[0001] Die Erfindung betrifft antibakterielle Amid-Makrozyklen und Verfahren zu ihrer Herstellung,
ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung
zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten,
insbesondere von bakteriellen Infektionen.
[0003] In
US 3,452,136, Dissertation
R. U. Meyer, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Dissertation V. Leitenberger, Universität Stuttgart, Deutschland 1991,
Synthesis (1992), (10), 1025-30,
J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (1992), (1), 123-30,
J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1991), (10), 744,
Synthesis (1991), (5), 409-13,
J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1991), (5), 275-7,
J. Antibiot. (1985), 38(11), 1462-8,
J. Antibiot. (1985), 38(11), 1453-61, wird der Naturstoff Biphenomycin B als antibakteriell wirksam beschrieben. Teilschritte
der Synthese von Biphenomycin B werden in
Synlett (2003), 4, 522-526 beschrieben.
[0004] Chirality (1995), 7(4), 181-92,
J. Antibiot. (1991), 44(6), 674-7,
J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7323-7,
J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7328-33,
J. Org. Chem. (1987), 52(24), 5435-7,
Anal. Biochem. (1987), 165(1), 108-13,
J. Org. Chem. (1985), 50(8), 1341-2,
J. Antibiot. (1993), 46(3), C-2,
J. Antibiot. (1993), 46(1), 135-40,
Synthesis (1992), (12), 1248-54,
Appl. Environ. Microbiol. (1992), 58(12), 3879-8,
J. Chem. Soc., Chem. Commun. (1992), (13), 951-3 beschreiben einen strukturell verwandten Naturstoff, Biphenomycin A, der am Makrozyklus
eine weitere Substitution mit einer Hydroxygruppe aufweist.
[0005] Die Naturstoffe entsprechen hinsichtlich ihrer Eigenschaften nicht den Anforderungen,
die an antibakterielle Arzneimittel gestellt werden. Auf dem Markt sind zwar strukturell
andersartige antibakteriell wirkende Mittel vorhanden, es kann aber regelmäßig zu
einer Resistenzentwicklung kommen. Neue Mittel für eine gute und wirksamere Therapie
sind daher wünschenswert.
[0006] Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Verbindungen
mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung zur Behandlung von bakteriellen
Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
[0007] Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Derivate dieser Naturstoffe, worin
die Carboxylgruppe des Naturstoffs gegen eine tertiäre Amidgruppe ausgetauscht wird,
die eine basische Gruppe enthält, gegen Biphenomycin resistente
S. aureus Stämme (RN4220Bi
R und T17) antibakteriell wirksam sind.
[0008] Weiterhin zeigen die Derivate gegen
S.
aureus Wildtyp-Stämme und Biphenomycin resistente
S.
aureus Stämme eine verbesserte Spontanresistenz-Frequenz.
[0009] Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
bei denen
- R5
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,
R1 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
- R2
- gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
- R3
- gleich eine Gruppe der Formel
oder
ist,
wobei
- *
- die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
- R6
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
worin
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R11 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R12 gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
k eine Zahl 0 oder 1 ist,
l eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 ist,
und
m und n unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind,
- R7
- gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
- R8, R9 und R10
- unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel
sind,
worin
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R13 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R14 gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder Hydroxyethyl sind,
o eine Zahl 0 oder 1 ist,
p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,
- R4
- gleich Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Amino oder Methyl ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
[0010] Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze,
Solvate und Solvate der Salze, sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als
Ausführungsbeispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate
der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten
Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
[0011] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren
Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die
Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen
von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich durch bekannte Verfahren wie
Chromatographie an chiraler Phase oder Kristallisation mit chiralen Aminen oder chiralen
Säuren die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
[0012] Die Erfindung betrifft in Abhängigkeit von der Struktur der Verbindungen auch Tautomere
der Verbindungen.
[0013] Als
Salze sind im Rahmen der Erfmdung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen
Verbindungen bevorzugt.
[0014] Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen Säureadditionssalze
von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure,
Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure,
Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Trifluoressigsäure
und Benzoesäure.
[0015] Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen auch Salze üblicher
Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze),
Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von
Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise
Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin,
Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin,
N-Methylmorpholin, Dihydroabietylamin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und Methylpiperidin.
[0016] Als
Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der Verbindungen bezeichnet, welche
in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen
Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination
mit Wasser erfolgt.
[0017] Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod. Ein Symbol # an einem Kohlenstoffatom bedeutet,
dass die Verbindung hinsichtlich der Konfiguration an diesem Kohlenstoffatom in enantiomerenreiner
Form vorliegt, worunter im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Enantiomerenüberschuss
(enantiomeric excess) von mehr als 90 % verstanden wird (> 90% ee).
[0018] In den Formeln der Gruppen, die für R
3 stehen, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein
Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH
2-Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu der Carbonyl-Gruppe, an das R
3 gebunden ist.
[0019] In den Formeln der Gruppen, für die R
5 stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für
ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH
2-Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Kohlenstoffatom, an das R
7 gebunden ist.
[0020] In den Formeln der Gruppen, die für R
6, R
8, R
9 und R
10 stehen, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein
Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH
2-Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Stickstoffatom, an das R
6, R
8, R
9 und R
10 gebunden sind.
[0021] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
bei denen
- R1
- gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
- R2
- gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
- R3
- wie oben definiert ist,
- R4
- gleich Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Amino oder Methyl ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
[0022] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R2
- gleich Wasserstoff ist.
[0023] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R4
- gleich Wasserstoff, Hydroxy, Chlor oder Methyl ist.
[0024] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R4
- gleich Hydroxy ist.
[0025] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R5
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,
R1 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist.
[0026] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R5
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,
R1 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
- R2
- gleich Wasserstoff ist,
- R3
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R6 gleich eine Gruppe der Formel
ist,
worin
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R11 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R12 gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
k eine Zahl 0 oder 1 ist,
l eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 ist,
und
m und n unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind,
- R4
- gleich Hydroxy ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
[0027] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R5
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,
R1 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
- R2
- gleich Wasserstoff ist,
- R3
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R7 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R8 und R10 unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel
sind,
worin
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R13 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R14 gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder Hydroxyethyl sind,
o eine Zahl 0 oder 1 ist,
p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,
- R4
- gleich Hydroxy ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
[0028] Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel
(I) oder (Ia), bei denen
- R5
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,
R1 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,
- R2
- gleich Wasserstoff ist,
- R3
- gleich eine Gruppe der Formel
ist,
wobei
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R9 eine Gruppe der Formel
ist,
worin
* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,
R13 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,
R14 gleich Wasserstoff oder Methyl ist,
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder Hydroxyethyl sind,
o eine Zahl 0 oder 1 ist,
p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,
- R4
- gleich Hydroxy ist,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
[0029] Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei
nach Verfahren
- [A] Verbindungen der Formel
worin R2, R4 und R5 die oben angegebene Bedeutung haben und boc gleich tert-Butoxycarbonyl ist,
in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien
mit Verbindungen der Formel
HR3 (III),
worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat,
und anschließend mit einer Säure und/oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden,
oder
- [B] Verbindungen der Formel
worin R2, R4 und R5 die oben angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxycarbonyl ist,
in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren Dehydratisierungsreagenzien
mit Verbindungen der Formel
HR3 (III),
worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat,
und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden.
[0030] Die freie Base der Salze kann zum Beispiel durch Chromatographie an einer Reversed
Phase Säule mit einem Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz einer Base erhalten
werden, insbesondere durch Verwendung einer RP18 Phenomenex Luna C18(2) Säule und
Diethylamin als Base.
[0031] Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
der Formel (I) oder ihrer Solvate nach Anspruch 1, bei dem Salze der Verbindungen
oder Solvate der Salze der Verbindungen durch Chromatographie unter Zusatz einer Base
in die Verbindungen überführt werden.
