[0001] La présente invention concerne de nouvelles levures appartenant au genre
Kluyveromyces, génétiquement modifiées, et leur utilisation pour produire avantageusement des protéines
recombinantes.
[0002] Les progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier
des microorganismes pour leur faire produire des protéines d'intérêt et par exemple
des protéines hétérologues (protéines de mammifères, protéines artificielles, protéines
chimériques, etc). En particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur la
bactérie
Escherichia coli et la levure
Saccharomyces cerevisiae. Plus récemment, des outils génétiques ont été développés afin d'utiliser la levure
Kluyveromyces comme cellule hôte pour la production de protéines recombinantes. La mise en évidence
du plasmide pKD1 originaire de
K. drosophilarum (EP 241 435) a permis de développer un système hôte vecteur particulièrement avantageux
pour la sécrétion de protéines recombinantes (EP 361 991, EP 413 622).
[0003] Toutefois, l'application de ce système de production est encore limitée, en particulier
par les problèmes d'efficacité d'expression des gènes dans ces microorganismes recombinés,
par les problèmes de stabilité des plasmides, et également par les problèmes de dégradation
des produits recombinants par les cellules dans lesquelles ils sont synthétisés. Un
phénomène de protéolyse peut en effet se manifester lors du transit de la protéine
d'intérêt dans la voie sécrétoire de la levure recombinée, ou par l'existence de protéases
sécrétées ou présentes dans le milieu de culture à la suite d'une lyse cellulaire
non souhaitée intervenant lors de la fermentation.
[0004] La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible d'améliorer les niveaux de
production desdites protéines recombinantes, c'est-à-dire dans leur forme intégrale,
dans les levures
Kluyveromyces, en modifiant au moins un gène codant pour une protéase cellulaire, et notamment une
protéase transitant par la voie sécrétoire. De manière surprenante, la demanderesse
a de plus montré que de telles modifications sont particulièrement avantageuses puisqu'elles
permettent d'augmenter les taux de production de protéines recombinantes, et ceci
est d'autant plus avantageux que ladite modification est sans effet apparent sur la
vitesse de croissance et la viabilité des cellules modifiées dans des conditions industrielles
de fermentation. Toujours de manière surprenante, la demanderesse a également montré
que lesdites modifications n'affectent pas la stabilité des levures transformées,
ce qui permet d'utiliser lesdites levures de façon particulièrement avantageuse pour
produire des protéines recombinantes.
[0005] La présente invention a donc pour objet des levures du genre
Kluyveromyces présentant une ou plusieurs modifications génétiques d'au moins un gène codant pour
une protéase, modifiant l'activité protéolytique desdites levures. Préférentiellement,
la ou les modifications génétiques rendent ledit gène partiellement ou totalement
incapable de coder pour la protéase naturelle. Dans un autre mode préféré de l'invention,
le ou les gènes ainsi modifiés génétiquement codent pour une protéase non fonctionelle,
ou pour un mutant ayant un spectre d'activité protéolytique modifié. Dans un autre
mode préféré de l'invention, le ou les gènes codant pour lesdites protéases sont placés
sous contrôle d'un promoteur régulé.
[0006] Les levures du genre
Kluyveromyces selon l'invention comprennent les levures telles que définies par van der Walt [in
: The Yeasts (1987) NJ.W. Kreger-van Rij (
ed) ; Elsevier ; p. 224], et préférentiellement les levures
K. marxianus var.
lactis (K. lactis), K. marxianus var. m
arxianus (K. fragilis), K. marxianus var.
drosophilarum (K. drosophilarum). K. waltii, etc...
[0007] Par modification génétique, on doit entendre plus particulièrement toute suppression,
substitution, délétion, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes
considérés. De telles modifications peuvent être obtenues
in vitro (sur de l'ADN isolé) ou
in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore en exposant lesdites
levures à un traitement au moyen d'agents mutagènes. Par agents mutagènes, on peut
citer par exemple les agents physiques tels que les rayonnements énergétiques (rayons
X, g, ultra violet, etc..), ou les agents chimiques capables de réagir avec différents
groupements fonctionnels des bases de l'ADN, et par exemple les agents alkylants [éthylméthane
sulfonate (EMS), N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, N-nitroquinoléine-1-oxyde (NQO)],
les agents bialkylants, les agents intercalants, etc... Par délétion on entend toute
suppression du gène considéré. Il peut s'agir notamment d'une partie de la région
codant pour lesdites protéases, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de
la transcription.
[0008] Les modifications génétiques peuvent également être obtenues par disruption génique,
par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstein [Meth. Enzymol.
101 (1983) 202]. Dans ce cas, l'intégralité de la séquence codante sera préférentiellement
perturbée pour permettre le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence
génomique sauvage par une séquence non fonctionnelle ou mutante.
[0009] La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées dans le gène codant
pour lesdites protéases, ou en dehors de la région codant pour lesdites protéases,
et par exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation
transcriptionelle desdits gènes. L'incapacité desdits gènes à coder pour les protéases
naturelles peut se manifester soit par la production d'une protéine inactive en raison
de modifications structurales ou conformationelles, soit par l'absence de production,
soit par la production d'une protéase ayant une activité enzymatique altérée, ou encore
par la production de la protéase naturelle à un niveau atténué ou selon un mode de
régulation désiré.
[0010] Par ailleurs, certaines altérations telles que des mutations ponctuelles sont par
nature capables d'être corrigées ou atténuées par des mécanismes cellulaires, par
exemple lors de la réplication de l'ADN précédant la division cellulaire. De telles
altérations génétiques ont alors un intérêt limité au niveau industriel puisque les
propriétés phénotypiques qui en résultent ne sont pas parfaitement stables. La demanderesse
a maintenant mis au point un procédé permettant de préparer des levures
Kluyveromyces présentant une ou plusieurs modifications génétiques d'au moins un gène codant pour
une protéase, la ou lesdites modifications étant stables ségrégationellement et/ou
non-réversibles. Les levures présentant de telles modifications sont particulièrement
avantageuses comme hôte cellulaire pour la production de protéines recombinantes.
L'invention permet également la réalisation de levures dans lesquelles la ou les modifications
apportées rendent le ou les gènes considérés totalement ou seulement partiellement
incapables de produire une protéase fonctionnelle.
[0011] Préférentiellement, les levures selon l'invention présentent une ou plusieurs modifications
génétiques stables ségrégationellement. Toujours selon un mode préféré, la ou les
modifications génétiques son non-réversibles. Encore selon un mode préféré de l'invention,
la ou les modifications génétiques ne laissent aucune activité résiduelle au gène
considéré.
[0012] Préférentiellement, le ou les gènes codant pour une ou des protéases sont choisis
parmi les gènes codant pour des protéases transitant par la voie sécrétoire de
Kluyveromyces. De telles protéases peuvent être localisées dans le réticulum endoplasmique, le compartiment
de l'appareil de Golgi, le compartiment post-Golgi, et par exemple les vacuoles cellulaires,
les vésicules de l'endosome, les vésicules de sécrétion, ou le milieu extracellulaire.
[0013] A titre d'exemple de tels gènes, on peut citer les gènes de
Kluyveromyces codant pour une protéase choisie parmi les familles de la protéase A, de la protéase
B, ou d'une carboxypeptidase (et par exemple la carboxypeptidase Y ou la carboxypeptidase
S), ou encore l'endopeptidase KEX1 de
K. lactis ou une protéase d'activité similaire, et par exemple la protéase YAP3 [Egel-Mitani
et al., Yeast
6 (1990) 127], ou plus généralement toute autre protéase intervenant dans la maturation
de certaines protéines sécrétées.
[0014] Dans un mode préféré de l'invention, le ou les gènes considérés codent pour des protéases
n'intervenant pas dans le clivage du peptide signal des protéines recombinantes exprimées
sous forme de préprotéines. On peut citer à titre d'exemples de gènes particulièrement
intéressants les gènes de la protéases A, de la protéase B, et de la carboxypeptidase
Y de
Kluyveromyces, dont le clonage est décrit dans les exemples.
[0015] Dans un autre mode de l'invention, la ou lesdites protéases possèdent une activité
de signal peptidases et la ou lesdites modifications génétiques permettent leur surexpression,
ce qui est particulièrement avantageux dans le cas ou cette étape est une étape limitante
de la voie sécrétoire.
