milchdrüse erreicht werden, wenn in den für
die Klonierung verwendeten Zellen vorher entweder ein additiver Gentransfer durchgeführt
wurde, beispielsweise über Injektion, Transformation, Transfektion oder anhand eines
anderen im Stand der Technik bekannten Verfahrens, wobei ein in vitro rekombiniertes
Genkonstrukt zusätzlich ins Genom integriert wird. Darüber hinaus kann durch homologe
Rekombination in den Zellen erreicht werden, daß das endogen vorhandene Gen mit einem
Promotor gekoppelt wird, der für dieses Strukturgen ein anderes Expressionsmuster
ergibt, beispielsweise Produktion von Chymosin im Euter mit einhergehender Sezernierung
in die Milch anstelle der endogenen Synthese im Magen. Weiter kann ein endogen vorhandener
Promotor, beispielsweise der Casein- oder Lactoglobulin-Promotor mit einem neuen Strukturgen
gekoppelt werden, so daß für die Expression optimale Bedingungen vorliegen. In beiden
vorstehend aufgeführten Fällen können Promotor und Strukturgen, die homolog in das
Genom hinein rekombiniert werden, vorab aus einer Genbank isoliert werden, die beispielsweise
aus fetalen Fibroblasten gewonnen worden ist, so daß nicht nur spezieseigene DNA (Selbstklonierung)
eingesetzt wird, sondern es sich auch um isogene DNA handelt.
[0045] Auf diesem Weg kann daher die Zusammensetzung von Nahrungsmitteln, die aus tierischen
Produkten, wie beispielsweise Milch, gewonnen werden, in gewünschter Weise verändert
werden, so daß diese positive alimentäre, dietätische, gesundheitsfördernde Eigenschaften
oder ein geringeres allergenes Potential, bessere Lagerungsstabilität oder Verarbeitungseigenschaften
aufweisen. So kann beispielsweise Milch mit Ehec-Antikörpern oder Milch mit speziell
auf Erkrankungen, wie beispielsweise Leaktoseintoleranz, abgestimmten Eigenschaften
hergestellt werden.
[0046] Darüber hinaus können durch Verwendung von MACs (Mammalian artificial Chromosomes)
Integrationsmutationen vermieden und große DNA-Fragmente transferiert werden. Dieses
MACs werden als zusätzliche Mini- bzw. Mikrochromosomen im Kern genauso repliziert,
wie die endogenen Chromosomen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, über die Spezies
hinweg Gencluster zu transferieren, beispielsweise komplette Immunglobulin-Gencluster
des Menschen auf Nutztiere. wobei dieses Nutztier dann in der Lage wäre, humane Antikörper
zu produzieren, die gewonnen und genutzt werden könnten. Der Transfer bestimmter MACs
aus der eigenen Spezies führt weiter dazu, daß bei additiven Geneffekten eine Erhöhung
der Synthese des Genprodukts folgern würde.
[0047] Wichtig ist auch eine Expression homologer Proteine, bzw. auch Geweben oder Organen
in Nutztieren, bei Proteinen in den gleichen Organen, in denen diese Proteine auch
beim Menschen exprimiert werden. Die Proteine werden dann anhand im Stand der Technik
bekannter Verfahren gewonnen, die Gewebe bzw. Organe vor einer eventuellen Transplantation
aus dem Tier entnommen. Der Vorteil dieser Vorgehensweise besteht in einer hohen Identität
der exprimierten Proteine, da sie im richtigen Organ prozessiert bzw. post-translational
modifiziert werden, beispielsweise Expression von Erythropoietin in der Niere. Die
führt dazu, daß die aus den unterschiedlichen Geweben gewonnenen Proteine die gleiche
Glycosylierung aufweisen, wie die Stoffe im Menschen selbst, wobei deren Aktivität
der des natürlichen Proteins sehr nahe kommt. So können transgene Tiere, beispielsweise
Schweine, Rinder usw. erhalten werden, die menschliches Insulin, Erythropoietin usw.
produzieren, die in der Medizin dann besser genutzt werden können.
