[0001] La présente invention concerne un système microfluidique et un procédé pour le tri
d'amas de cellules, tels que des îlots de Langerhans, et pour l'encapsulation en continu
et de manière automatisée des amas une fois triés dans des capsules de tailles adaptées
à celles de ces amas triés. L'invention s'applique en particulier au couplage entre
tri et encapsulation de tels amas de cellules, mais également d'une manière plus générale
de cellules, de bactéries, d'organelles ou de liposomes, notamment.
[0002] L'encapsulation cellulaire est une technique qui consiste à immobiliser des cellules
ou des amas de cellules dans des microcapsules, de façon à les protéger des attaques
du système immunitaire lors d'une transplantation. La porosité des capsules doit permettre
l'entrée des molécules de faible poids moléculaire essentielles au métabolisme des
cellules encapsulées, telles que des molécules de nutriments, d'oxygène, etc., tout
en empêchant l'entrée de substances de poids moléculaire plus élevé comme les anticorps
ou les cellules du système immunitaire. Cette perméabilité sélective des capsules
est ainsi conçue pour assurer l'absence de contact direct entre les cellules encapsulées
du donneur et celles du système immunitaire du receveur de la transplantation, ce
qui permet de limiter les doses de traitement immunosuppresseur utilisées lors de
la transplantation (ce traitement présentant des effets secondaires lourds).
[0003] Parmi les multiples applications de l'encapsulation, on peut citer celle des îlots
de Langerhans, amas de cellules fragiles situés dans le pancréas et constitués de
plusieurs types cellulaires dont les cellules β qui régulent la glycémie dans le corps
par production de l'insuline. L'encapsulation de ces îlots est une alternative aux
thérapies cellulaires classiques (e.g. transplantation de pancréas ou d'îlots) utilisées
pour soigner le diabète insulinodépendant, maladie auto-immune dans laquelle le système
immunitaire détruit ses propres cellules β productrices d'insuline.
[0004] Les capsules produites doivent répondre à certains critères, dont la biocompatibilité,
la résistance mécanique et la perméabilité sélective, en particulier. Un autre critère
essentiel est la taille des capsules, car en l'ajustant au mieux à la taille des amas
de cellules (voir référence [1]):
- on diminue la quantité de polymère « inutile » autour des cellules et donc le temps
de réponse de ces dernières. Par exemple, la régulation de la glycémie par des îlots
de Langerhans encapsulés dans des capsules de taille adaptée sera plus rapide, car
le glucose diffusera plus rapidement vers l'îlot et l'insuline produite s'en échappera
plus rapidement ;
- on maximise la viabilité des îlots encapsulés du fait que la diffusion de l'oxygène
y est plus rapide, ce qui améliore l'oxygénation des cellules et réduit les risques
d'apparition de zones nécrosées ; et
- on diminue le volume de capsules à transplanter, ce qui peut permettre l'implantation
des capsules dans des zones plus propices à la revascularisation des tissus. En effet,
cette revascularisation est essentielle pour éviter les nécroses des cellules encapsulées,
car les cellules doivent être situées à proximité du réseau sanguin pour être bien
approvisionnées en nutriments et en oxygène, notamment. Par exemple, pour le traitement
du diabète insulinodépendant, ce volume réduit permet d'implanter les îlots encapsulés
dans le foie ou la rate, régions plus favorables à la revascularisation que la cavité
péritonéale où les capsules sont classiquement implantées pour des questions d'encombrement
stérique.
[0005] Si les propriétés de biocompatibilité, de résistance mécanique ou de perméabilité
sélective semblent bien acquises d'après la littérature, il n'en est pas de même pour
la taille des capsules qui est particulièrement problématique pour l'encapsulation
des îlots de Langerhans. En effet, dans tous les documents connus de la Demanderesse
à ce jour, la taille des capsules formées autour de ces îlots est fixe et en moyenne
de l'ordre de 600 à 800 µm, alors que ces îlots ont une taille variant de 20 à 400
µm seulement. Une taille de capsules fixe et identique quelle que soit la taille de
l'îlot pose donc problème, d'autant plus que des études récentes ont montré que les
îlots les plus performants sont les plus petits (voir référence [2]).