[0016] L'invention a également pour objet toute levure
Kluyveromyces telle que définie précédemment dans laquelle une séquence d'ADN exogène comprenant
un ou plusieurs gènes codant pour une protéine d'intérêt que l'on souhaite exprimer
et/ou sécréter dans ladite levure, a été introduite.
[0017] Au sens de la présente invention, on entend par séquence d'ADN exogène toute séquence
d'ADN introduite artificiellement dans la levure et codant pour une ou plusieurs protéines
d'intérêt. En particulier il peut s'agir de séquences d'ADN complémentaire (ADNc),
de séquences artificielles ou hybrides, ou encore de séquences synthétiques ou semi-synthétiques,
incluses dans une cassette d'expression permettant la synthèse dans lesdites levures
de ou desdites protéines d'intérêt. Par exemple, cette séquence d'ADN exogène peut
inclure une région de démarrage de la transcription, régulée ou non chez
Kluyveromyces, de façon à diriger, quand cela est souhaitable, l'expression desdites protéines d'intérêt.
[0018] Préférentiellement, la séquence d'ADN exogène est incluse dans un vecteur, qui peut
être soit à réplication autonome dans la levure considérée, soit de type intégratif.
Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés à
partir de séquences à réplication autonome chez
Kluyveromyces, et par exemple il peut s'agir du plasmide pKD1 [Falcone et al., Plasmids
15 (1986) 248 ; Chen et al., Nucl. Acids Res.
14 (1986) 4471] caractérisé par une haute stabilité ségrégationelle, notamment chez
les différentes variétés de
K. marxianus, ou du plasmide pKW1 isolé chez
K. waltii [Chen et al., J. General Microbiol.
138 (1992) 337]. Des vecteurs à réplication autonome peuvent également être préparés
à partir de séquences chromosomiques (ARS). S'agissant des vecteurs de type intégratifs,
ceux-ci peuvent être préparés à partir de séquences chromosomiques homologues à ladite
levure hôte, de façon à encadrer la séquence génétique codant pour lesdites protéines
d'intérêt, et un marqueur de sélection génétique, de façon à orienter l'intégration
de l'ensemble par recombinaison homologue. Dans un mode de réalisation particulier
lesdites séquences homologues correspondent à des séquences génétiques provenant de
la région codante de ladite protéase, ce qui permet de remplacer par recombinaison
homologue la séquence originelle de ladite protéase par le marqueur de sélection et
la séquence d'ADN exogène, tout en permettant la disruption génique de ladite protéase.
Dans un autre mode de réalisation, la cassette d'expression est intégrée au locus
codant pour les ARN ribosornaux (rDNA), permettant l'amplification génique de ladite
cassette d'expression [Bergkamp et al., Curr. Genet.
21 (1992) 365]. Encore dans un autre mode de réalisation, la séquence d'ADN exogène
est intégrée dans le chromosome desdites levures hôtes par recombinaison non homologue.
[0019] La séquence d'ADN exogène peut être introduite dans la levure par les techniques
de l'homme de l'art, et par exemple les techniques de l'ADN recombinant, les croisements
génétiques, la fusion de protoplastes, etc. Dans un mode de réalisation particulier,
la séquence d'ADN exogène est introduite chez les levures
Kluyveromyces par transformation, électroporation, conjugaison, ou toute autre technique décrite
dans la littérature. S'agissant de transformation des levures
Kluyveromyces, on peut utiliser la technique décrite par Ito et al. [J. Bacteriol.
153 (1983) 163]. La technique de transformation décrite par Durrens et al. [Curr. Genet.
18 (1990) 7] utilisant l'éthylène glycol et le diméthylsulfoxyde est également efficace.
Il est aussi possible de transformer les levures par électroporation, selon la méthode
décrite par Karube et al. [FEBS Letters
182 (1985) 90]. Un protocole alternatif est également décrit dans la demande de brevet
EP 361991.
[0020] Lesdites levures
Kluyveromyces modifiées pour leur contenu en protéases par les techniques décrites ci-avant sont
avantageusement utilisées comme cellules hôtes pour produire des protéines recombinantes,
et par exemple des protéines hétérologues d'intérêt pharmaceutique ou agroalimentaire.
Lesdites levures hôtes sont particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent
d'augmenter la qualité et la quantité des protéines recombinantes que l'on désire
produire et/ou sécréter, et que lesdites modifications génétiques desdites cellules
n'affectent pas la stabilité génétique et mitotique des vecteurs d'expression desdites
protéines recombinantes. Un autre objet de l'invention réside donc dans un procédé
de production de protéines recombinantes selon lequel on cultive une levure telle
que définie ci-dessus dans des conditions d'expression de la ou des protéines codées
par la séquence d'ADN exogène, et que l'on récupère la ou les protéines d'intérêt.
Dans un mode préféré, lesdites protéines d'intérêt sont sécrétées dans le milieu de
culture. A titre d'exemple on peut citer des protéines existant naturellement dans
la nature, ou des protéines artificielles, et par exemple des protéines hybrides.
Dans ce cas, l'utilisation de cellules de levures ayant un contenu modifié en protéases
est particulièrement avantageux du fait de l'exposition de la région charnière entre
les différents domaines protéiques de la chimère. Dans un mode de réalisation particulier,
ladite protéine artificielle comporte un peptide fusionné à une des extrémités de
la chimère et est particulièrement sensible, par exemple lors du transit dans la voie
sécrétoire, à une dégradation protéolytique par une exoprotéase, N- ou C-terminale,
et par exemple une carboxypeptidase. Il est entendu que la dégradation protéolytique
de la protéine d'intérêt peut également résulter de toute protéase cellulaire, et
par exemple cytoplasmique, libérée dans le milieu extérieur du fait d'une lyse cellulaire
non souhaitée pendant le procédé de la fermentation desdites levures recombinées.
L'altération génétique de la séquence nucléotidique codant pour de telles protéases
peut donc également résulter en un procédé particulièrement avantageux pour produire
lesdites protéines d'intérêt et est également revendiquée.
[0021] Préférentiellement, le procédé selon l'invention permet la production de protéines
d'intérêt pharmaceutique ou agro-alimentaire. A titre d'exemple, on peut citer les
enzymes (telles que notamment la superoxide dismutase, la catalase, les amylases,
les lipases, les amidases, la chymosine, etc, ou tout fragment ou dérivé de celles-ci),
les dérivés sanguins (tels que la sérum-albumine, l'alpha ou la béta globine, les
facteurs de la coagulation, et par exemple le facteur VIII, le facteur IX, le facteur
de von Willebrand, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine, etc, ou tout fragment
ou dérivé de ceux-ci), l'insuline et ses variants, les lymphokines [telles que les
interleukines, les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF,
M-CSF etc...), le TNF, etc, ou tout fragment ou dérivé de ceux-ci], les facteurs de
croissance (tels que l'hormone de croissance, l'érythropoiétine, le FGF, l'EGF, le
PDGF, le TGF, etc, ou tout fragment ou dérivé de ceux-ci), les apolipoprotéines et
leurs variants moléculaires, des polypeptides antigéniques pour la réalisation de
vaccins (hépatites, cytomégalovirus, virus d'Epstein-Barr, virus de l'herpès, etc),
ou encore des fusions de polypeptides telles que notamment des fusions comportant
une partie biologiquement active fusionnée à une partie stabilisatrice.
[0022] Un autre objet de la présente invention réside dans un fragment d'ADN de
Kluyveromyces codant pour une protéase. La demanderesse a en effet mis en évidence, isolé et caractérisé
certaines protéases de
Kluyveromyces et notamment des protéases transitant par la voie sécrétoire. Plus préférentiellement,
un des objets de l'invention concerne une protéase de
Kluyveromyces choisie notamment parmi les protéases A, B, la carboxypeptidase Y, ainsi que la famille
des sérine protéases de type subtilisine et dont un représentant est la protéase KEX1
de
K. lactis [Wésolowski-Louvel et al., Yeast
4 (1988) 71]. A titre d'exemple, les séquences nucléotidiques des gènes de
K. lactis codant pour les protéases A, B et la carboxypeptidase Y ont été déterminées par la
demanderesse et sont présentées SEQ ID n° 3, 1 et 2 respectivement. Une carte de restriction
d'un fragment chromosomique codant pour la protéase A de
K. lactis est également reportée à la Figure 10. Il est entendu que tout variant génétique
de ces gènes de protéases, et leur utilisation avantageuse pour produire des protéines
d'intérêt, font également partie de l'invention. Lesdites variations peuvent être
d'origine naturelle, mais peuvent aussi être obtenues
in situ ou
in vitro par les techniques du génie génétique, ou après traitement des cellules par un agent
mutagène, et incluent notamment les mutations ponctuelles ou multiples, les délétions,
les additions, les insertions, les protéases hybrides etc. Dans un mode de réalisation
encore plus particulier, les variations génétiques peuvent également intéresser les
régions de contrôle de l'expression desdites protéases, par exemple en vue d'altérer
leur niveaux d'expression ou leur mode de régulation.