[0048] Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist neben Umgehung des Erfordernis die
Zellen in die G0 Phase zu bringen auch eine gleichbleibende und sogar gesteigerte
Effizienz hinsichtlich der Ausbeuten bei der Reklonierung.
[0049] So konnten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Ergebnisse erzielt werden,
die sogar besser waren als jene, die aus punktierten Oozyten mit anschließender Reifung
und Fertilisation - jedoch ohne Klonierung - entstanden sind. Die dabei beobachtete
höhere in vivo Entwicklungskapazität erhöht die Effizienz der Klonierungsprogramme
erheblich.
[0050] Als Maß für die Effizienz derartiger Verfahren kann die sogenannte Graviditätsrate
(Trächtigkeitsrate) dienen, die als Anteil der nach Transfer von 6 - 7 Tagen in vitro
kultivierten Embryonen auf synchronisierte Empfängertiere gravid gewordenen Tiere
ermittelt werden kann. Die jeweiligen Graviditätsraten können durch Messung des Progesteronspiegels,
Ultraschalluntersuchungen oder rnittels rektaler Palpation bestimmt werden.
[0051] Dabei wurden beim Beispiel Rind mit unterschiedlichen Verfahren folgende Ergebnisse
erhalten:
Graviditätsraten: |
Oocytenpunktion mit anschließender IVM und IVF |
34 % |
Embryoklonierung (durchschnittlich) |
25 % |
Embryoklonierung mit fetalen Fibroblasten |
55 % |
IVM = in vitro Maturation/Reifung |
IVF = in vitro Fertilisation |
[0052] Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf das lediglich zur Erläuterung gegebene
Beispiel ausführlicher erläutert, das den Bereich der Erfindung nicht einschränken
soll.
Beispiel
Isolierung fetaler Fibroblasten beim Rinderfetus
[0053] Feten aus Uteri von geschlachteten Kalbinnen oder Kühen wurden freipräpariert und
in PBS (Phosphate buffered Saline, ohne Ca
2+/Mg
2+, mit Penicillin/ Streptomycin, plus 10% fetales Kälberserum (FCS)) auf Eiswasser
ins Labor gebracht. Die Feten wurden anschließend mehrmals mit frischem PBS gewaschen.
Nach dem Waschen wurden die Feten vom Kopf und den inneren Organen befreit, nochmals
in PBS gewaschen, in 5 ml PBS zerkleinert und in ein 50 ml Kulturröhrchen überführt.
Nach Zugabe von 10 ml PBS wurde bei 300 Upm für 5 min vorsichtig zentrifugiert und
das Pellet in 0,1 %iger Trypsinlösung resuspendiert. Nach einer 5-minütigen Inkubation
bei 37°C erfolgte ein Transfer in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, worauf erneut zentrifugiert
wurde (300 Upm/5 min.).
Diese Schritte, beginnend mit der Trypsinbehandlung wurden zweimal wiederholt. Die so erhaltene
Zellsuspension wurde dann filtriert, in ein 50 ml Röhrchen übernommen, für 5 min.
zentrifugiert (160 g), das Pellet resuspendiert und in 1 ml Kulturmedium (Dulbecco's
modifiziertes Eagle Medium (Gibco), ergänzt mit 15% FCS, 2mM L-Glutamin, 10
-7 mMol β-Mercaptoethanol, und Penicillin/Streptomycin) aufgenommen.
[0054] Nach der Trypsinbehandlung wurde die Zellsuspension in 10 cm Kulturschalen gegeben
und in Kulturmedium (supra) mit 10 % FCS (Biochrom, Berlin) solange gezüchtet (37°C,
5 % CO
2), bis der Zellrasen subkonfluent war (2 bis 3 Tage). Ein Teil dieser Passage "0"
wurde eingefroren (10 % Dimethylsulfoxid, Sigma) und in flüssigem Stickstoff gelagert.