[0006] Les principales méthodes d'encapsulation connues utilisent au choix :
- un jet d'air ou de liquide coaxial, les capsules produites ayant une taille variant
entre 400 µm et 800 µm (cependant la taille moyenne des capsules produites est plus
proche de 600-800 µm que de 400 µm) ;
- une différence de potentiel, qui est la technique d'encapsulation la plus utilisée
lorsque la priorité est de diminuer la taille des capsules (la taille des capsules
varie dans ce cas entre 200 et 800 µm) ; ou
- une technique de vibration, qui présente l'inconvénient d'être parfois limitée par
les viscosités des solutions utilisées.
[0007] Les principaux inconvénients de ces techniques sont :
- les tailles des capsules qui ne sont pas forcément adaptées à celles des îlots de
Langerhans à encapsuler ;
- l'absence d'automatisation de la procédure d'encapsulation, où les capsules sont gélifiées
en tombant dans un bain de polycations et sont ensuite récupérées manuellement, ce
qui génère une hétérogénéité du temps de polymérisation d'une capsule à une autre
;
- la dispersion en taille des capsules, qui augmente lorsque la taille des gouttes diminue
; et
- un manque de reproductibilité des capsules produites, qui ne sont pas forcément sphériques.
[0008] On a développé récemment des systèmes microfluidiques adaptés au tri par taille de
bactéries, de cellules, d'organelles, de virus, d'acides nucléiques ou même de protéines,
parmi lesquels on peut citer :
- ceux réalisant un tri par « Deterministic Lateral Displacement » ou « DLD » (i.e.
déplacement latéral déterministe, voir références [6-8] et par exemple les documents
WO-A-2004/037374, US-A-2007/0059781 et US-A-2007/0026381), qui repose sur l'utilisation d'un réseau périodique d'obstacles qui vont perturber
ou non la trajectoire des particules à trier. Les particules plus petites qu'une taille
critique Dc, fixée par la géométrie du dispositif, ne sont globalement pas déviées
par ces obstacles, tels que des plots, tandis que celles plus grandes que cette taille
Dc sont déviées dans la même direction à chaque rangée de plots. La trajectoire des
plus grosses particules est donc finalement déviée par rapport à celle des plus petites,
ce qui permet la séparation en taille des particules, étant précisé que dans la technique
« DLD » l'espacement entre deux plots adjacents est toujours supérieur à la taille
des particules à dévier. Ce dispositif est adapté aux échantillons sanguins (séparation
des globules rouges, blancs et du plasma) ;
- les systèmes réalisant un tri par filtration hydrodynamique (voir références [9, 10]
et les documents JP-A-2007 021465, JP-A-2006 263693, et JP-A-2004 154747), qui consiste à adapter les résistances fluidiques de canaux transverses en choisissant
un rapport de débits approprié entre le canal principal et ces canaux transverses.
De ce fait, les particules dont la taille est supérieure à une taille critique (fixée
par la valeur de la résistance fluidique) ne peuvent pénétrer dans ces canaux transverses,
même si leur taille est inférieure à la largeur des canaux transverses ;
- des systèmes de tri par taille plus simples n'utilisant que la déviation des lignes
d'écoulement (voir références [11, 12] et par exemple le document WO-A-2006/102258) où, dans la zone de tri, les lignes d'écoulement sont déviées vers une zone de basse
pression: la différence de positionnement des lignes d'écoulement est accentuée, et
comme les particules suivent les lignes d'écoulement sur lesquelles leur centre d'inertie
est positionné, la différence de position entre petites et grosses particules est
accentuée ;
- les systèmes de tri utilisant des filtres qui permettent soit de laisser passer des
molécules de taille inférieure à une valeur critique (voir le document US-A-2005/0133480), soit de ne laisser passer que le fluide pour concentrer les particules ou séparer
le fluide qui les véhicule (voir dans ce cas le document WO-A-2006/079007). La principale limitation de ces systèmes de tri par filtres est le risque de colmatage
des canaux par les particules ; et
- les systèmes de tri où la microfluidique est couplée à un champ extérieur, comme par
exemple les mesures optiques de fluorescence ou d'absorbance (voir les documents WO-A-2002/023163 et WO-A-02/40874), les pièges optiques, la diélectrophorèse, les mesures de conductimétrie, de potentiométrie,
d'ampérométrie, les détections de liaisons ligand/récepteur, etc.