[0023] L'invention a également pour objet toute protéine résultant de l'expression d'un
fragment d'ADN exogène tel que défini plus avant.
[0024] L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une levure
Kluyveromyces génétiquement modifiée et son utilisation avantageuse pour produire des protéines
d'intérêt. Préférentiellement, le procédé de l'invention consiste à remplacer le ou
les gènes chromosomiques considérés par une version modifiée
in vitro.
[0025] La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent,
qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
[0026] Les représentations des plasmides indiquées dans les Figures suivantes sont traçées
à une échelle approximative et seuls les sites de restriction importants pour la compréhension
des clonages réalisés sont indiqués.
Figure 1 : Carte de restriction de l'insert génomique du plasmide pFP8. La position des sites
de coupure des endonucléases suivantes est indiquée : B=BamHI ; G=BglII ; C=ClaI ; E=EcoRI ; H=HindIII ; K=KpI ; N=NcoI ; P=PstI ; Pv=PvuII ; T=SsI ; X=XhoI. Le fragment obtenu après amplification PCR est représenté ainsi que l'ARNm du gène
PRB1 de S. cerevisiae.
Figure 2 : Hybridation de la sonde PRB1 de S. cerevisiae avec des fragments de restriction de l'ADN génomique de K. lactis. Panneau supérieur: photo du gel d'agarose (1 %) coloré au bromure d'éthidium et avant
le transfert sur le filtre de nylon; panneau inférieur: représentation schématique
des signaux obtenus après hybridation du filtre avec la sonde radioactive. La numérotation
correspond aux digestions suivantes : 1=EcoRI ; 2=BglII ; 3=BglII+EcoRI ; 4=HindIII ; 5=HindIII+EcoRI ; 6=PstI ; 7=PstI+ECoRI ; 8=SalI ; 9=SalI+EcoRI ; 10=BamHI ; 11=BamHI+EcoRI.
Figure 3 : Hybridation de la sonde PRB1 de S. cerevisiae avec les 34 mini-préparations d'ADN (mélange de 10 clones chacun) après restriction
double par les enzymes EcoRI et BglII. Panneau A : photo du gel d'agarose (1 %) coloré au bromure d'éthidium et avant
le transfert sur le filtre de nylon ; panneau B : autoradiographie du filtre de nylon
après hybridation avec la sonde PRB1 de S. cerevisiae; les sous-fractions "d", "e" et "f" correspondant à un aliquot des fragments d'ADN
génomique de K. lactis après digestion totale par EcoRI+BglII et fractionnement en taille par électroélution sont indiquées.
Figure 4 : Hybridation contrôle des clones positifs 18-3 et 31-I. Panneau A : Photo après migation
sur gel d'agarose à 1 % des digestions EcoRI+BglII de l'ADN des clones 31-I (puits n° 1), 18-3 (puits n° 2) et 31-K (témoin négatif,
puits n° 3). Panneau B : Autoradiographie du filtre de nylon correspondant au gel
précédent après hybridation avec la sonde PRB1 de S. cerevisiae. P correspond à la localisation du plasmide (pYG1224) non digéré; la position du
fragment de restriction BglII-EcoRI d'environ 0,7 kb hybridant avec la sonde radioactive est indiqué.
Figure 5 : Comparaison de la séquence protéique du fragment BglII-EcoRI d'ADN génomique de K. lactis (résidus Arg308 à Phe531 de la séquence peptidique SEQ ID n° 1) avec la partie correspondante du gène PRB1 de S. cerevisiae (résidus Arg105 à Leu328). Les astérisques indiquent les acides aminés conservés entre les deux séquences.
Figure 6 : Cartes de restriction des inserts génomiques des plasmides pYG1224, pYG1226 et
pYG1227 (panneau A) ; pYG1231 (panneau B) ; pYG1237, pYG1238, pYG1239, pYG1240, pYG1241
et pYG1242 (panneau C). La position des sites de coupure des endonucléases suivantes
est indiquée : G=BglII; C=ClaI ; S=SalI ; E=EcoRI ; H=HindIII ; K=KpnI ; P=PstI ; V=EcoRV. Panneau D: localisation de la phase codante du gène PRB1 de K. lactis; la flèche verticale indique la position approximative de l'extrémité N-terminale
de la protéine mature. La position du codon présumé d'initiation de la traduction
et la position du codon spécifiant la fin de la traduction sont indiquées par une
astérisque.
SEQ ID n° 1 : Séquence du gène PRB1 de K. lactis. Les flèches noires indiquent la position approximative de la fin des régions "pré"
et "pro" de la protéase B. Les sites de restriction BglII, SalI, EcoRI et HindIII sont soulignés, ainsi que la séquence correspondant à l'oligodéoxynucléotide Sq2101.
Figure 8 : Carte de restriction de l'insert du plasmide pC34. La boîte correspond à l'insert
génomique de K. lactis et la ligne correspond aux séquences du vecteur KEp6. La flèche indique la position
du gène PRC1 de K. lactis. La partie détaillée comprise entre les sites EcoRI et SalI correspond à la région séquencée présentée à la Figure 9. Liste des abbréviations
: C=ClaI ; H=HindIII ; B=BamHI ; E=EcoRI ; P=PstI ; S=SalI ; Sp=SphI ; Sau=Sau3A.
SEQ ID n° 2 : Séquence nucléotidique du fragment EcoRI-SalI incluant le gène PRC1 de K. lactis.
Figure 10 : Carte de restriction de l'insert du plasmide pA25/1. La boîte correspond à l'insert
génomique de K. lactis et la ligne correspond aux séquences du vecteur KEp6. La flèche indique la position
approximative du gène PRA1 telle qu'indiquée par une hybridation en Southern blot au moyen de sondes 3' et 5'
spécifiques. Liste des abbréviations : C=ClaI ; H=HindIII ; B=BamHI ; Sau=Sau3A ; S=SalI ; P=PstI ; G=BglII ; Xb=XbaI ; Sn=SnaBI ; E=EcoRI.
Figure 11 : Panneau A : Carte de restriction du fragment de restriction HindIII-EcoRI du plasmide pYG1232. La position des sites de coupure des endonucléases suivantes
est indiquée : G=BglII ; S=SalI ; E=EcoRI ; H=HindIII ; K=KpnI ; X=XhoI ; le site de clonage HindIII provient du vecteur et est souligné. Panneau B : Disruption du gène PRB1 de K. lactis par le marqueur de sélection URA3 de S. cerevisiae. Ce Southern blot correspond à de l'ADN génomique de K. lactis CBS 294.91 (uraA) après transformation par le fragment BglII-EcoRI du panneau A et sélection en l'absence d'uracile. Puits 1 à 3 : ADN génomique de
trois transformants après restriction double BglII + EcoRI ; la souche du puits 3 est K. lactis Y750 ; puits 4 : ADN génomique de la souche CBS 294.91 après restriction double BgIII + EcoRI. La sonde radioactive utilisée correspond au fragment BglII-EcoRI du plasmide pYG1224 (Fig. 6A).
Figure 12 : Carte de restriction des inserts des plasmides pC34 [vecteur KEp6 ; panneau a)],
pYG154 [vecteur pIC-20R ; panneau b)] et pYG155 [vecteur pIC-20R ; panneau c)]. Panneau
d) : Fragment utilisé pour la disruption. Les sites de restriction entre parenthèses
ont été détruits par l'enzyme Klenow ou par l'ADN polymérase de T4 comme indiqué dans
le texte. La boîte correspond à l'insert génomique de K. lactis et la ligne correspond aux séquences des vecteurs. Liste des abbréviations : C=ClaI ; H=HindIII ; B=BamHI ; E=EcoRI ; P=PstI ; S=SalI, Sp=SphI ; Sau=Sau3A ; Sm=SmaI ; N=NcoI.