[0055] Als Vergleich hinsichtlich der Effizienz des Verfahrens wurde ein Teil der Fibroblasten
vor dem Kerntransfer nach dem in der WO 97/07669 (Campell et al.) beschriebenen Verfahren
durch starke Verringerung der Serumkonzentration in der Kultur in eine presumptive
G0-Phase synchronisiert. Dazu wurden Zellen einen Tag nach der Passage dreimal mit
PBS gewaschen und dann in frischem Medium mit 0,5 % FCS für 8 Tage gezüchtet (Starvation,
"gehungerte Zellen"), bevor sie für die Klonierung verwendet wurden. In dem von Campell
beschriebenen Verfahren wird es als unumgänglich angesehen, daß die eingesetzten Fibroblasten
durch "Hungern" oder andere Verfahren in die G0-Phase überführt werden.
[0056] Die Fibroblasten für das hier beschriebene Verfahren, die diesem Aushungerungsprozeß
(Starvation) nicht ausgesetzt wurden, wurden direkt aus der subkonfluenten Zellkultur
entnommen und ohne weitere Behandlung für die Klonierung verwendet.
[0057] Weiter wurden Blastomeren (Embryonalzellen) aus Morulae (Embryonen im Alter von etwa
6 Tagen mit einer Zellzahl zwischen 30 und 70 Blastomeren), die aus der Klonierung
mit gehungerten und nicht behandelten Fibroblasten entstanden sind, erneut für die
Klonierung verwendet (Reklonierung). Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt
und zeigen, daß trotz Arbeiten gegen die Lehre des Standes der Technik sogar bessere
Ergebnisse erhalten werden können.
[0058] Auch bei den erhaltenen Graviditätsraten konnte überraschenderweise festgestellt
werden, daß diese bei 60 % lag.
Additiver Gentransfer
[0059] In vitro rekombinierte Genkonstrukte, wie sie in der DE-OS-40 12 526 beschrieben
sind, die hier unter Bezugnahme mit aufgenommen wird, werden durch konventionelle
DNA-Mikroinjektion (Brem G., Transgenic Animals, Genetic Engineering of Animals, VCH
Weinheim (1993), 83-170) in die Kerne isolierter fetaler Fibroblasten oder durch bekannte
Transformationsverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) stabil integriert. Der Nachweis der Integration
in den Zellen erfolgt mittels PCR und/oder Southern Blotting (Maniatis, vorstehend).
Eine Expression in ausdifferenzierten Zellen zeigt, daß der Gentransfer erfolgreich
gewesen ist.
Klonierung
[0060] 18-20 Std. nach dem Beginn der Reifung wurden aus dem Eierstock isolierte bovine
Oozyten von den sie umgebenden Kumuluszellen befreit und innerhalb von zwei Stunden
enukleiert (Molecular Reproduction and Development
42 (1995), 53-57). Ca. 20-22 Stunden nach Beginn der Reifung wurden wie vorstehend gewonnene
fetale Fibroblasten mittels einer Transferpipette in den perivitellinen Raum von enukleierten
Oozyten überführt und die sich dabei bildenden Karyoplast-Zytoplast-Komplexe (KZK)
wurden jeweils für 10 µsek. einem doppelten elektrischen Puls von 2,1 kV/cm ausgesetzt,
um die Fusion zu induzieren. Die KZKs wurden in Ham's F-12 Medium (Sigma) mit 10%
FCS in einem Brutschrank gezüchtet. Die Fusion wurde 30 bis 60 Minuten nach dem Fusionspuls
durch mikroskopische Untersuchung beurteilt.
[0061] 24 Stunden nach Beginn der Reifung wurden die KZKs durch eine 5 minütige Inkubation
in 7% Ethanol aktiviert und anschließend 5 Stunden in 10µg/ml Cycloheximid (Sigma
C-7698) und 5 µg/ml Cytochalasin B (Sigma C-6762) gezüchtet. Anschließend wurden die
KZKs in einem 100 µl Tropfen CR-1 Medium (Rosenkrans und First, 1991) mit 10% Östrus-Kuh-Serum
umgesetzt. Die Tropfen wurden mit Paraffin-Öl überschichtet und für 7 bis 8 Tage bei
39°C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre aus 5% CO
2, 5% O
2 und 90 % N
2 gezüchtet.