[0009] Un inconvénient majeur de tous les systèmes microfluidiques de tri présentés dans
ces documents est qu'ils ne sont pas du tout adaptés au tri d'amas de cellules, tels
que des îlots de Langerhans ou d'autres amas peu cohésifs de tailles similaires. En
effet et comme expliqué précédemment, chacun de ces amas se comporte bien différemment
d'une cellule du fait de sa taille (de 20 µm à 400 µm pour des îlots de Langerhans
contre une dizaine de µm pour une cellule unique) et également du fait de sa faible
cohésion (qui impose des cisaillements faibles dans le système microfluidique de tri
utilisé).
[0010] Le seul système connu de la Demanderesse pour réaliser le tri de tels amas de cellules,
est le cytomètre en flux de dénomination « COPAS » qui est commercialisé par la société
Union Biometrica. Ce système, qui n'est pas de type microfluidique, réalise le tri
par taille des amas en mesurant leurs temps de vols respectifs dans le faisceau d'un
rayonnement laser (voir référence [13]).
[0011] On a également développé dans un passé récent des systèmes microfluidiques d'encapsulation
qui utilisent des émulsions pouvant être notamment formées :
- au niveau d'une jonction en T (voir référence [14]),
- au niveau de l'orifice d'un dispositif microfluidique focalisant l'écoulement « MFFD
» (i.e. « Microfluidic Flow Focusing Device », voir référence [15]),
- au travers de microcanaux structurés (cf. référence [16]), ou
- au travers de buses (voir référence [17]).
[0013] L'étape de gélification est effectuée directement sur le microsystème avec des microcanaux
en serpentin ou en « H », comme décrit dans les documents
US-A-2006/0051329 et
WO-A-2005/103106.
[0014] Le principal inconvénient de ces systèmes microfluidiques d'encapsulation est le
même que celui précité en introduction, qui est l'obtention d'une seule taille de
capsules quelle que soit la taille des amas de cellules. A la connaissance de la Demanderesse,
seul le dispositif de Wyman et al. (voir référence [18] et le document
US-A-2007/0009668) permet d'adapter la taille de la capsule à la taille des amas de cellules, tels
que des îlots de Langerhans, en les enveloppant dans des capsules d'épaisseur constante
voisine de 20 µm, mais indépendamment de la taille des îlots encapsulés. Dans ce dernier
document, une phase aqueuse est placée au dessus d'une phase d'huile et, par ajustement
des densités respectives de ces deux phases, les îlots se retrouvent à l'interface
eau/huile. Un tube de prélèvement placé dans l'huile à une certaine distance de l'interface
permet d'aspirer la phase aqueuse et les îlots en un fin jet, lequel, sous l'effet
de la tension de surface, se rompt en laissant à la surface des îlots une fine enveloppe
d'hydrogel d'épaisseur fixe qui est polymérisée par irradiation aux UV. Ce dispositif
est cependant un dispositif macroscopique, et pas un système microfluidique.
[0015] Un but de la présente invention est de proposer un système microfluidique remédiant
à l'ensemble des inconvénients précités, qui comporte un substrat dans lequel est
gravé un réseau de microcanaux, qui comprend une unité de tri de cellules et autour
duquel est scellé un capot de protection.