Figure 13 : Carte de restriction du plasmide pYG105 et stratégie de construction du plasmide
pYG1212. Abbréviations utilisées : P, promoteur LAC4 de K. lactis ; T, terminateur transcriptionnel ; IR, séquences répétées inversées du plasmide
pKD1 ; LP, région prépro de la SAH ; Apr et Kmr désignent respectivement les gènes de résistance à l'ampicilline (E. coli) et au G418 (Kluyveromyces).
Figure 14 : Comparaison des capacités de sécrétion d'un variant tronqué de l'albumine humaine
dans les souches K. lactis CBS 293.91 (puits 2, 4, 6, 8 et 10) ou son mutant disrupté pour le gène de la protéase
B (souche Y750 ; puits 1, 3, 5, 7 et 9), après transformation par le plasmide pYG1212.
Les cellules transformées sont cultivées en erlenmeyers en présence de G418 (200 mg/l)
pendant 2 jours (puits 1, 2, 7 et 8), 4 jours (puits 3, 4, 9 et 10), ou 7 jours (puits
5 et 6); les puits 1 à 6 correspondent à une croissance en milieu YPD, et les puits
7 à 10 correspondent à une croissance en milieu YPL. Les dépôts sont équivalents à
50 ml de surnageants de culture.
SEQ ID n° 3 : Séquence nucléotidique du fragment ClaI-EcoRI incluant le gène PRA1 de K. lactis.
TECHNIQUES GENERALES DE CLONAGE.
[0027] Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions
préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de
chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification
de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au
phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de
l'isopropanol, la transformation dans
Escherichia coli, etc..., sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la
littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 ; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
[0028] Les enzymes de restriction ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda
Research Laboratories (BRL) ou Amersham et sont utilisées selon les recommandations
des fournisseurs.
[0029] Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale
(Bethesda Research Laboratories). Les plasmides de type pIC ont été décrits par Marsh
et al. [Gène
32 (1984) 481].
[0030] Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse
en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme,
précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs)
selon les recommandations du fournisseur.
[0031] Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow
de l'ADN Polymérase I
d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités
3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs)
utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5'
proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1. L'exonucléase
Ba131 est utilisée selon les recommandations du fournisseur (Biolabs).
[0032] Les oligodéoxynucléotides sont synthétisés chimiquement selon la méthode des phosphoramidites
en utilisant des groupements protecteurs B-cyanoéthyles [Sinha et al., Nucleic Acids
Res.
12 (1984) 4539]. Après synthèse, les groupements protecteurs sont éliminés par traitement
à l'ammoniaque et deux précipitations au butanol permettent de purifier et de concentrer
les oligodéoxynucléotides [Sawadogo et Van Dyke, Nucleic Acids Res.
19 (1991) 674]. La concentration en ADN est déterminée par mesure de la densité optique
à 260 nm.
[0033] La mutagénèse dirigée
in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée
par Taylor et al. [Nucleic Acids Res.
13 (1985) 8749] en utilisant le kit distribué par Amersham.
[0034] Le fragment d'ADN utilisé pour servir de sonde moléculaire sur de l'ADN génomique
de
K. lactis est amplifié
in vitro par la technique PCR [Polymerase-catalyzed
Chain
Reaction, Saiki R.K. et al., Science
230 (1985) 1350 ; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym.
155 (1987) 335] sur de l'ADN de
S. cerevisiae. L'amplification est automatisée (40 cycles d'amplification) et s'effectue dans un
appareil Perkin Elmer Cetus (DNA thermal cycler) en utilisant La Taq polymérase (isolée
de l'archaebactérie
Thermophilus aquaticus) fournie par la société Perkin Elmer. Chaque cycle d'amplification comporte trois
étapes :
- 1) Une étape de dénaturation de l'ADN à 91°C ;
- 2) Une étape d'hybridation des amorces d'oligodéoxynucléotides sur l'ADN matrice.
La température d'hybridation est choisie cinq à dix degrés en dessous de la température
de fusion des oligodéoxynucléotides (T1/2). Pour des oligodéoxynucleotides d'une taille d'environ 20 mer, T1/2 = 2x(A+T)+4x(C+G) [Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53 (1984) 323].
- 3) Une étape de synthèse de l'ADN complémentaire par la Taq polymérase à 72°C.
[0035] La préparation des sondes nucléotidiques radioactives est faite par incorporation
d'adCTP radioactif (phosphore 32) le long de la molécule néosynthétisée à partir de
20 ng d'ADN en utilisant le kit "Random Primed DNA Labeling" commercialisé par la
firme Boehringer.
[0036] Les transferts d'ADN sur membrane de nylon (Biodyne, Pall, St Germain en Laye) ou
de nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Dassel) s'effectuent selon la méthode développée
initialement par Southern [J. Mol. Biol.
98 (1979) 503]. Les conditions d'hybridation et de lavage utilisées dépendent de la
nature de la sonde utilisée : en conditions hétérologues (ADN génomique de
K. lactis hybridé avec une sonde provenant de
S.cerevisiae par exemple), l'hybridation et les lavages s'effectuent en conditions peu stringentes
(hybridation pendant 15 heures à 40°C sans formamide en 5X SSC/5X Denhart, le filtre
est ensuite lavé 3 fois en 5X SSC/SDS 1 % à 40°C pendant 15 minutes, puis 1 fois en
0,25X SSC/SDS 1 % pendant 10 minutes); en conditions homologues (ADN génomique de
K. lactis hybridé avec une sonde provenant de
K. lactis par exemple), l'hybridation et les lavages s'effectuent en conditions plus stringentes
(hybridation pendant 15 heures à 40°C en 5X SSC/5X Denhart/50 % formamide, le filtre
est ensuite lavé 3 fois en 5X SSC/SDS 1 % à 40°C pendant 15 minutes, puis 1 fois en
0,2X SSC/SDS 1 % pendant 10 minutes).
[0037] La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée sur ADN plasmidique avec
le kit "Sequenase version 2.0" de la société United States Biochemical Corporation,
selon la méthode de Tabor et Richardson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84 (1987) 4767]. Cette technique est une modification de la méthode initialement décrite
par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74 (1977) 5463].
[0038] Les transformations de
K. lactis avec l'ADN des plasmides d'expression des protéines de la présente invention sont
effectuées par toute technique connue de l'homme de l'art, et dont un exemple est
donné dans le texte.
[0039] Sauf indication contraire, les souches bactériennes utilisées sont
E. coli MC1060 (
lacIPOZYA, X74,
galU,
galK,
strA
r),
E. coli TG1 (
lac,
proA,B,
supE,
thi,
hsdD5 / F
traD36,
proA
+B
+,
lacI
q,
lacZ, M15), ou
E. coli JM101 [Messing et al., Nucl. Acids Res.
9 (1981) 309].
[0040] Les souches de levures utilisées appartiennent aux levures bourgeonnantes et plus
particulièrement aux levures du genre
Kluyveromyces. Les souche
K. lactis MW98.8C (
a,
uraA, arg, lys, K
+, pKD1°),
K. lactis CBS 293.91,
K. lactis CBS 294.91
(uraA), et
K. lactis CBS 2359/152 [
a, metA, (k1, k2) ; Wésolowski et al., Yeast
4 (1988) 71] ont été particulièrement utilisées ; un échantillon de la souche MW98-8C
a été déposé le 16 Septembre 1988 au Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) à
Baarn (Pays Bas) où il a été enregistré sous le numéro CBS 579.88.
[0041] La préparation d'ADN génomique de levure est essentiellement dérivée de la technique
de Hoffman et Winston [Gene
57 (1987) 267] et est décrite en détail dans le texte.
[0042] Les souches de levures transformées par les plasmides d'expression codant pour les
protéines de la présente invention sont cultivées en erlenmeyers ou en fermenteurs
pilotes de 21 (SETRIC, France) à 28°C en milieu riche (YPD : 1 % yeast extract, 2
% Bactopeptone, 2 % glucose ; ou YPL : 1 % yeast extract, 2 % Bactopeptone, 2 % lactose)
sous agitation constante.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : CLONAGE DU GENE DE LA PROTEASE B DE K. LACTIS.
E.1.1. Réalisation d'une sonde par amplification enzymatique
in vitro d'une séquence d'ADN.