[0032] Die Hydroxygruppe an R
1 ist gegebenenfalls während der Umsetzung mit Verbindungen der Formel (III) mit einer
tert-Butyldimethylsilyl-Gruppe geschützt, die im zweiten Reaktionsschritt abgespalten
wird.
[0033] Reaktive Funktionalitäten in dem Rest R
3 von Verbindungen der Formel (III) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht,
bevorzugt sind säurelabile Schutzgruppen (z.B. boc). Nach erfolgter Umsetzung zu Verbindungen
der Formel (I) können die Schutzgruppen durch Entschützungsreaktion abgespalten werden.
Dies geschieht nach Standardverfahren der Schutzgruppenchemie. Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen
unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.
[0034] Die Umsetzung der ersten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt im Allgemeinen in
inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem
Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0035] Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie
z.B.
N,N'-Diethyl-,
N,N'-Dipropyl-,
N,N'-Diisopropyl-,
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid,
N-(3-Dimethylamino-isopropyl)-
N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC),
N-Cyclohexylcarbodiimid-
N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol,
oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat,
oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder
Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid
oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-1-yl)-
N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
(TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-
N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluoro-phosphat (BOP), oder
Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP), oder
Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen mit Basen.
[0036] Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat,
oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin,
N-Methylmorpholin,
N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
[0037] Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU in Gegenwart einer Base, insbesondere
Diisopropylethylamin, oder mit PyBOP in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin,
durchgeführt.
[0038] Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan
oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid
oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders
bevorzugt ist Dimethylformamid.
[0039] Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt
bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0040] Als Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure
oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.
[0041] Die Hydrogenolyse in der zweiten Stufe des Verfahrens [B] erfolgt im Allgemeinen
in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle,
bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0042] Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder
iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Eisessig, bevorzugt ist ein Gemisch
aus Ethanol, Wasser und Eisessig.
[0043] Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren
hergestellt werden.
[0044] Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4 und R
5 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Di-(
tert-butyl)-dicarbonat in Gegenwart einer Base umgesetzt werden.
[0045] Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem
Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0046] Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder
Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen
wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Natriumhydroxid oder
Natriumcarbonat.
[0047] Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder
1,2-Dichlorethan, Alkohole wie Methanol, Ethanol oder iso-Propanol, oder Wasser.
[0048] Vorzugsweise wird die Umsetzung mit Natriumhydroxid in Wasser oder Natriumcarbonat
in Methanol durchgeführt.
[0049] Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4 und R
5 die oben angegebene Bedeutung haben, und
- R17
- gleich Benzyl, Methyl oder Ethyl ist,
mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse, wie für die zweite Stufe des Verfahrens
[B] beschrieben, gegebenenfalls durch anschließende Umsetzung mit einer Base zur Verseifung
des Methyl- oder Ethylesters, umgesetzt werden.
[0050] Die Verseifung kann zum Beispiel erfolgen, wie bei der Umsetzung von Verbindungen
der Formel (VI) zu Verbindungen der Formel (IV) beschrieben.
[0051] Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
in Verbindungen der Formel (VI) der Benzyl-, Methyl- oder Ethylester verseift wird.
[0052] Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, in Gegenwart einer
Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0053] Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid,
bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
[0054] Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder
Trichlormethan, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Alkohole wie Methanol,
Ethanol oder Iso-propanol, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische
der Lösungsmittel oder Gemische der Lösungsmittel mit Wasser einzusetzen. Besonders
bevorzugt sind Tetrahydrofuran oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser.
[0055] Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4, R
5 und R
17 die oben angegebene Bedeutung haben,
in der ersten Stufe mit Säuren, wie für die zweite Stufe der Verfahren [A] und [B]
beschrieben, und in der zweiten Stufe mit Basen umgesetzt werden.
[0056] In der zweiten Stufe erfolgt die Umsetzung mit Basen im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln,
bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0057] Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder
Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen
wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Triethylamin.
[0058] Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Chloroform, Methylenchlorid
oder 1,2-Dichlorethan, oder Tetrahydrofuran, oder Gemische der Lösungsmittel, bevorzugt
ist Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran.
[0059] Die Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4, R
5 und R
17 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Pentafluorphenol in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste
Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.
[0060] Die Umsetzung erfolgt bevorzugt mit DMAP und EDC in Dichlormethan in einem Temperaturbereich
von -40°C bis 40°C bei Normaldruck.
[0061] Die Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4, R
5 und R
17 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Fluorid, insbesondere mit Tetrabutylammoniumfluorid, umgesetzt werden.
[0062] Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem
Temperaturbereich von -10°C bis 30°C bei Normaldruck.
[0063] Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan,
oder Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder
Dioxan, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen.
Bevorzugte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran und Dimethylformamid.
[0064] Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem
Verbindungen der Formel
worin R
2, R
4 und R
17 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Verbindungen der Formel
worin R
5 die oben angegebene Bedeutung hat,
in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren
[A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.
[0065] Die Verbindungen der Formel (X) sind bekannt oder können analog den im Beispielteil
beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
[0066] Die Verbindungen der Formel (XI) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren
hergestellt werden.
[0067] Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches
und pharmakokinetisches Wirkspektrum.
[0068] Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
[0069] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften
allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Infektionskrankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.
[0070] Beispielsweise können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder
verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden
Erreger verursacht werden:
Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (Staph. aureus, Staph. epidermidis) und
Streptokokken (Strept. agalactiae, Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes);
gram-negative Kokken (neisseria gonorrhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen,
z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob.
divernis), Salmonella und Shigella; ferner Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs.
oxytocy), Enterobacter (Ent. aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr.
marcescens), Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia, Yersinia,
sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle Spektrum
die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia) sowie strikt anaerobe Bakterien
wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus
sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykoplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum)
sowie Mykobakterien, z.B. Mycobacterium tuberculosis.
[0071] Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft aufzufassen. Als Krankheiten,
die durch die genannten Erreger oder Mischinfekionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen
topisch anwendbaren Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können,
seien beispielsweise genannt:
Infektionskrankheiten beim Menschen wie z. B. septische Infektionen, Knochen- und
Gelenkinfektionen, Hautinfektionen, postoperative Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone,
Wundinfektionen, infizierte Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich,
Infektionen nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis, Genital-Infektionen
und Augeninfektionen.
[0072] Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt
werden. Beispielhaft seien genannt:
Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Agalaktiae-Syndrom,
Mastitis;
Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose,
Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;
Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen,
Salmonellose;
Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Hamwegsinfekte, Prostatitis;
Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose, E. coli-Infektionen,
chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.
[0073] Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und
Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher
genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter,
Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie,
Yersinia, erweitert. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz
der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen,
vorzugsweise von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
[0074] Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der
zuvor genannten Erkrankungen.
[0075] Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
[0076] Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter
Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.
[0077] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem
Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral,
pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival,
otisch oder als Implantat bzw. Stent.
[0078] Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten
Applikationsformen verabreicht werden.
[0079] Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende
schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen,
die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder
gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten,
beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen
Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in
der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate,
Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets,
Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
[0080] Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen
(z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder
unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan
oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen
u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen,
Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
[0081] Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual
oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien,
Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen),
lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise
Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
[0082] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt
werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen,
pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a.
Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel
(z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise
Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon),
synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B.
Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente
wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
[0083] Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens
eine erfmdungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten,
nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung
zu den zuvor genannten Zwecken.
[0084] Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation
Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung wirksamer Ergebnisse
zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht
je 24 h.
[0085] Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen,
und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten
gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem
die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger
als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte
obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann
es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
[0086] Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders
angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse,
Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen
sich jeweils auf das Volumen.
A. Beispiele
Verwendete Abkürzungen:
[0087]
- abs.
- absolut
- aq.
- wässrig
- Bn
- Benzyl
- boc
- tert-Butoxycarbonyl
- Bsp.