[0016] A cet effet, un système microfluidique selon l'invention est tel que l'unité de tri
comporte des moyens de déviation aptes à séparer lors de leur écoulement, de préférence
selon leur taille, des amas de cellules peu cohésifs de taille variant de 20 µm à
500 µm et de 20 à 10 000 cellules chacun environ, tels que des îlots de Langerhans,
au moins deux microcanaux de tri agencés en parallèle en sortie de ladite unité étant
respectivement conçus pour véhiculer autant de catégories d'amas triés vers une unité
d'encapsulation de ces derniers également formée dans ledit réseau.
[0017] Par « taille » des amas de cellules ou des capsules les enrobant, on entend dans
la présente description le diamètre, dans le cas d'un amas ou d'une capsule sensiblement
sphérique, ou plus généralement la plus grande dimension transversale de cet amas
ou de cette capsule (e.g. le grand axe d'une section elliptique dans l'approximation
d'un ellipsoïde de révolution).
[0018] On notera que les microcanaux dédiés au tri du microsystème selon l'invention sont
aptes à séparer par déviation ces amas de cellules, tels que des îlots de Langerhans,
de par leur échelle qui est bien différente de celle des systèmes microfluidiques
connus seulement adaptés au tri de cellules uniques. En effet, la taille de ces îlots
varie de manière connue de 20 à 400 µm contre 1 à 10 µm en moyenne pour une cellule,
et les îlots doivent être manipulés avec encore plus de précaution que des cellules
uniques à cause de leur fragilité et de leur faible cohésion, ce qui limite la gamme
de cisaillements applicable par l'unité de tri.
[0019] Avantageusement, ladite unité de tri peut comprendre au moins un étage de tri par
taille desdits amas qui est conçu pour générer dans lesdits microcanaux de tri respectivement
au moins deux catégories de tailles pour lesdits amas triés.
[0020] On notera que le(s) étage(s) de tri par taille formé(s) par un groupe déterminé de
microcanaux du système selon l'invention permet(tent) d'obtenir autant de catégories
de tailles que souhaité (en fonction du nombre de microcanaux de tri prévus en parallèle),
et en particulier d'adapter la taille des capsules formées suite à ce tri à la taille
de chaque catégorie d'amas triés de cellules.
[0021] On notera également qu'il est possible de coupler plusieurs étages successifs de
tri par taille (i.e. des étages agencés les uns à la suite des autres) pour optimiser
la performance finale de l'unité de tri.
[0022] Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits moyens de déviation dudit ou
de chaque étage de tri sont hydrodynamiques à fluidique passive, étant de préférence
de type à focalisation hydrodynamique, de type à déplacement latéral déterministe
(« DLD ») au moyen d'un arrangement de plots de déviation que comporte au moins un
microcanal de cet étage, ou bien de type à filtration hydrodynamique au moyen de microcanaux
de filtration agencés transversalement à un microcanal principal.
[0023] En variante, ces moyens de déviation selon l'invention du ou de chaque étage de tri
peuvent être de type hydrodynamiques couplés à des forces électrostatiques, magnétiques
ou à des ondes électromagnétiques ou acoustiques.
[0024] Selon une autre caractéristique de l'invention, une unité d'encapsulation, apte à
encapsuler de manière automatisée lesdits amas triés en fonction de leur catégorie,
est en outre formée dans ledit réseau en communication fluidique avec lesdits microcanaux
de tri, cette unité d'encapsulation étant apte à former en continu autour de chaque
amas trié une capsule monocouche ou multicouches biocompatible, mécaniquement résistante
et à perméabilité sélective.
[0025] Cette unité d'encapsulation peut comprendre une pluralité de sous-unités d'encapsulation
qui sont respectivement agencées en parallèle en communication avec lesdits microcanaux
de tri pour former, pour chaque catégorie de taille d'amas triés y circulant, une
capsule de taille prédéterminée conçue pour envelopper au plus près chaque amas de
cette catégorie.