[0043] Une amplification enzymatique par PCR est réalisée à partir du plasmide pFP8 [Moehle
et al., Genetics
115 (1987) 255 ; Fig. 1], vecteur navette
E. coli/S. cerevisiae dérivé de YEp13 et portant le gène
PRB1 de
S. cerevisiae, et les oligodéoxynucléotides 5'-T
GACACTCAAAATAGCG-3' (le codon correspondant au résidu Asp
3 est souligné) et 5'-
AATATCTCTCACTTGAT-3' (le codon du brin complémentaire correspondant au résidu Ile
348 est souligné). La température d'hybridation des oligodéoxynucléotides est de 45°C
et le volume réactionel de 100 ml comprend : 10 ng du plasmide pFP8, les oligodéoxynucléotides
amorces, 10 ml de tampon 10X PCR [Tris-HCl pH=8,5 (100 mM) ; MgC12 (20 mM) ; KCl (100
mM) ; gélatine (0,01 %)], 10 ml dNTP (dATP + dCTP + dGTP + dTTP, chacun à une concentration
de 10 mM)], et 2,5 unités de Taq polymérase. L'addition d'une goutte d'huile de parafine
permet d'éviter l'évaporation au cours des élévations de température pendant les cycles
d'amplification. Un fragment d'ADN de 1039 paires de bases est obtenu, dont l'identité
est vérifiée par analyse des positions de certains sites de restriction et correspondant
à la quasi-totalité de la séquence en acides aminés de la forme mature de la protéase
B (Asp
3 à Ile
348). Ce fragment est ensuite purifié par électroélution après migration sur gel d'agarose
à 0,8 % et est utilisé pour préparer la sonde radioactive selon la méthode du "Random
Priming".
E.1.2. Préparation d'ADN génomique de levure.
[0044] Les levures (souche
K. lactis MW98-8C) en phase stationnaire de croissance sont centrifugées. Après lavage du culot
dans de l'eau stérile, celui-ci est repris dans une solution contenant : Triton X100
2 % (v/v) ; SDS 1 % (w/v) ; NaCl 100 mM ; Tris-HCl (pH=8) 10 mM ; EDTA 1 mM. Les levures
sont alors broyées en présence de phénol-chloroforme par l'action mécanique de billes
de verre ajoutées au mélange qui est agité au Vortex pendant 2 minutes. La phase aqueuse
est ensuite récupérée après centrifugation et précipitée par addition de 2,5 volumes
d'éthanol. L'ADN est repris dans du TE pour subir une purification sur un gradient
de césium. A partir de 1 litre de culture on obtient environ 1 mg d'ADN génomique
de haut poids moléculaire (>> 20kb).
E.1.3. Recherche du gène par hybridation en conditions de faible stringence.
[0045] La préparation d'ADN génomique est soumise à une digestion totale par des enzymes
de restriction dont les sites sont présents dans le multisite de clonage du vecteur
pIC-20H. Un résultat préliminaire montre que seules des conditions peu stringentes
(hybridation pendant 15 heures à 40°C sans formamide en 5X SSC/5X Denhart, puis 3
lavages en 5X SSC/SDS 1 % à 40°C pendant 15 minutes, puis 1 lavage en 0,25X SSC/SDS
1 % pendant 10 minutes) permettent de visualiser un fragment
EcoRI de 1,8 kb hybridant avec la sonde
PRB1 de
S. cerevisiae. Un second Southern blot est réalisé, dans lequel chaque puits comporte 12 mg d'ADN
génomique clivé pendant 15 heures par 20 unités de
EcoRI et 20 unités d'une seconde enzyme de restriction (Fig. 2). Dans les conditions d'hybridation
et de lavage précédemment définies, un fragment génomique d'environ 700 pb et provenant
de la double digestion
EcoRI+
BglII hybride avec la sonde
PRB1 de
S. cerevisiae (Fig. 2, puits n° 3). De même, un fragment de restriction
BglII de taille supérieure (environ 1,3 kb) hybride avec cette sonde (Fig. 2, puits n°
2). Le fragment d'environ 700 pb détecté après digestion de l'ADN génomique par
EcoRI +
BglII est donc un fragment de restriction
BglII-
EcoRI. Les autres restrictions paraissent moins intéressantes car elles génèrent soit
des fragments de taille inférieure à celui obtenu par la double digestion
EcoRI +
BglII. soit un fragment de taille identique (1,8 kb) à celui généré après digestion par
EcoRI uniquement (Fig. 2, puits n° 1).
[0046] Le clonage de ce fragment asymétrique
BglII-
EcoRI de 700 pb permet d'obtenir une fraction du gène
PRB1 de
K. lactis qui pourra servir ensuite de sonde homologue pour cloner la ou les partie(s) manquante(s)
du gène. Pour cloner ce fragment, 100 mg d'ADN génomique sont traités pendant 15 heures
par 100 unités des endonucléases
EcoRI et
BglII. puis mis à migrer sur gel d'agarose préparatif (1 %). La fraction du gel comprenant
les fragments dont la taille est comprise entre 500 et 1000 pb est ensuite découpée
en trois sous-fractions (sous-fraction "f" : 500/700 pb ; sous-fraction "e" : 700/800
pb ; sous-fraction "d" : 800/1000 pb ; Fig. 3). Un Southern blot réalisé après migration
d'un aliquot de ces sous-fractions et hybridation avec la sonde
PRB1 de
S. cerevisiae montre un signal d'hybridation de la taille attendue (700 pb) et particulièrement
intense avec la sous-fraction "e" (700/800 pb). Une banque génomique restreinte aux
fragments
BglII-
EcoRI de cette sous-fraction (mini-banque génomique) est donc construite par clonage des
fragments de restriction
BglII-
EcoRI dans les sites correspondant du vecteur pIC-20H. La transformation de la ligation
dans
E. coli donne 90 % de clones blancs sur boîtes LB supplémentées en ampicilline et X-gal.
340 clones (dont environ 30 clones bleus) sont alors repiqués sur le même milieu pour
les isoler. Les 340 clones de la banque restreinte sont ensuite repartis en 34 mélanges
correspondant chacun à 10 clones différents et leur ADN est digéré par
EcoRI+
BglII, migrés en gel d'agarose, transferés sur membrane pour être ensuite hybridés avec
la sonde
PRB1 de
S. cerevisiae en conditions peu stringentes d'hybridation et de lavage. La Figure 3 montre ce Southern
blot où deux mélanges (n° 18 et n° 31) présentent un signal d'hybridation de la taille
attendue (environ 700 pb). La même opération est faite pour analyser séparément les
10 clones des mélanges n° 18 et n° 31 : le clone n° 3 est le seul clone du mélange
n° 18 à présenter un signal d'hybridation à la taille attendue (clone 18-3) ; de façon
analogue, seul le clone I du mélange 31 (clone 31-I) donne un signal d'hybridation
à la taille attendue. Un dernier Southern blot est réalisé à partir de l'ADN des clones
18-3 et 31-I (signal positif) et d'un clone négatif (clone K du mélange n° 31). Dans
les conditions d'hybridation et de lavage définies précédemment, seuls les clones
18-3 et 31-I confirment la présence d'un signal positif après digestion double
EcoRI+
BglII, et dont la taille semble strictement équivalente (Fig. 4).
E.1.4. Identification du gène.
[0047] La séquence nucléotidique du fragment
BglII-
EcoRI du clone 18-3 est réalisée pour démontrer que ce fragment correspond bien à une
fraction du gène
PRB1 de
K. lactis.
[0048] Une carte de restriction sommaire du plasmide pYG1224 du clone 18-3 est d'abord réalisée
et révèle la présence d'un site
SalI apparemment unique au centre du fragment
BglII-
EcoRI. Les fragments
BglII-
SalI (environ 350 pb) et
SalI-
EcoRI (environ 300 pb) du plasmide pYG1224 sont alors clonés dans le vecteur pUC19, ce
qui génère les plasmides pYG1226 et pYG1227 respectivement (Fig. 6A). Les inserts
de ces plasmides sont alors séquencés en entier en utilisant les "amorces universelles".
Comme indiqué à la Figure 5, le fragment
BglII-
EcoRI du plasmide pYG1224 comporte une phase ouverte de lecture (225 résidus) qui présente
des homologies de séquences avec un fragment du gène
PRB1 de
S. cerevisiae (Arg
105 à Leu
328). La présence d'une telle homologie, de même que la stricte conservation des acides
aminés invariablement retrouvés dans les sérine-protéases de la famille des subtilisines
démontrent que le fragment d'ADN génomique porté par le plasmide pYG1224 correspond
bien à un fragment du gène
PRB1 de
K. lactis.
E.1.5. Clonage de la partie 3' du gène.