- Beispiel
- CDCl3
- Chloroform
- CH
- Cyclohexan
- d
- dublett (im 1H-NMR)
- dd
- dublett von dublett (im 1H-NMR)
- DC
- Dünnschichtchromatographie
- DCC
- Dicyclohexylcarbodiimid
- DIC
- Diisopropylcarbodiimid
- DIEA
- Diisopropylethylamin (Hünig-Base)
- DMSO
- Dimethylsulfoxid
- DMAP
- 4-N,N-Dimethylaminopyridin
- DMF
- Dimethylformamid
- d. Th.
- der Theorie
- EDC
- N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid x HCl
- EE
- Ethylacetat (Essigsäureethylester)
- ESI
- Elektrospray-Ionisation (bei MS)
- Fmoc
- 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
- ges.
- gesättigt
- HATU
- O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
- HBTU
- O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat
- HOBt
- 1-Hydroxy-1H-benzotriazol x H2O
- h
- Stunde(n)
- HPLC
- Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
- LC-MS
- Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
- m
- multiplett (im 1H-NMR)
- min
- Minute
- MS
- Massenspektroskopie
- NMR
- Kernresonanzspektroskopie
- MTBE
- Methyl-tert-butylether
- Pd/C
- Palladium/Kohle
- PFP
- Pentafluorphenol
- proz.
- Prozent
- PyBOP
- Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluorophosphat
- q
- quartett (im 1H-NMR)
- Rf
- Retentionsindex (bei DC)
- RP
- Reverse Phase (bei HPLC)
- RT
- Raumtemperatur
- Rt
- Retentionszeit (bei HPLC)
- s
- singulett (im 1H-NMR)
- t
- triplett (im 1H-NMR)
- TBS
- tert-Butyldimethylsilyl
- TFA
- Trifluoressigsäure
- THF
- Tetrahydrofuran
- TMSE
- 2-(Trimethylsilyl)-ethyl
- TPTU
- 2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
- Z
- Benzyloxycarbonyl
LC-MS- und HPLC-Methoden:
[0088] Methode 1 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex
Synergi 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 11 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure,
Eluent B: 11 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5
min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5
min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
[0089] Methode 2 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex
Synergi 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure,
Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5
min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5
min. 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
[0090] Methode 3 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex
Synergi 2µ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure,
Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2.5
min 30%A → 3.0 min 5%A → 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5
min 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 208- 400 nm.
[0091] Methode 4 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Merck Chromolith
SpeedROD RP-18e 50 mm x 4.6 mm; Eluent A: Wasser + 500 µl 50%ige Ameisensäure / 1;
Eluent B: Acetonitril + 500 µl 50%ige Ameisensäure / 1; Gradient: 0.0 min 10%B → 3.0
min 95%B → 4.0 min 95%B; Ofen: 35°C; Fluss: 0.0 min 1.0 ml/min → 3.0 min 3.0 ml/min
→ 4.0 min 3.0 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 5 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule:
[0092] Thermo HyPURITY Aquastar 3µ 50 mm x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige
Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0
min 100%A → 0.2 min 100%A → 2.9 min 30%A → 3.1 min 10%A → 5.5 min 10%A; Ofen: 50°C;
Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
[0093] Methode 6 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil
GOLD-3µ 20 x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1
1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A → 0.2 min 100%A
→ 2.9 min 30%A → 3.1 min 10%A → 5.5 min 10%A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion:
210 nm.
Ausgangsverbindungen
Beispiel 1A
Benzyl-{(1S)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[({2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}amino)-carbonyl]butyl}carbamat
[0094]
[0095] Unter Argon werden 300 mg (0.82 mmol)
N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-
N5-(
tert-butoxycarbonyl)-
L-omithin und 171 mg (1.06 mmol)
tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0°C (Eisbad) werden
dann 204 mg (1.06 mmol) EDC und 33 mg (0.25 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam
auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und
der Rückstand wird mit Essigsäureethylester aufgenommen. Die organische Phase wird
nacheinander mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- und Natriumchlorid-Lösung gewaschen,
über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Feststoff
wird im Hochvakuum getrocknet.
[0096] Ausbeute: 392 mg (94% d. Th.)
[0097] LC-MS (Methode 1): R
t = 2.36 min.
[0098] MS (ESI): m/z = 509 (M+H)
+
Beispiel 2A
N5-(tert-Butoxycarbonyl)-N-{2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}-L-ornithinamid
[0099]
[0100] Eine Lösung von 390 mg (0.77 mmol) Benzyl-{(1
S)-4-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]-1-[({2-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}amino)carbonyl]butyl}carbamat (Beispiel 1A) in 50 ml Ethanol
wird nach Zugabe von 40 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 4 h bei RT und Normaldruck
hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen.
Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung
umgesetzt.
[0101] Ausbeute: 263 mg (91% d. Th.)
[0102] MS (ESI): m/z = 375 (M+H)
+; 397 (M+Na)
+.
Beispiel 3A
1-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-prolyl-N5-(tert-butoxycarbonyl)-N-{2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-ethyl}-L-ornithinamid
[0103]
[0104] Unter Argon werden 48 mg (0.194 mmol) 1-[(Benzyloxy)carbonyl]-
L-prolin und 94 mg (0.25 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A in 6 ml Dimethylformamid
gelöst. Bei 0°C (Eisbad) werden dann 48 mg (0.25 mmol) EDC und 7.8 mg (0.058 mmol)
HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung
wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan aufgenommen und mit gesättigter
NatriumhydrogencarbonatLösung, 0.1 N Salzsäure und Wasser gewaschen. Die vereinigten
organischen Phasen werden im Vakuum eingeengt und der so erhaltene Feststoff ohne
Reinigung weiter umgesetzt.
[0105] Ausbeute: 117 mg (95% d. Th.)
[0106] LC-MS (Methode 3): R
t = 2.36 min.
[0107] MS (ESI): m/z = 606 (M+H)
+
Beispiel 4A
L-Prolyl-N5-(tert-butoxycarbonyl)-N-{2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}-L-ornithinamid
[0108]
[0109] 117 mg (0.193 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden in 50 ml Ethanol gelöst
und mit 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt. Man hydriert 12 h bei Normaldruck,
filtriert über Kieselgur und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der so erhaltene Feststoff
wird ohne Reinigung weiter umgesetzt.
[0110] Ausbeute: 86 mg (94% d. Th.)
[0111] MS (ESI): m/z = 472 (M+H)
+
Beispiel 5A
tert-Butyl-{(5S)-5-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-6-hydroxyhexyl}carbamat
[0112]
[0113] Eine Lösung von 475 mg (0.90 mmol)
N2,
N6-Bis(
tert-butoxycarbonyl)-
L-lysin -
N-Cyclohexylcyclohexanamin (1:1) in 10 ml Tetrahydrofuran wird bei -10°C mit 91 mg
(0.90 mmol) 4-Methylmorpholin und 98 mg (0.90 mmol) Chlorameisensäureethylester versetzt
und 30 min gerührt. Bei dieser Temperatur werden 1.81 ml (1.81 mmol) einer 1M Lösung
von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran langsam zugetropft. Es wird langsam
auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Unter Eiskühlung gibt man vorsichtig 0.1
ml Wasser und 0.15 ml 4.5%ige Natriumhydroxid-Lösung hinzu und rührt weitere 3 h bei
RT. Der Ansatz wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand
wird in Essigsäureethylester gelöst, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet
und erneut im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung
umgesetzt.
[0114] Ausbeute: 250 mg (83% d. Th.)
[0115] MS (ESI): m/z = 333 (M+H)
+.
Beispiel 6A
(2S)-2,6-Bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexyl-methansulfonat
[0116]
[0117] Eine Lösung von 250 mg (0.75 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 20 ml Dichlormethan
wird mit 103 mg (0.90 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 0.21 ml (1.5 mmol) Triethylamin
versetzt und für 16 h bei RT gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und zweimal
mit 0.1N Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet
und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0118] Ausbeute: 264 mg (86% d. Th.)
[0119] MS (DCI): m/z = 428 (M+NH
4)
+.