[0026] Avantageusement, chaque sous-unité d'encapsulation peut comporter un dispositif de
formation desdites capsules choisi dans le groupe constitué par les dispositifs à
jonction en « T », les dispositifs microfluidiques de focalisation d'écoulement «
MFDD », les dispositifs à réseau de microcanaux structurés « MC array » et les dispositifs
à réseau de microbuses « MN array ».
[0027] En variante, chaque sous-unité d'encapsulation peut comporter un échangeur de matière
entre une phase aqueuse comprenant lesdits amas triés au sein de chaque catégorie
et une phase non miscible avec cette phase aqueuse, par exemple huileuse, cet échangeur
étant conçu pour former les capsules par rupture de l'interface entre ces deux phases
due à une surpression.
[0028] Selon une autre caractéristique de l'invention, ladite unité d'encapsulation peut
comprendre en outre des moyens de gélification des capsules formées, comprenant un
échangeur de matière constitué de microcanaux et dédié au transfert de ces capsules
d'une phase d'encapsulation les contenant, par exemple de type huile-alginate, vers
une phase de gélification aqueuse ou non.
[0029] On notera que le microsystème selon l'invention permet ainsi d'automatiser entièrement
la procédure d'encapsulation des amas de cellules, en ce sens que l'opérateur n'a
plus qu'à remplir les différents réservoirs correspondant aux matériaux nécessaires
à l'encapsulation et récupère en sortie les capsules adaptées à la taille des amas
préalablement triés.
[0030] Le microsystème réalise donc de manière continue et automatisée les étapes de tri,
de formation des capsules et de gélification, et il peut être adapté aussi bien à
une simple encapsulation qu'à une encapsulation multicouches. Dans ce dernier cas,
le module d'encapsulation est complexifié par intégration d'étapes de rinçage des
capsules et de mise en contact avec d'autres solutions de polymères ou de polycations.
[0031] De préférence, est en outre formé dans ledit réseau de microcanaux un module microfluidique
de transfert conçu pour transférer lesdits amas triés d'un milieu de culture les contenant
vers une phase d'encapsulation destinée à les contenir dans ladite unité d'encapsulation,
ce module de transfert étant en communication fluidique avec chacun desdits microcanaux
de tri et étant conçu pour minimiser les pertes de charge dans ladite unité de tri.
[0032] En effet, les îlots destinés à la transplantation sont conservés dans un milieu de
culture, mais pour l'encapsulation, ils doivent être transférés dans une solution
de polymère (fluide le plus souvent non newtonien, de viscosité élevée même à faible
cisaillement). Pour automatiser au maximum la procédure d'encapsulation, ledit module
de transfert est intégré au microsystème, entre l'unité de tri et celle d'encapsulation
de façon à limiter les pertes de charges dans cette unité de tri, compte tenu du fait
que la résistance fluidique est proportionnelle à la viscosité de la solution déplacée.
[0033] Ce module de transfert présente en outre l'avantage de diminuer la pression totale
dans le microsystème, et donc de limiter les risques de fuites lorsque les pressions
appliquées sont trop élevées.
[0034] Selon une autre caractéristique importante de l'invention, ledit système microfluidique
comprend en outre avantageusement un module de couplage de ladite unité de tri à ladite
unité d'encapsulation, qui est conçu pour maintenir un régime fluidique laminaire
dans ces deux unités en faisant communiquer directement ou bien sélectivement l'unité
d'encapsulation avec l'unité de tri.
[0035] On notera qu'aucun microsystème connu n'a ainsi couplé l'étape de tri à celle d'encapsulation.
Or, ce couplage n'est pas aisé à mettre en oeuvre, car la fluidique de l'unité de
tri peut venir perturber celle de l'unité d'encapsulation. Il est donc nécessaire
de modéliser les pertes de charges (i.e. les résistances fluidiques) globales des
microcanaux concernés, pour conserver un régime fluidique laminaire dans ces deux
unités. Cette modélisation est d'autant plus compliquée que l'encapsulation utilise
le plus souvent des polymères non newtoniens (e.g. l'alginate) dont la viscosité dépend
du cisaillement appliqué au fluide, ce qui complexifie la modélisation du système
global.