[0049] Le fragment
BglII-
EcoRI du plasmide pYG1224 comporte un site de restriction
KpnI unique localisé en aval du site
BglII (Fig. 6A). Le sous-fragment de restriction
KpnI-
EcoRI d'environ 665 nucléotides est donc généré à partir de ce fragment, isolé par électroélution
après migration en gel d'agarose à 1 % et marqué radioactivement par la méthode du
"random priming". Cette sonde radioactive est alors utilisée pour déterminer la taille
des fragments de restriction de l'ADN génomique de
K. lactis qui l'incluent. Un fragment
KpnI-
BglII d'environ 1,2 kb est ainsi détecté après hybridation et lavage en conditions stringentes
(hybridation pendant 15 heures à 40°C en 5X SSC/5X Denhart/50 % formamide, puis 3
lavages en 5X SSC/SDS 1 % à 40°C pendant 15 minutes, puis 1 lavage en 0,2X SSC/SDS
1 % pendant 10 minutes). Une banque restreinte d'ADN génomique de
K. lactis (fragments de restriction KpnI-BglII de taille comprise entre 1 et 1.5 kb) est alors
construite selon l'exemple E.1.3. et le fragment de restriction hybridant avec la
sonde est cloné entre les sites
KpnI et
BamHI du vecteur pIC-20H, ce qui génère le plasmide pYG1231 (Fig. 6B). L'insert génomique
de ce plasmide est ensuite séquence en utilisant l'oligodéoxynucléotide Sq2101 (5'-GACCTATGGGGTAAGG-ATTAC-3')
comme amorce. Cet oligodéoxynucléotide correspond à une séquence nucléotidique présente
sur le fragment
BglII-
EcoRI du plasmide pYG1224 et localisée à environ 30 nucléotides du site
EcoRI. Il permet donc de déterminer la séquence nucléotidique située en 3' de ce site
de restriction, et notamment la séquence localisée entre le site
EcoRI et le codon spécifiant la terminaison de la traduction de l'ARN messager correspondant
au gène
PRB1 de
K. lactis.
E.1.6. Clonage de la partie 5' du gène.
[0050] La séquence nucléotidique réalisée en E.1.5. démontre l'existence d'un site de restriction
HindIII localisé entre le site
EcoRI et le codon de fin de traduction. L'utilisation du fragment de restriction
KpnI-
EcoRI correspondant à la partie C-terminale du gène
PRB1 de
K. lactis comme sonde radioactive sur de l'ADN génomique de
K. lactis digéré par
HindIII et une seconde enzyme permet d'identifier par Southern blot un fragment
HindIII
-EcoRV de 1,7 kb environ qui hybride avec cette sonde. Ce fragment de restriction est d'abord
cloné entre les sites
EcoRV et
HindIII du vecteur pIC-20R ce qui génère le plasmide pYG1237. Une carte de restriction
de l'insert d'ADN génomique contenu dans le plasmide pYG1237 est réalisé (Fig. 6C),
et les plasmides suivants sont générés : pYG1238 (plasmide pYG1237 délété de son fragment
PstI), pYG1239 (fragment
PstI de pYG1237 dans le vecteur pUC19), pYG1240 (plasmide pYG1237 délété de son fragment
KpnI), pYG1241 (plasmide pYG1237 délété de son fragment
ClaI) et pYG1242 (plasmide pYG1237 délété de son fragment
SalI; Fig. 6C). Les inserts génomiques de ces différents plasmides sont alors séquencés
à l'aide des amorces universelles et de l'oligodéoxynucléotide Sq2148 (5'-GCTTCGGCAACATATTCG-3')
qui permet de séquencer la région située immédiatement en 5' du site
BglII. Cette stratégie permet d'obtenir des séquences chevauchantes démontrant l'unicité
des sites de restriction
BglII,
ClaI et
PstI et permettant d'identifier l'ATG probable d'initiation de la traduction du gène
PRB1 de
K. lactis.
E.1.7. Séquence nucléotidique du gène PRB1 de K. lactis.
[0051] La compilation des séquences déterminées en E.1.4., E.1.5. et E.1.6. recouvre l'intégralité
de la phase codante du gène
PRB1 de
K. lactis (Fig. 6D). Cette séquence est donnée SEQ ID n° 1 et code pour une protéine de 561
résidus correspondant à la protéase B de
K. lactis.
EXEMPLE 2 : CLONAGE DU GENE DE LA CARBOXYPEPTIDASE Y DE K. LACTIS.
[0052] La stratégie générale décrite dans l'exemple 1 est reprise pour le clonage du gène
de la carboxypeptidase Y de
K. lactis CBS 2359/152.
E.2.1. Préparation de la sonde.
[0053] Une préparation d'ADN génomique de la souche
S. cerevisiae S288C [Mortimer et Johnston, Genetics
113 (1986) 35] est d'abord effectuée selon l'exemple E.1.2. Une amplification par PCR
de cette préparation d'ADN génomique est ensuite réalisée avec les oligonucléotides
5'-CTTCTTGGAGTTGTTCTTCG-3' et 5'-TGGCAAGACATCCGTCCACGCCTTATT-ACC-3', spécifiques du
gène
PRC1. Un fragment amplifié de la taille attendue (699 pb) est ainsi obtenu qui correspond
aux positions 696-1395 (le codon d'initiation ATG étant numéroté +1) de la phase ouverte
de lecture du gène
PRC1 de
S. cerevisiae [Valls et al., Cell
48 (1987) 887]. Ce fragment est ensuite purifié par électroélution et radiomarqué selon
la technique du "Random Priming".
E.2.2. Clonage du gène PRC1 de K. lactis.
[0054] Le gène
PRC1 de
K. lactis est obtenu par criblage de la banque génomique de
K. lactis construite par Wésolowski-Louvel [Yeast
4 (1988) 71] à partir de la souche 2359/152 dans le vecteur de clonage KEp6 [Chen et
al., J. Basic. Microbiol.
28 (1988) 211]. La souche
E.coli JM101 est transformée par l'ADN de la banque et les transformants sont étalés sur
milieu LB supplémenté avec de l'ampicilline (50 mg/l). 15000 clones sont ensuite transférés
sur filtres de nitrocellulose et les filtres sont hybridés avec la sonde décrite dans
l'exemple E.2.1. Les conditions d'hybridation et de lavage sont celles de l'exemple
E.1.3. 12 clones positifs sont ainsi isolés et l'un d'entre-eux, désigné pC34, est
ensuite retenu pour la suite de l'étude. Dans un premier temps, l'hybridation du plasmide
pC34 avec la sonde correspondant au gène
PRC1 de
S. cerevisiae est confirmée en Southern blot. Une carte de restriction de l'insert génomique (environ
6,9 kb) du plasmide pC34 est donnée à la Figure 8. La séquence du fragment
EcoRI-
SalI de 2,5 kb comprenant le gène
PRC1 de
K. lactis est ensuite déterminée sur les 2 brins. Cette séquence est présentée SEQ ID n° 2.
EXEMPLE 3 : CLONAGE DU GENE DE LA PROTEASE A DE K. LACTIS.
[0055] La stratégie générale décrite dans les exemples précédents est reprise pour le clonage
du gène de la protéase A de
K. lactis CBS 2359/152.
E.3.1. Préparation de la sonde.
[0056] Un fragment interne de 449 pb du gène
PRA1 (ou gène
PEP4) de
S. cerevisiae est d'abord amplifié par la technique PCR à partir du plasmide CBZ1B1 [Woolford et
al., Mol. Cell. Biol.
6 (1986) 2500] fourni par le Dr E. Jones (Carnegie-Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania,
USA) et des oligodéoxynucléotides 5'-CTGTTGATAAGGTGGTCC-3' et 5'-CAAGCGT-GTAATCGTATGGC-3'.
Le fragment amplifié obtenu correspond aux positions 617-1066 de la phase ouverte
de lecture du gène
PRA1 de
S. cerevisiae, le codon d'initiation ATG étant numéroté +1. Ce fragment est ensuite purifié par
électroélution et radiomarqué selon la technique du "Random Priming".