Beispiel 7A
tert-Butyl-{(5S)-6-azido-5-[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexyl}carbamat
[0120]
[0121] Eine Lösung von 264 mg (0.64 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 15 ml Dimethylformamid
wird mit 42 mg (0.64 mmol) Natriumazid versetzt und 12 h bei 70°C gerührt. Ein Großteil
des Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird mit Essigsäureethylester
verdünnt. Es wird mehrmals mit gesättigter NatriumhydrogencarbonatLösung gewaschen,
über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird
ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0123] MS (ESI): m/z = 358 (M+H)
+.
Beispiel 8A
tert-Butyl-{(5S)-6-amino-5-[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexyl}carbamat
[0124]
[0125] Eine Lösung von 229 mg (0.64 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A in 10 ml Ethanol
wird nach Zugabe von 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 12 h bei RT und Normaldruck
hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen.
Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung
umgesetzt.
[0126] Ausbeute: 161 mg (76% d. Th.)
[0127] MS (ESI): m/z = 332 (M+H)
+.
Beispiel 9A
Benzyl-(2S,4R)-2-[({(2S)-2,6-bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexyl}amino)carbonyl]-4-hydroxypyrrolidin-1-carboxylat
[0128]
[0129] Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 3A aus 57 mg (0.216 mmol) (4
R)-1-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-hydroxy-
L-prolin und 93 mg (0.28 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 6 ml Dimethylformamid
unter Zusatz von 54 mg (0.28 mmol) EDC und 8.7 mg (0.065 mmol) HOBt. Das Produkt wird
mittels präparativer RP-HPLC gereinigt (Laufmittel Wasser / Acetonitril Gradient:
90:10 → 5:95).
[0130] Ausbeute: 42 mg (34% d. Th.)
[0131] LC-MS (Methode 1): R
t = 2.08 min.
[0132] MS (ESI): m/z = 579 (M+H)
+
Beispiel 10A
(4R)-N-{(2S)-2,6-Bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexyl}-4-hydroxy-L-prolinamid
[0133]
[0134] Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 4A aus 41 mg (0.071 mmol) der Verbindung
aus Beispiel 9A in 20 ml Ethanol unter Zusatz von 7.5 mg Palladium auf Aktivkohle
(10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0136] MS (ESI): m/z = 445 (M+H)
+
Beispiel 11A
2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat
[0137]
[0138] Zu einer Lösung von 16 g (82.0 mmol) Benzyl-(2-hydroxyethyl)carbamat und 16.60 g
(64.02 mmol) Triethylamin in 1 1 Dichlormethan werden 11.3 g (98.4 mmol) Methansulfonsäurechlorid
hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei RT gerührt. Man gibt Wasser
hinzu, und die organische Phase wird nacheinander mit Wasser und Natriumchlorid-Lösung
gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende
Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC
aufgereinigt.
[0139] Ausbeute 7 g (31% d. Th.)
[0140] LC-MS (Methode 3): R
t = 1.84 min.
[0141] MS (ESI): m/z = 273 (M+H)
+.
Beispiel 12A
Benzyl-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat
[0142]
[0143] Zu einer Lösung von 226 mg (3.66 mmol) 2-Aminoethanol in 25 ml Acetonitril werden
500 mg (1.83 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat (Beispiel 11A)
und 758 mg (5.48 mmol) Kaliumcarbonat hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über
Nacht bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand
in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC
aufgereinigt.
[0144] Ausbeute 131 mg (29% d. Th.)
[0145] LC-MS (Methode 3): R
t = 0.78 min.
[0146] MS (ESI): m/z = 239 (M+H)
+.
Beispiel 13A
Benzyl-[2-({2-[(tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino]ethyl}amino)ethyl]carbamat
[0147]
[0148] Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 300 mg (1.098 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat
(Beispiel 11A), 386 mg (2.19 mmol)
tert-Butyl-(2-aminoethyl)methylcarbamat und 455 mg (3.30 mmol) Kaliumcarbonat in 10 ml
Acetonitril.
[0149] Ausbeute: 360 mg (82% d. Th.)
[0150] LC-MS (Methode 4): R
t = 1.51 min.
[0151] MS (ESI): m/z = 352 (M+H)
+.
Beispiel 14A
Benzyl [2-({3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-2-hydroxypropyl}amino)ethyl]carbamat
[0152]
[0153] Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 270 mg (0.98 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat
(Beispiel 11A), 379 mg (1.98 mmol)
tert-Butyl-(3-amino-2-hydroxypropyl)carbamat und 409 mg (2.96 mmol) Kaliumcarbonat in
10 ml Acetonitril.
[0154] Ausbeute: 209 mg (45% d. Th.)
[0155] LC-MS (Methode 2): R
t = 1.44 min.
[0156] MS (ESI): m/z = 368 (M+H)
+.
Beispiel 15A
1-tert-Butyl 5-(methoxycarbonyl) N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat
[0157]
[0158] Unter Argon werden 5 g (16.15 mmol) (4
S)-5-
tert-Butoxy-4-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]-5-pentansäure und 2.45 ml (17.60 mmol) Triethylamin in 80 ml
THF gelöst und auf 0°G abgekühlt. Dazu gibt man 1.68 g (17.77 mmol) Methylchloroformiat
und lässt 3 Stunden bei 0°C nachrühren. Die Reaktionsmischung wird über Kieselgur
filtriert. Das Filtrat wird direkt umgesetzt.
Beispiel 16A
tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-5-hydroxy-L-norvalinat
[0159]
[0160] Das Filtrat von (1-
tert-Butyl-5-(methoxycarbonyl)-
N-(
tert-butoxycarbonyl)-
L-glutamat (Beispiel 15A) wird zu einer Suspension von 1.52 g (40.38 mmol) Natriumborhydrid
in 4.5 ml Wasser bei 0°C tropfenweise hinzugegeben. Die Mischung erwärmt sich langsam
auf RT und wird über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum eingeengt und
der Rückstand wird zur Aufarbeitung mit Essigsäureethylester und Wasser versetzt.
Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0161] Ausbeute: 4.5 g (48% d.Th.)
[0162] LC-MS (Methode 2): R
t = 2.04 min.
[0163] MS (ESI): m/z= 290 (M+H)
+
Beispiel 17A
tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-5-[(methylsulfonyl)oxy]-L-norvalinat
[0164]
[0165] Zu einer Mischung von 4.5 g (7.79 mmol)
tert-Butyl-
N-(
tert-butoxycarbonyl)-5-hydroxy-
L-norvalinat (Beispiel 16A) und 2.17 ml (5.58 mmol) Triethylamin in 200 ml Dichlormethan
werden 1.07 g (9.35 mmol) Methansulfonsäurechlorid hinzugegeben. Die Mischung wird
bei RT über Nacht gerührt und dann mit Wasser versetzt. Die organische Phase wird
nacheinander mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.
[0167] LC-MS (Methode 1): R
t = 2.16 min.
[0168] MS (ESI): m/z = 368 (M+H)
+.
Beispiel 18A
tert-Butyl-N2-(tert-butoxycarbonyl)-N5-{2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}-L-ornithinat
[0169]
[0170] Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 2 g (5.443 mmol)
tert-Butyl-
N-(
tert-butoxycarbonyl)-5-[(methylsulfonyl)oxy]-
L-norvalinat (Beispiel 17A), 1.78 g (10.89 mmol)
tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat und 2.26 g (16.33mmol) Kaliumcarbonat in 100 ml Acetonitril.
Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0171] Ausbeute: 4.2 g (53% d. Th.)
[0172] LC-MS (Methode 3): R
t = 1.61 min.
[0173] MS (ESI): m/z = 432 (M+H)
+.