Tabelle 1:
Morulae aus fetaler Fibroblastenklonierung (FFB) als Kernspender |
Kerntransfer-Morulae aus Klonierung |
KZK |
Fusionierte FFB (%) |
Teilung (%) |
Blastozysten (%) |
FFB
(nicht gehungert) |
65 |
58 (89%) |
50 (86%) |
32 (55%) |
FFB
(gehungert) |
102 |
91 (88%) |
73 (80%) |
47 (52%) |
[0062] Wie aus vorstehender Tabelle ersichtlich, war es bereits bei dem ersten Versuch möglich,
eine Teilungsrate bis zu 86 % und eine Blastozystenrate von bis zu 55 % zu erhalten.
Dies ist im Hinblick darauf, daß es im Stand der Technik als erforderlich angesehen
wird die Fibroblasten "auszuhungern", als überraschend anzusehen, da Ergebnisse erzielt
werden können, die gegenüber dem Stand der Technik sogar besser sind.
Embryotransfer
Empfängermanagement
[0063] Als Empfänger wurden Kalbinnen verwendet, die folgende Kriterien erfüllten:
1. Aufzucht in IBR (bovines Herpesvirus Typ 1) unverdächtigen Betrieben;
2. serologische Untersuchung auf BHV-1-Antikörper (infektiöse bovine Rhinotracheitis
/infektiöse pustulöse Vulvovaginitis) negativ;
3. serologische Untersuchung auf BVD (bovine Virus Diarrhoe)/MD-Antigen (Mucosal Disease)
negativ;
4. dem Alter (13-16 Monate) entsprechende Körpermasseentwicklung;
5. eingetretene Geschlechtsreife; bei Tieren, die den Embryo austragen sollen, eingetretene
Zuchtreife;
6. gynäkologische Untersuchung ohne pathologische Befunde;
[0064] Alle Empfänger erhielten unmittelbar nach Aufstallung Mineralstoffboli (All Trace,
Ranching Consult GmbH), um die erfahrungsgemäß unzureichende Versorgung mit. Selen,
Kupfer und Cobalt auszugleichen (Wittkowski et al., Zur Selensupplementierung bei
Färsen; Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer Deutschland (AET-d). 13.06.-14.06.1996,
Marktredwitz).
[0065] BVD-Antikörper negative Tiere werden gegen BVD/MD immunisiert (Rumilis®, Intervet),
um das Infektionsrisiko bei Übertragung von Embryonen (Mödl et al., Control of bovine
viral diarrhea virus in abattoir ovaries for in vitro fertilization (IVF) or cloning
programs; 11e Reunion A.E.T.E.-Hannover, 8-9 September 1995) bzw. nach Verbringen
in Stallungen mit unbekanntem BVD-Status zu minimieren. Die Fütterung erfolgte ad
libitum mit Grassilage, Heu und Stroh. Entwurmungen wurden im Frühjahr und Herbst
mit Ivermectin (Ivomec®, MSD Agvet) durchgeführt. Die Unterbringung der Empfänger
erfolgt zum Teil in Laufstall- (Offenstall, Gruppengröße 6 Tiere) und zum Teil in
Anbindehaltung.