E.3.2. Clonage du gène PRA1 de K. lactis
[0057] Le gène
PRA1 est obtenu par criblage de la banque génomique de
K. lactis construite par Wésolowski-Louvel [Yeast
4 (1988) 71] à partir de la souche 2359/152 dans le vecteur de clonage KEp6 [Chen et
al., J. Basic Microbiol.
28 (1988) 211]. Après transformation de la banque dans
E. coli JM101 et sélection en présence d'ampicilline (50 mg/l), 15000 clones sont ensuite
transférés sur filtres de nitrocellulose et les filtres sont hybridés avec la sonde
décrite dans l'exemple E.3.1. Les conditions d'hybridation et de lavage sont celles
de l'exemple E.1.3. 1 seul clone positif est ainsi isolé et désigné pA25/1. Dans un
premier temps, l'hybridation du plasmide pA25/1 avec la sonde correspondant au gène
PRA1 de
S. cerevisiae est confirmée en Southern blot. Une carte de restriction de l'insert génomique (environ
7,5 kb) de ce plasmide est présentée à la Figure 10. La séquence du fragment ClaI-
EcoRI de 1,6 kb comprenant le gène
PRA1 de
K. lactis est ensuite déterminée sur les 2 brins. Cette séquence est présentée SEQ ID n° 3.
EXEMPLE 4 : TRANSFORMATION DES LEVURES.
[0058] La transformation des levures appartenant au genre
Kluyveromyces, et en particulier les souches
K. lactis MW98-8C, CBS 293.91 et CBS 294.91
(uraA) s'effectue par exemple par la technique de traitement des cellules entières par de
l'acétate de lithium [Ito H. et al., J. Bacteriol.
153 (1983) 163-168], adaptée comme suit. La croissance des cellules se fait à 28°C dans
50 ml de milieu YPD. avec agitation et jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO
600) comprise entre 0,6 et 0,8; les cellules sont alors récoltées par centrifugation
à faible vitesse, lavées dans une solution stérile de TE (10 mM Tris HCl pH 7,4 ;
1 mM EDTA), resuspendues dans 3-4 ml d'acétate lithium (0,1 M dans du TE) pour obtenir
une densité cellulaire d'environ 2 x 10
8 cellules/ml, puis incubées à 30°C pendant 1 heure sous agitation modérée. Des aliquotes
de 0,1 ml de la suspension résultante de cellules compétentes sont incubés à 30°C
pendant 1 heure en présence d'ADN et à une concentration finale de 35 % de polyéthylène
glycol (PEG
4000, Sigma). Après un choc thermique de 5 minutes à 42°C, les cellules sont lavées 2
fois, puis resuspendues dans 0,2 ml d'eau stérile. Dans le cas ou le marqueur de sélection
est le gène
URA3 de
S.
cerevisiae, les cellules sont directement étalées sur YNB (Yeast Nitrogen Base ; Difco)/Glucose
(20 g/l)/agar. Dans le cas ou le marqueur de sélection est le gène
aph du transposon Tn
903, les cellules sont d'abord incubées pendant 16 heures à 28°C dans 2 ml de milieu
YPD pour permettre l'expression phénotypique du géne de résistance au G418 exprimé
sous contrôle du promoteur P
k1 (cf. EP 361 991) ; 200 µl de la suspension cellulaire sont ensuite étalés sur boîtes
YPD sélectives (G418, 200 µg/ml). Les boîtes sont mises à incuber à 28°C et les disruptants
ou les transformants apparaissent après 2 à 3 jours de croissance cellulaire.
EXEMPLE 5 : DISRUPTION DE GENES DE PROTEASES CHEZ K. LACTIS.
E.5.1. Souches de K. lactis disruptées pour le gène PRB1.
[0059] Le plasmide pYG1229 est construit par clonage du fragment
HindIII-
EcoRI (incluant le fragment
BglII-
EcoRI d'environ 700 bp et correspondant à la partie C-terminale du gène
PRB1 de
K, lactis) du plasmide pYG1224 entre les sites correspondant du plasmide pUC9. Le plasmide pYG1228
est construit par clonage du fragment
HindIII de 1,1 kb et correspondant au gène
URA3 de
S. cerevisiae provenant du plasmide pCG3 [Gerbaud et al., Curr. Genetics
3 (1981) 173] dans le site
HindIII du plasmide pIC-20R. Le plasmide pYG1228 permet donc de disposer d'un fragment
de restriction
SalI-
XhoI d'environ 1,1 kb et contenant l'intégralité du fragment
HindIII contenant le gène
URA3 de
S. cerevisiae. Ce fragment de restriction est ensuite cloné dans le site
SalI du plasmide pYG1229 ce qui génère le plasmide pYG1232 (2 orientations possibles).
La digestion de ce plasmide par les enzymes
BglII et
EcoRI permet de générer un fragment de restriction d'environ 1,8 kb correspondant au gène
URA3 de
S. cerevisiae bordé par des séquences génomiques de
K. lactis provenant du gène
PRB1 (Fig. 11A). La transformation de mutants
uraA de
K. lactis par le fragment
BglII-
EcoRI du plasmide pYG1232 génère des clones transformés (complémentés par le gène
URA3 de
S. cerevisiae) correspondant à l'intégration de ce fragment dans le chromosome. Le panneau B de
la Figure 11 montre l'intégration de ce fragment dans l'ADN génomique de la souche
K. lactis CBS 294.91 (
uraA) après recombinaison non-homologue (puits 1) ou après recombinaison homologue dans
le gène
PRB1 (puits 3, ce disruptant est noté Y750). La disruption de l'allèle sauvage du gène
PRB1 ne modifie pas les caractéristiques de croissance de la souche.
E.5.2. Souches de K. lactis disruptées pour le gène PRC1.
[0060] Le fragment
SalI-
SphI de 4,4 kb provenant du plasmide pC34 est d'abord sous-cloné dans les sites correspondants
du vecteur pIC-20R, ce qui génère le plasmide pYG154 (Fig. 12, panneau b). Ce plasmide
est ensuite digéré par l'enzyme
SphI, puis traité avec l'ADN polymérase I du phage T4 en présence de phosphatase intestinale
de veau (CIP). Le plasmide obtenu est ensuite ligaturé avec le fragment
EcoRI de 1,6 kb portant le gène
URA3 de
S. cerevisiae provenant du plasmide pKan707 (EP 361 991), préalablement traité avec le fragment
Klenow de l'ADN polymérase I d'
E. coli. Le plasmide obtenu est désigné pYG155 (Fig. 12, panneau c). Le fragment
SalI-
BamHI de 4,5 kb du plasmide pYG155 est ensuite purifié par électroélution et utilisé pour
transformer la souche
K. lactis CBS 294.91 (
uraA). Les transformants sont sélectionnés pour le phénotype Ura
+ et quelques clones sont ensuite analysés en Southern blot pour vérifier le lieu d'intégration
du marqueur
URA3. Le clone Y797 est ainsi identifié dans lequel le gène
PRC1 chromosomique a été remplacé, par recombinaison homologue, par l'allèle disrupté
construit
in vitro. La disruption de l'allèle sauvage du gène
PRC1 ne modifie pas les caractéristiques de croissance de la souche.
EXEMPLE 6 : PLASMIDES D'EXPRESSION.
E.6.1. Plasmide pYG1212.
[0061] Les gènes des protéines d'intérêt que l'on souhaite sécréter et/ou exprimer sont
d'abord insérés, "dans l'orientation productive" (définie comme l'orientation qui
place la région N-terminale de la protéine de façon proximale par rapport au promoteur
de transcription), sous contrôle de promoteurs fonctionnels, régulables ou constitutifs,
tels que, par exemple, ceux présents dans les plasmides pYG105 (promoteur
LAC4 de
K,
lactis), pYG106 (promoteur
PGK de
S.cerevisiae), pYG536 (promoteur
PHO5 de
S. cerevisiae), ou des promoteur hybrides tels que ceux décrits dans la demande de brevet EP 361
991. Les plasmides pYG105 et pYG106 sont particulièrement utiles car ils permettent
l'expression de gènes inclus dans des fragments de restriction
HindIII à partir de promoteurs fonctionnels chez
K. lactis, régulables (pYG105) ou constitutifs (pYG106).
[0062] Le plasmide pYG105 correspond au plasmide pKan707 décrit dans la demande de brevet
EP 361 991 dans lequel le site de restriction
HindIII unique et localisé dans le gène de résistance à la généticine (G418) a été détruit
par mutagénèse dirigée tout en conservant une protéine inchangée (oligodéoxynucleotide
5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3'). Le fragment
SalI-
SacI codant pour le gène
URA3 du plasmide ainsi muté a été ensuite remplacé par un fragment de restriction SalI-SacI
comportant une cassette d'expression constituée du promoteur
LAC4 de
K. lactis [sous la forme d'un fragment
SalI-
HindIII provenant du plasmide pYG107 ; Fleer et al., Bio/Technology 9 (1991) 968]) et
du terminateur du gène
PGK de
S. cerevisiae [sous la forme d'un fragment
HindIII-
SacI ; Fleer et al., Bio/Technology 2 (1991) 968]. Le plasmide pYG105 est mitotiquement
très stable chez les levures
Kluyveromyces et une carte de restriction en est donnée à la Figure 13. Les plasmides pYG105 et
pYG106 ne diffèrent entre eux que par la nature du promoteur de transcription encodé
par le fragment
SalI-
HindIII.