Beispiel 19A
tert-Butyl 2-{[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)amino]methyl}piperidin-1-carboxylat
[0174]
[0175] Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 1 g (3.66 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]-amino}ethyl-methansulfonat
(Beispiel 11A), 1.56 g (7.31 mmol)
tert-Butyl-2-(aminomethyl)-piperidin-1-carboxylat und 1.52 g (10.98 mmol) Kaliumcarbonat
in 70 ml Acetonitril.
[0176] Ausbeute: 680 mg (45% d. Th.)
[0177] LC-MS (Methode 1): R
t = 1.47 min.
[0178] MS (ESI): m/z = 392 (M+H)
+.
Beispiel 20A
Benzyl-{2-[{(2S)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]pentanoyl}(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat
[0179]
[0180] Zu einer Lösung von 169 mg (0.462 mmol)
N5-(Benzyloxy)carbonyl]-
N2-(
tert-butoxycarbonyl)-
L-omithin in 10 ml wasserfreiem DMF werden 193 mg (0.51 mmol) HATU und 0.247 ml (1.39
mmol)
N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min Rühren bei RT werden 116 mg (0.46
mmol) Benzyl-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat (Beispiel 12A) hinzugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft
und der Rückstand in Essigsäureethylester und Wasser versetzt Die organische Phase
wird nacheinander mit 1N Salzsäure und gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung
gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch
präparative HPLC aufgereinigt.
[0181] Ausbeute 188 mg (70% d. Th.)
[0182] LC-MS (Methode 1): R
t = 2.17 min.
[0183] MS (ESI): m/z = 587 (M+H)
+.
Beispiel 21A
Benzyl-{(4S)-4-amino-5-[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)(2-hydroxyethyl)amino]-5-oxopentyl}carbamat
Hydrochlorid
[0184]
[0185] Zu einer Lösung von 176 mg (0.30 mmol) Benzyl-{2-[{(2
S)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]pentanoyl}(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat (Beispiel 20A)
in 1 ml Dioxan werden 2 ml einer 4 M Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben.
Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan
coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung
umgesetzt.
[0186] Ausbeute: 160 mg (85% d. Th.)
[0187] LC-MS (Methode 1): R
t = 1.53 min.
[0188] MS (ESI): m/z = 487 (M-HCl+H)
+.
Beispiel 22A
tert-Butyl-3-[(3S)-3-(3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}propyl)-5-(2-hydroxyethyl)-4,9-dioxo-11-phenyl-10-oxa-2,5,8-triazaundecan-1-oyl]piperidin-1-carboxylat
[0189]
[0190] Unter Argon werden 47 mg (0.206 mmol) 1-(
tert-Butoxycarbonyl)piperidin-3-carbonsäure, 130 mg (0.206 mmol) Benzyl-{(4
S)-4-amino-5-[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)(2-hydroxyethyl)-amino]-5-oxopentyl}carbamat
Hydrochlorid (Beispiel 21A) und 0.08 ml Triethylamin (0.56 mmol) in 10 ml Dimethylformamid
gelöst. Bei 0°C (Eisbad) werden dann 67 mg (0.350 mmol) EDC und 9 mg (0.068 mmol)
HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung
wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird mit Dichlormethan aufgenommen. Die
organische Phase wird nacheinander mit Wasser, 1 N Salzsäure und gesättigter wässriger
Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das
Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0192] LC-MS (Methode 1): R
t = 2.26 min.
[0193] MS (ESI): m/z = 698 (M+H)
+.
Beispiel 23A
Benzyl-{(4S)-5-[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)(2-hydroxyethyl)amino]-5-oxo-4-[(piperidin-3-ylcarbonyl)amino]pentyl}carbamat
Hydrochlorid
[0194]
[0195] Zu einer Lösung von 180 mg (0.196 mmol)
tert-Butyl-3-[(3
S)-3-(3-{[(benzyloxy)carbonyl]-amino}propyl)-5-(2-hydroxyethyl)-4,9-dioxo-11-phenyl-10-oxa-2,5,8-triazaundecan-1-oyl]-piperidin-1-carboxylat
(Beispiel 22A) in 1 ml Dioxan werden 2 ml einer 4 M Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung
hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, mehrmals
mit Dichlormethan coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet Das Rohprodukt wird durch
präparative HPLC aufgereinigt.
[0196] Ausbeute: 18 mg (14% d. Th.)
[0197] LC-MS (Methode 2): R
t = 1.84 min.
[0198] MS (ESI): m/z = 598 (M-HCl+H)
+.
Beispiel 36A
Benzyl-{2-[{[(8S,11S,14S)-14-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}(2-hydroxyethyl) amino]ethyl}carbamat
[0201]
[0202] Zu einer Lösung von 30 mg (0.046 mmol) (8
S,11
S,14
S)-14-[(
tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1
2,6]-henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 83A aus
WO03/106480) in 2 ml wasserfreiem DMF werden 19.2 mg (0.050 mmol) HATU und 0.010 ml (0.137 mmol)
N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min Rühren bei RT werden 12.7 mg (0.046
mmol) Benzyl-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat (Beispiel 12A) hinzugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft
und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser
gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch
präparative HPLC aufgereinigt.
[0203] Ausbeute: 8 mg (20% d. Th.)
[0204] LC-MS (Methode 2): R
t = 2.29 min.
[0205] MS (ESI): m/z = 877 (M+H)
+.
Beispiel 46A
1-{[(8S,11S,14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-prolyl-N5-(tert-butoxycarbonyl)-N-{2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}-L-omithinamid
[0207]
[0208] Zu einer Lösung von 30 mg (0.046 mmol) (8
S,11
S,14
S)-14-[(
tert-Butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1
2,6]-henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 83A aus
WO03/106480) in 10 ml wasserfreiem DMF werden bei 0°C 26 mg (0.050 mmol) PyBOP und 0.020 ml (0.14
mmol)
N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min bei 0°C werden 23.7 mg (0.05 mmol)
L-Prolyl-
N5-(
tert-butoxycarbonyl)-
N-{2-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]ethyl}-
L-ornithinamid (Beispiel 4A) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt.
Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand mit Wasser ausgerührt, abfiltriert
und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird chromatographisch an Sephadex-LH20 (Laufmittel:
Methanol / Essigsäure (0.25%)) gereinigt.
[0209] Ausbeute: 34 mg (66% d. Th.)
[0210] LC-MS (Methode 2): R
t = 2.49 min.
[0211] MS (ESI): m/z = 1110 (M+H)
+.
Beispiel 51A
tert-Butyl-[2-((2-aminoethyl){[(8S,11S,14S)-14-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}amino)ethyl]methylcarbamat Hydroacetat
[0213]
[0214] Es werden 11 mg (0.01 mmol) Benzyl [2-({[(8
S,11
S,14
S)-14-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]- 11-{3-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1
2,6]-henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl} {2-[(
tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino]-ethyl}amino)ethyl]carbamat (Beispiel 37A) in 4 ml Essigsäure/Wasser
(4:1) gelöst. Dazu gibt man 5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) und hydriert anschließend
15 h bei Normaldruck. Das Reaktionsgemisch wird über vorgewaschenem Kieselgur filtriert
und das Filtrat im Vakuum einrotiert. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
[0216] LC-MS (Methode 1): R
t = 1.80 min.
[0217] MS (ESI): m/z = 856 (M-HOAc+H)
+.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
1-{[(8S,11S,14S)-14-Amino-11-(3-aminopropyl)-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-prolyl-N-(2-arninoethyl)-L-omithinamid Tetrahydrochlorid
[0219]
[0220] Zu einer Lösung von 26.9 mg (0.024 mmol) der Verbindung aus Beispiel 46A in 1 ml
Dioxan werden bei 0°C 0.363 ml einer 4N Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben.
Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan
coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
[0221] Ausbeute: 20 mg (96% d. Th.)
[0222] LC-MS (Methode 5): R
t = 1.82 min.
[0223] MS (ESI): m/z = 710 (M-4HCl+H)
+.