Empfängervorbereitung
[0066] Die Übertragung der in vitro hergestellten Embryonen erfolgt auf Zyklus-synchrone
Empfänger, d.h. das Stadium des Sexualzyklus entspricht dem Alter der zu übertragenden
Embryonen. Dabei wird der Tag der Brunst als Zyklustag 0 bezeichnet. Die Brunstsynchronisation
erfolgt im Diöstrus durch die einmalige intramuskuläre Applikation eines Prostaglandin
F
2-α-Analogons (2,0 ml Estrumate®, Mallinckrodt Veterinary). Kalbinnen, bei denen mittels
rektaler Palpation kein funktionelles Corpus luteum diagnostizierbar war, wurden nicht
für die Brunstsynchronisation verwendet. Die Brunst tritt erfahrungsgemäß 2-3 Tage
post applicationem ein und wird anhand des Brunstverhaltens und des Scheidenbefundes
beurteilt.
Embryotransfer
[0067] Die in vitro produzierten Embryonen wurden nach 7-tägiger Kultur auf geeignete Empfänger
transferiert. Dazu wurden die Embryonen identifiziert, qualitativ beurteilt, Zona
geschlitzt, in ein geeignetes Transfermedium umgesetzt und anschließend in Minipailletten
(Minitüb) aufgezogen. Als Transfermedien wurden PBS + 10% fetales Kälberserum (FCS,
Biochrom), Ovum Culture Medium (ICP, Neuseeland) + 10% FCS oder TL-Hepes + 10% FCS
verwendet.
[0068] Die verschlossenen Pailletten wurden bis zum Transfer, der innerhalb von ca. 90 Minuten
stattfinden sollte, bei 37,8°C in einem Miniinkubator gelagert.
[0069] Die Eignung der Empfänger wurde anhand folgender Kriterien beurteilt:
[0070] Die Tiere wurden etwa 7 Tage vor dem Transfer in Brunst beobachtet, wobei die Asynchronität
24 Std. nicht überschreiten soll (Hasler et al., Theriogenology
43 (1995), 141-152). Das Vorhandensein und die Größe eines funktionellen Gelbkörpers
wurde entsprechend bewertet (Assey et al., Theriogenology
39 (1993), 1321-1330).
[0071] Die verwendeten Tiere wiesen keine Anzeichen einer Erkrankung des Genitaltraktes
auf.
[0072] Nach der Auswahl wurde eine Epiduralanästhesie (2,0 ml Lidocain®, Albrecht) vorgenommen
und das äußere Genitale sorgfältig mit trockenem Papier gereinigt. Anschließend wurde
der körperwarme Transferkatheter (Minitüb) mit einer Paillette beschickt und mit einer
Plastikschutzhülle (Sanisheath, Minitüb) versehen. Der Transfer erfolgte unblutig
unter rektaler Kontrolle der Cervixpassage und der Katheterposition in die Spitze
des ipsilateralen Uterushornes (Reichenbach et al., J. Reprod. Fertil.
95 (1992), 363-370). Dabei wurde die Plastikschutzhülle erst am äußeren Muttermund mit
dem Transferkatheter perforiert, um eine Keimverschleppung aus der Vagina in den Uterus
zu vermeiden. War der Transfer mehrerer Embryonen auf einen Empfänger vorgesehen,
so wurden diese bilateral abgesetzt. Dazu wurde der Transferkatheter bis in das Corpus
uteri zurückgezogen, der Mandrin mit der entleerten Paillette entfernt, eine neue
Paillette mit Embryo(nen) in den Katheter geschoben und im contralateralen Uterushorn
positioniert. Unmittelbar nach dem Transfer wurden alle relevanten Daten (Lebensnummer
des Empfängers, Herkunft, Anzahl und Qualität der Embryonen usw.) dokumentiert.
Trächtigkeitsuntersuchung
[0073] 21 Tage nach der Brunst, also 14 Tage nach dem Embryotransfer, wurde eine Brunstkontrolle
vorgenommen und der Progesterongehalt im Blutserum festgestellt. Werte unter 0,1 ng/ml
werden als nicht trächtig angesehen. Bei Progesteronwerten über 2,0 ng/ml kann mit
einer Trächtigkeit gerechnet werden. Die erste direkte Trächtigkeitsuntersuchung wurde
um den 35. Tag mittels Ultraschall und die zweite manuell um den 42. Trächtigkeitstag
vorgenommen.