[0063] La protéine codée par le plasmide pYG1212 correspond approximativement aux deux premiers
domaines de la sérum albumine humaine (SAH). Ce variant moléculaire, obtenu par digestion
de l'extrémité C-terminale de la SAH en utilisant l'exonucléase Ba131 à partir du
site
MstII unique localisé à 3 acides aminés de l'extrémité C-terminale de la SAH, est dérivé
du plasmide YP40 décrit dans la demande de brevet EP 413 622. Brièvement, le fragment
de restriction
HindIII-
MstII du plasmide YP40, correspondant aux résidus 1 à 403 de la SAH (l'ATG d'initiation
de la traduction est noté +1), est ligaturé avec le fragment
MstII-
HindIII du plasmide pYG221 [Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89 (1992) 1904], ce qui génère un fragment
HindIII incluant les 403 résidus N-terminaux de la SAH suivi des trois derniers résidus
de la SAH (résidus Leu-Gly-Leu) et d'un codon de fin de traduction [variant tronqué
noté SAH
(1-403)]. Ce fragment-
HindIII est ensuite cloné dans l'orientation productive dans le plasmide pYG105, ce qui
génère le plasmide pYG1212 (Fig.13).
EXEMPLE 7 : POTENTIEL DE SECRETION DES DISRUPTANTS.
E.7.1. SAH(1-403) dans un disruptant pour la protéase B.
[0064] Dans un premier temps, les levures
K. lactis CBS 293.91 et Y750 sont transformées par le plasmide pYG1212. Après sélection sur
milieu riche supplémenté en G418 les clones recombinants sont testés pour leur capacité
à sécréter la protéine SAH
(1-403). Quelques clones sont mis à incuber en milieu YPD ou YPL à 28°C. Les surnageants
de culture sont récupérés par centrifugation quand les cellules atteignent la phase
stationnaire de croissance, concentrés 10 fois par précipitation pendant 30 minutes
à -20°C dans une concentration finale de 60 % d'éthanol, puis testés après électrophorèse
en gel SDS-PAGE à 8.5 % et coloration du gel par du bleu de coomassie. Les résultats
présentés à la Figure 14 démontrent que le disruptant Y750
(prb1°) sécrète des quantités de la protéine qui sont bien supérieures aux quantités sécrétées
par son homologue non disrupté. Ceci est valable après 2, 4 ou 7 jours de croissance,
indépendamment de la source de carbone utilisée (glucose ou lactose).
LISTE DE SEQUENCES
[0065]
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Levures Kluyveromyces modifiées, préparation et utilisations.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
- (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
- (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
- (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
- (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
- (A) LONGUEUR: 1686 paires de bases
- (B) TYPE: acide nucléique
- (C) NOMBRE DE BRINS: double
- (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Kluyveromyces lactis
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1686
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Gene de la protease B" /gene= "K1.PRB1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
- (A) LONGUEUR: 2503 paires de bases
- (B) TYPE: acide nucléique
- (C) NOMBRE DE BRINS: double
- (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Kluyveromyces lactis
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 387..1862
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Gene de la protease C de K.lactis" /gene= "Kl.PRC1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1615 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(B) SOUCHE: Kluyveromyces
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 188..1417
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /product= "Gene de la protease A" /gene= "PRA1"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
1. Hefe der Gattung Kluyveromyces, die eine oder mehrere genetische Modifikationen in mindestens einem Gen aufweist,
das für eine Protease codiert, die ausgewählt ist aus Protease A, dargestellt durch
die Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 3, Protease B, dargestellt durch die Polypeptidsequenz
SEQ ID NR. 1, und Carboxypeptidase Y, dargestellt durch die Sequenz SEQ ID NR. 2,
wobei diese genetischen Modifikationen die proteolytische Aktivität dieser Hefen verringern.
2. Hefe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen das Gen teilweise oder vollständig
unfähig machen, für das natürliche Protein zu codieren.
3. Hefe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die derart genetisch modifizierte(n) Gen oder Gene für ein nicht-funktionelles
Protein oder für eine Mutante mit einem modifizierten proteolytischen Aktivitätsspektrum
codiert/codieren.
4. Hefe nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen segregationsstabil sind.
5. Hefe nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen irreversibel ist/sind.
6. Hefe nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen keinerlei Restaktivität des betreffenden
Gens belässt/belassen.
7. Hefe nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen sich auf den Teil, der für ein
Protein mit einer Proteaseaktivität codiert, und/oder auf Regionen, die für die Expression
und/oder Transkriptionsregulation dieser Gene verantwortlich sind; erstreckt/erstrecken.
8. Hefe nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische(n) Modifikation oder Modifikationen Punktmutationen oder Mehrfachmutationen
und/oder Additionen und/oder Deletionen und/oder Disruptionen ist/sind.
9. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Gen von Kluyveromyces handelt, das aus den Genen PRB1 (SEQ ID NR. 1), PRC1 (SEQ ID NR. 2) und PRA1 (SEQ ID NR. 3) ausgewählt ist.
10. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus den Hefen der Spezies K. lactis, K. fragilis, K. drosophilarum und K. waltii ausgewählt ist.
11. Hefe der Gattung Kluyveromyces, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere genetische Modifikationen in mindestens einem Gen aufweist,
das für eine Protease codiert, die ausgewählt ist aus Protease A, dargestellt durch
die Polypeptidsequenz SEQ ID NR. 3, Protease B, dargestellt durch die Polypeptidsequenz
SEQ ID NR. 1, und Carboxypeptidase Y, dargestellt durch die Sequenz SEQ ID NR. 2,
wobei diese genetischen Modifikationen die proteolytische Aktivität dieser Hefen verringern,
und dadurch, dass sie mindestens eine exogene DNA-Sequenz umfasst, die für mindestens ein Protein
von Interesse codiert.
12. Hefe nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA-Sequenz eine Transkriptions- und Translationsstartregion, angefügt
an das 5'-Ende der Sequenz, die für das Protein von Interesse codiert, enthält.
13. Hefe nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die für das Protein von Interesse codierende Sequenz eine Exportsequenz enthält,
die das Protein in den sekretorischen Weg dirigiert.
14. Hefe nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene DNA-Sequenz Teil eines autonom replizierenden Vektors oder in das Chromosom
integriert ist.
15. Hefe nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Protein(e) von Interesse pharmazeutisch oder in der Landwirtschaft/Nahrungsmittelindustrie
verwendet werden.
16. Hefe nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die Protein(e) künstliche Proteine und beispielsweise Hybride sind.
17. Verwendung einer Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung rekombinanter
Proteine.
18. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hefe nach einem der Ansprüche 11 bis 16 unter Bedingungen der Expression
des oder der Protein(s/e), das/die von der exogenen DNA-Sequenz codiert wird/werden,
kultiviert und das oder die Protein(e) von Interesse gewinnt.
19. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung von Proteinen, die pharmazeutisch oder
für die Landwirtschaft/Nahrungsmittelindustrie von Interesse sind.
20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung künstlicher und insbesondere hybrider Proteine.
21. Verfahren zur Herstellung einer Kluyveromyces-Hefe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das gesamte oder einen Teil der chromosomalen Gene PRB1 (SEQ ID NR. 1), PRC1 (SEQ ID NR. 2) oder PRA1 (SEQ ID NR. 3) durch eine in vitro modifizierte Version ersetzt.