[0224] 1H-NMR (400 MHz, D
2O): δ = 1.26 (m
c, 1H), 1.55-2.1 (m, 10H), 2.27 (m
c, 1H), 2.75 (m
c, 1H), 2.9-3.2 (m, 7H), 3.3-3.8 (m, 6H), 4.25 (m
c, 1H), 4.44 (m
c, 2H), 4.7-4.9 (m, 2H, unter D
2O), 6.85-7.0 (m, 3H), 7.27 (s, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.4 (d, 1H).
Beispiel 2
1-{[(8S,11S,14S)-14-Amino-11-(3-aminopropyl)-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricydo[14.3.1.12.6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-L-prolyl-N-(2-aminoethyl)-L-ornithinamid Tetra(hydrotrifluoracetat)
[0225] Beispiel 1 als Tetrahydrochlorid-Salz wird durch präparative HPLC (Reprosil ODS-A,
Laufmittel Acetonitril / 0.2% wässrige Trifluoressigsäure 5:95 → 95:5) in das Tetra(hydrotrifluoracetat)
überführt.
Beispiel 3
(8S,11S,14S)-14-Amino-N-(2-aminoethyl)-11-(3-aminopropyl)-5,17-dihydroxy-N-[2-(methylamino)ethyl]-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12.6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carboxamid Tetrahydrochlorid
[0226]
[0227] Eine Mischung von 9 mg (0.011 mmol)
tert-Butyl-[2-((2-aminoethyl){[(8
S,11
S,14
S)-14-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]-11-{3-[(
tert-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,11-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1
2,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}amino)ethyl]-methylcarbamat (Beispiel
51A) und 1.5 ml einer 4 M Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung wird 20 min bei RT gerührt.
Die Reaktionslösung wird eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert und im
Hochvakuum getrocknet.
[0229] LC-MS (Methode 1): R
t = 0.27 min.
[0230] MS (ESI): m/z = 555 (M-4HCl+H)
+.
[0231] 1H-NMR (400 MHz, D
2O): δ = 1.60-1.90 (m, 5H), 2.73 (d, 3H), 2.86-3.11(m, 4H), 3.23-3.38 (m, 4H), 3.50-3.95
(m, 8H), 5.09 (m, 2H), 6.96 (d, 2H), 7.01 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.46
(d, 1H).
Beispiel 4
1-{[(8S,11S,14S)-14-Amino-11-(3-aminopropyl)-5,17-dihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbonyl}-N-(2-aminoethyl)-L-prolinamid Trishydrochlorid
[0232]
[0233] Zu einer Lösung von 26.9 mg (0.024 mmol) der Verbindung aus Beispiel 47A in 1 ml
Dioxan werden bei 0°C 0.363 ml einer 4N Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben.
Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan
coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
[0234] Ausbeute: 20 mg (96% d. Th.)
[0235] LC-MS (Methode 5): R
t = 1.82 min.
[0236] MS (ESI): m/z = 710 (M-3HCl+H)
+.
[0237] 1H-NMR (400 MHz, D
2O): δ = 1.26 (m
c, 1H), 1.5-2.1 (m, 8H), 2.26 (m
c, 1H), 2.76 (m
c, 1H), 2.9-3.2 (m, 7H), 3.3-3.6 (m, 2H), 4.37 (m
c, 1H), 4.45 (m
c, 1H), 4.7-4.9 (m, 2H, unter D
2O), 6.85-7.0 (m, 3H), 7.27 (s, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.4 (d, 1H).
Beispiel 5
(8S,11S,14S)-14-Amino-N-{2-[(2-aminoethyl)amino]-2-oxoethyl}-11-(3-aminopropyl)-5,17-dihydroxy-N-methyl-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12,6]henicosa-1 (20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carboxamid Trishydrochlorid
[0238]
[0239] Zu einer Lösung von 19.9 mg (0.023 mmol) der Verbindung aus Beispiel 43A in 1 ml
Dioxan werden bei 0°C 0.343 ml einer 4N Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben.
Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan
coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet.
[0240] Ausbeute: 13.6 mg (88% d. Th.)
[0241] LC-MS (Methode 5): R
t =1.9 min.
[0242] MS (ESI): m/z = 570 (M-3HCl+H)
+.
[0243] Analog zur Vorschrift des Beispiels 1 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten
Beispiele 5 bis 14 hergestellt, entsprechend der jeweiligen Isolierungsmethode als
Hydrochlorid- oder Hydro(trifluoracetat)-Salz.
Beispiel- Nr. |
Vorstufe Beispiel |
Struktur |
Analytische Daten |
6 |
54A |
|
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.71 min.
MS (ESI): m/z = 543 (M-3TFA+H)+.
1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.40-2.0 (m, 5H), 2.80-3.90 (m, 12H), 5.18 (d, 1H), 6.93-6.96 (m, 2H), 7.01
(s,1H), 7.29 (s, 1H), 7.34-7.45 (m, 2H). |
7 |
53A |
|
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.84 min.
MS (ESI): m/z = 559 (M-3HCl+H)+. |
8 |
52A |
|
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.28 min.
MS (ESI): m/z = 572 (M-4HCl+H)+.
1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.20-1.40 (m, 1H), 1.60-2.0 (m, 5H), 2.70-4.30 (m, 21H), 6.98-7.10 (m, 3H),
7.30-7.57 (m, 3H). |
9 |
55A |
|
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.04 min.
MS (ESI): m/z = 596 (M-4TFA+H)+.
1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.30-2.0 (m, 9H), 2.70-4.00 (m, 14H), 4.40 (m, 1H), 5.0 (ddc, 1H), 6.80-6.71 (m, 3H), 7.00-7.20 (m, 3H). |
10 |
56A |
|
LC-MS (Methode 6): Rt = 2.06 min.
MS (ESI): m/z = 768 (M-4TFA+H)+. |
11 |
39A |
|
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.85 min.
MS (ESI): m/z = 614 (M-4TFA+H)+. |
12 |
48A |
|
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.91 min.
MS (ESI): m/z = 683 (M-4TFA+H)+. |
13 |
49A |
|
LC-MS (Methode 5): Rt = 1.89 min.
MS (ESI): m/z = 726 (M-4HCl+H)+. |
14 |
44A |
|
MS (ESI): m/z = 599 (M-4TFA+H)+.
1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.55-1.9 (m, 4H), 2.76 (mc, 1H), 2.9-3.35 (m, 10H), 3.4-3.6 (m, 2H), 3.86 (mc, 1H), 4.11 (mc, 1H), 4.34 (mc, 1H), 4.43 (mc, 1H), 4.7-4.9 (m, 1H, unter D2O), 5.14 (mc, 1H), 6.85-7.0 (m, 3H), 7.2-7.45 (m, 3H). |
15 |
45A |
|
MS (ESI): m/z = 684 (M- 4TFA+H)+. |
B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Verwendete Abkürzungen:
[0244]
- AMP
- Adenosinmonophosphat
- ATP
- Adenosintriphosphat
- BHI Medium
- Brain heart infusion medium
- CoA
- Coenzym A
- DMSO
- Dimethylsulfoxid
- DTT
- Dithiothreitol
- EDTA
- Ethylendiamintetraessigsäure
- KCl
- Kaliumchlorid
- KH2PO4
- Kaliumdihydrogenphosphat
- MgSO4
- Magnesiumsulfat
- MHK
- Minimale Hemmkonzentration
- MTP
- Mikrotiterplatte
- NaCl
- Natriumchlorid
- Na2HPO4
- Dinatriumhydrogenphosphat
- NH4Cl
- Ammoniumchlorid
- NTP
- Nukleotidtriphosphat
- PBS
- Phosphat Buffered Saline
- PCR
- Polymerase Chain Reaction
- PEG
- Polyethylenglykol
- PEP
- Phosphoenolpyruvat
- Tris
- Tris[hydroxymethyl]aminomethan
[0245] Die
in vitro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
In vitro Transkription-Translation mit E. coli Extrakten
[0247] Dem Reaktionsmix des
in vitro Transkriptions-Translations-Tests werden zusätzlich 1 µl cAMP (11.25 mg/ml) je 50
µl Reaktionsmix zugegeben. Der Testansatz beträgt 105 µl, wobei 5 µl der zu testenden
Substanz in 5%igem DMSO vorgelegt werden. Als Transkriptionsmatrize werden 1 µg/100µl
Ansatz des Plasmides pBESTLuc (Promega, Deutschland) verwendet. Nach Inkubation für
60 min bei 30°C werden 50 µl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO
4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 µM CoA, 470 µM Luziferin, 530 µM ATP) zugegeben
und die entstehende Biolumineszenz für 1 Minute in einem Luminometer gemessen. Als
IC
50 wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition
der Translation von Firefly Luziferase führt.
In vitro Transkription-Translation mit S. aureus Extrakten
Konstruktion eines S. aureus Luziferase Reporterplasmids
[0248] Zur Konstruktion eines Reporterplasmids, welches in einem
in vitro Transkriptions-Translations-Assay aus S.
aureus verwendet werden kann, wird das Plasmid pBESTluc (Promega Corporation, USA) verwendet.
Der in diesem Plasmid vor der Firefly Luziferase vorhandene
E. coli tac Promoter wird gegen den
capA1 Promoter mit entsprechender Shine-Dalgarno Sequence aus S.
aureus ausgetauscht. Dazu werden die Primer CAPFor 5'-CGGCC-AAGCTTACTCGGATCCAGAGTTTGCAAAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAAAC
AAGAAAGGAAAATAGGAGGTTTATATGGAAGACGCCA-3' und CAPRev 5'-GTCATCGTCGGGAAGACCTG-3' verwendet.
Der Primer CAPFor enthält den
capA1 Promotor, die Ribosomenbindestelle und die 5'-Region des Luziferase Gens. Nach PCR
unter Verwendung von pBESTluc als Template kann ein PCR-Produkt isoliert werden, welches
das Firefly Luziferase Gen mit dem fusionierten
capA1 Promotor enthält. Dieses wird nach einer Restriktion mit ClaI und HindIII in den
ebenfalls mit ClaI und HindIII verdauten Vektor pBESTluc ligiert. Das entstandene
Plasmid pla kann in
E. coli repliziert werden und als Template im
S.
aureus in vitro Transkriptions-Translations-Test verwendet werden.
Herstellung von S30 Extrakten aus S. aureus
[0249] Sechs Liter BHI Medium werden mit einer 250 ml Übernachtkultur eines S. aureus Stammes
inokuliert und bei 37°C bis zu einer OD600nm von 2-4 wachsen gelassen. Die Zellen
werden durch Zentrifugation geerntet und in 500 ml kaltem Puffer A (10 mM Tris-acetat,
pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 M KCl) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren
werden die Zellen in 250 ml kaltem Puffer A mit 50 mM KCl gewaschen und die erhaltenen
Pellets bei -20°C für 60 min eingefroren. Die Pellets werden in 30 bis 60 min auf
Eis aufgetaut und bis zu einem Gesamtvolumen von 99 ml in Puffer B (10 mM Tris-acetat,
pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 50 mM KCl) aufgenommen. Je 1.5 ml Lysostaphin
(0.8 mg/ml) in Puffer B werden in 3 vorgekühlte Zentrifugenbecher vorgelegt und mit
je 33 ml der Zellsuspension vermischt. Die Proben werden für 45 bis 60 min bei 37°C
unter gelegentlichem Schütteln inkubiert, bevor 150 µl einer 0.5 M DTT Lösung zugesetzt
werden. Die lysierten Zellen werden bei 30.000 x g 30 min bei 4°C abzentrifugiert.
Das Zellpellet wird nach Aufnahme in Puffer B unter den gleichen Bedingungen nochmals
zentrifugiert und die gesammelten Überstände werden vereinigt. Die Überstände werden
nochmals unter gleichen Bedingungen zentrifugiert und zu den oberen 2/3 des Überstandes
werden 0.25 Volumen Puffer C (670 mM Tris-acetat, pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 7
mM Na
3-Phosphoenolpyruvat, 7 mM DTT, 5.5 mM ATP, 70 µM Aminosäuren (complete von Promega),
75 µg Pyruvatkinase (Sigma, Deutschland))/ml gegeben. Die Proben werden für 30 min
bei 37°C inkubiert. Die Überstände werden über Nacht bei 4°C gegen 2 1 Dialysepuffer
(10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 60 mM Kaliumacetat) mit
einem Pufferwechsel in einem Dialyseschlauch mit 3500 Da Ausschluss dialysiert. Das
Dialysat wird auf eine Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml konzentriert, indem
der Dialyseschlauch mit kaltem PEG 8000 Pulver (Sigma, Deutschland) bei 4°C bedeckt
wird. Die S30 Extrakte können aliquotiert bei -70°C gelagert werden.
Bestimmung der IC50 im S. aureus in vitro Transcriptions-Translations-Assay
[0250] Die Inhibition der Proteinbiosynthese der Verbindungen kann in einem
in vitro Transkriptions-Translations-Assay gezeigt werden. Der Assay beruht auf der zellfreien
Transkription und Translation von Firefly Luziferase unter Verwendung des Reporterplasmids
pla als Template und aus
S.
aureus gewonnenen zellfreien S30 Extrakten. Die Aktivität der entstandenen Luziferase kann
durch Lumineszenzmessung nachgewiesen werden.
[0251] Die Menge an einzusetzenden S30 Extrakt bzw. Plasmid pla muss für jede Präparation
erneut ausgetestet werden, um eine optimale Konzentration im Test zu gewährleisten.
3 µl der zu testenden Substanz gelöst in 5% DMSO werden in eine MTP vorgelegt. Anschließend
werden 10 µl einer geeignet konzentrierten Plasmidlösung pla zugegeben. Anschließend
werden 46 µl eines Gemisches aus 23 µl Premix (500 mM Kaliumacetat, 87.5 mM Tris-acetat,
pH 8.0, 67.5 mM Ammoniumacetat, 5 mM DTT, 50 µg Folsäure/ml, 87.5 mg PEG 8000/ml,
5 mM ATP, 1.25 mM je NTP, 20 µM je Aminosäure, 50 mM PEP (Na
3-Salz), 2.5 mM cAMP, 250 µg je
E.
coli tRNA/ml) und 23 µl einer geeigneten Menge S.
aureus S30 Extrakt zugegeben und vermischt. Nach Inkubation für 60 min bei 30°C werden 50
µl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO
4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 µM CoA, 470 µM Luziferin, 530 µM ATP) und die
entstehende Biolumineszenz für 1 min in einem Luminometer gemessen. Als IC
50 wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition
der Translation von Firefly Luziferase führt.
Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)
[0252] Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums,
mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoffkonzentration
kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren bestimmt werden (siehe z.B. The
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial
susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition.
NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238-394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400,
Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die MHK der erfindungsgemäßen Verbindungen
wird im Flüssigdilutionstest im 96er-Mikrotiter-Platten-Maßstab bestimmt. Die Bakterienkeime
werden in einem Minimalmedium (18.5 mM Na
2HPO
4, 5.7 mM KH
2PO
4, 9.3 mM NH
4Cl, 2.8 mM MgSO
4, 17.1 mM NaCl, 0.033 µg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 µg/ml Nicotinsäure, 0.003 µg/ml
Biotin, 1% Glucose, 25 µg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure mit Ausnahme von Phenylalanin;
[H.-P. Kroll; unveröffentlicht]) unter Zusatz von 0.4% BH-Bouillon kultiviert (Testmedium).
Im Fall von
Enterococcus faecium L4001 wird dem Testmedium hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS; GibcoBRL,
Deutschland) in einer Endkonzentration von 10% zugesetzt. Übernachtkulturen der Testkeime
werden auf eine OD
578 von 0.001 (im Falle der Enterokokken auf 0.01) in frisches Testmedium verdünnt und
1:1 mit Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2) in Testmedium inkubiert
(200 µl Endvolumen). Die Kulturen werden bei 37°C für 18-24 Stunden inkubiert; Enterokokken
in Gegenwart von 5% CO
2.
[0253] Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum
mehr auftritt, wird als MHK definiert.
Alternative Bestimmungsmethode der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)
[0254] Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums,
mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoffkonzentration
kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren mit modifiziertem Medium im Rahmen
eines Agardilutionstests bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical
Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for
bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition. NCCLS document M7-A5
[ISBN 1-56238-394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania
19087-1898 USA, 2000). Die Bakterienkeime werden auf 1.5%igen Agarplatten kultiviert,
die 20% defibriniertes Pferdeblut enthalten. Die Testkeime, die über Nacht auf Columbia-Blutagarplatten
(Becton-Dickinson) inkubiert werden, werden in PBS verdünnt, auf eine Keimzahl von
ca. 5x10
5 Keime/ml eingestellt und auf Testplatten getropft (1-3 µl). Die Testsubstanzen enthalten
unterschiedliche Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2). Die Kulturen
werden bei 37°C für 18-24 Stunden in Gegenwart von 5% CO
2 inkubiert.
[0255] Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum
mehr auftritt, wird als MHK definiert und in µg/ml angegeben.
Tabelle A (mit Vergleichsbeispiel Biphenomycin B)
Bsp.-Nr. |
MHK |
MHK |
MHK |
IC50 |
|
S. aureus 133 |
S. aureus T17 |
E. faecium L4001 |
S. aureus 133 Translation |
1 |
1.0 |
4.0 |
2.0 |
0.7 |
3 |
2.0 |
4.0 |
8.0 |
0.8 |
6 |
2.0 |
4.0 |
4.0 |
0.7 |
8 |
1.0 |
4.0 |
16.0 |
0.25 |
9 |
4.0 |
2.0 |
32 |
0.33 |
Biphenomycin B |
<0.03 |
>32 |
0.5 |
1.5 |
Konzentrationsangaben: MHK in µg/ml; IC50 in µM. |
Systemische Infektion mit S. aureus 133
[0256] Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen
kann in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. Dazu werden die Tiere im allgemeinen
mit einem geeigneten virulenten Keim infiziert und anschließend mit der zu testenden
Verbindung, die in einer an das jeweilige Therapiemodell angepassten Formulierung
vorliegt, behandelt. Speziell kann die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in einem Sepsismodell an Mäusen nach Infektion
mit S.
aureus demonstriert werden.
[0257] Dazu werden
S. aureus 133 Zellen über Nacht in BH-Bouillon (Oxoid, Deutschland) angezüchtet. Die Übernachtkultur
wurde 1:100 in frische BH-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden hochgedreht. Die in
der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterien werden abzentrifugiert und
zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird am
Photometer (Dr. Lange LP 2W) eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion
von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension
1:1 mit einer 10%-igen Mucinsuspension gemischt. Von dieser Infektionslösung wird
0.2 ml/20 g Maus i.p. appliziert. Dies entspricht einer Zellzahl von etwa 1-2 x 10
6 Keimen/Maus. Die i.v.-Therapie erfolgt 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch
werden weibliche CFW1-Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert.
Das Tiermodell ist so eingestellt, daß unbehandelte Tiere innerhalb von 24 h nach
der Infektion versterben. Für die Beispielverbindung 2 konnte in diesem Modell eine
therapeutische Wirkung von ED
100 = 1.25 mg/kg demonstriert werden.
Bestimmung der Spontanresistenzfrequenzen gegen S. aureus
[0258] Die Spontanresistenzraten der erfindungsgemäßen Verbindungen werden wie folgt bestimmt:
die Bakterienkeime werden in 30 ml eines Minimalmediums (18.5 mM Na
2HPO
4, 5.7 mM KH
2PO
4, 9.3 mM NH
4Cl, 2.8 mM MgSO
4, 17.1 mM NaCl, 0.033 µg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 µg/ml Nicotinsäure, 0.003 µg/ml
Biotin, 1% Glucose, 25 µg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure unter Zusatz von 0,4%
BH Bouillon) bei 37°C über Nacht kultiviert, 10 min bei 6.000xg abzentrifugiert und
in 2 ml phosphat-gepufferter physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert (ca. 2x10
9 Keime/ml). 100 µl dieser Zellsuspension bzw. 1:10 und 1:100 Verdünnungen werden auf
vorgetrockneten Agarplatten (1.5% Agar, 20% defibriniertes Pferdeblut bzw. 1.5% Agar,
20% Rinderserum in 1/10 Müller-Hinton-Medium verdünnt mit PBS), welche die zu testende
erfindungsgemäße Verbindung in einer Konzentration entsprechend 5xMHK bzw. 10xMHK
enthalten, ausplattiert und 48 h bei 37°C bebrütet. Die entstehenden Kolonien (cfu)
werden ausgezählt.
Isolierung der Biphenomycin-resistenten S. aureus Stämme RN4220BiR und T17
[0259] Der
S. aureus Stamm RN4220Bi
R wird
in vitro isoliert. Dazu werden jeweils 100 µl einer S.
aureus RN4220 Zellsuspension (ca. 1.2x10
8 cfu/ml) auf einer antibiotikafreien Agarplatte (18.5 mM Na
2HPO
4, 5.7 mM KH
2PO
4, 9.3 mM NH
4Cl, 2.8 mM MgSO
4, 17.1 mM NaCl, 0.033 µg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 µg/ml Nicotinsäure, 0.003 µg/ml
Biotin, 1% Glucose, 25 µg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure unter Zusatz von 0.4%
BH-Bouillon und 1 % Agarose) und einer Agarplatte, die 2 µg/ml Biphenomycin B (10xMHK)
enthält, ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Während auf der antibiotikafreien
Platte ca. 1x10
7 Zellen wachsen, wachsen auf der antibiotikahaltigen Platte ca. 100 Kolonien, entsprechend
einer Resistenzfrequenz von 1x10
-5. Einige der auf der antibiotikahaltigen Platte gewachsenen Kolonien werden auf MHK
gegen Biphenomycin B getestet. Eine Kolonie mit einer MHK > 50 µM wird zur weiteren
Verwendung ausgewählt und der Stamm mit RN4220Bi
R bezeichnet.
[0260] Der S.
aureus Stamm T17 wird
in vivo isoliert. CFW1-Mäuse werden mit 4x10
7 S.
aureus 133 - Zellen pro Maus intraperitoneal infiziert. 0.5 Std. nach der Infektion werden
die Tiere mit 50 mg/kg Biphenomycin B intravenös behandelt. Den überlebenden Tieren
werden am Tag 3 nach der Infektion die Nieren entnommen. Nach dem Homogenisieren der
Organe werden die Homogenate, wie bei RN4220Bi
R beschrieben, auf antibiotikafreien und antibiotikahaltigen Agarplatten, ausplattiert
und über Nacht bei 37°C bebrütet. Etwa die Hälfte der aus der Niere isolierten Kolonien
zeigen ein Wachstum auf den antibiotikahaltigen Platten (2.2x10
6 Kolonien), was die Anreicherung von Biphenomycin B resistenten S.
aureus Zellen in der Niere der behandelten Tiere belegt. Ca. 20 dieser Kolonien werden auf
MHK gegen Biphenomycin B getestet und eine Kolonie mit einer MHK > 50 µM wird zur
Weiterkultivierung ausgewählt und der Stamm mit T17 bezeichnet.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
[0261] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen
überführt werden:
Intravenös applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
[0262] 1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für
Injektionszwecke.
Herstellung:
[0263] Die erfindungsgemäße Verbindung wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser
unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 µm) und
unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese
werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.