[0036] Selon un exemple de réalisation de l'invention, ce module de couplage est constitué
de microcanaux intermédiaires qui relient respectivement lesdits microcanaux de tri
à ladite unité d'encapsulation et qui présentent des dimensions et une géométrie adaptées
pour le maintien dudit régime laminaire en amont et en aval.
[0037] L'inconvénient de ce module de couplage selon cet exemple de réalisation est que,
outre la conception dimensionnelle précise qui est requise pour ces microcanaux intermédiaires,
il peut y avoir formation d'un grand nombre de capsules vides dans chaque sous-unité
d'encapsulation, ce qui peut nécessiter en sortie de cette dernière un tri final entre
capsules vides et capsules contenant des amas triés.
[0038] Selon un autre exemple préférentiel de réalisation de l'invention, ce module de couplage
comprend des microréservoirs tampon de stockage des amas triés, dans chacun desquels
débouche l'un desdits microcanaux de tri et qui sont chacun reliés sélectivement à
l'unité d'encapsulation par un microcanal de sortie qui est destiné à véhiculer les
amas triés et concentrés et qui équipé d'une vanne fluidique par exemple de type à
bulle d'air ou à gel bloquant pouvant être dissous (de préférence à gel d'alginate,
dans le cas de l'utilisation d'alginate pour l'encapsulation), de sorte que l'ouverture
et la fermeture de la vanne abaisse et élève respectivement la concentration des amas
triés dans chaque microréservoir en fonction du nombre de capsules en cours de formation
dans l'unité d'encapsulation.
[0039] On notera que ce module de couplage préférentiel à vanne fluidique permet de minimiser
la formation de capsules vides par ce réglage de la concentration dans chaque microréservoir.
[0040] Avantageusement, chaque microréservoir tampon peut être en outre pourvu d'une pluralité
de fins microcanaux transverses de sortie qui sont conçus pour permettre l'évacuation
de la phase contenant lesdits amas à l'exception de ces derniers, lorsque ladite vanne
est fermée.
[0041] D'une manière générale, on notera que les systèmes microfluidiques selon l'invention
doivent être stérilisables, car les capsules formées par l'unité d'encapsulation doivent
pouvoir être transplantées chez un individu.
[0042] Un procédé selon l'invention pour le tri d'amas peu cohésifs de cellules de taille
variant de 20 µm à 500 µm et de 20 à 10 000 cellules environ, tels que des îlots de
Langerhans, consiste à faire circuler ces amas dans un réseau de microcanaux d'un
système microfluidique de géométrie adaptée à la taille et au nombre de ces amas à
séparer, et à les dévier les uns des autres selon l'un de leurs paramètres, tel que
leur taille, de manière à les diriger vers au moins deux microcanaux de tri véhiculant
en parallèle autant de catégories d'amas triés, en vue de leur encapsulation dans
ce même système.
[0043] Avantageusement, l'on utilise au moins un étage de tri par taille desdits amas pour
générer dans lesdits microcanaux de tri respectivement au moins deux catégories de
tailles pour lesdits amas triés, chaque étage utilisant :
- une déviation hydrodynamique à fluidique passive, de préférence par focalisation hydrodynamique,
par déplacement latéral déterministe (« DLD ») ou par filtration hydrodynamique, ou
- une déviation hydrodynamique couplée à des forces électrostatiques, magnétiques ou
à des ondes électromagnétiques ou acoustiques.
[0044] Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on peut encapsuler en outre de
manière automatisée ces amas triés en parallèle en fonction de leur catégorie, en
formant en continu autour de chaque amas trié une capsule monocouche ou multicouches
biocompatible, mécaniquement résistante et à perméabilité sélective.
[0045] Avantageusement, l'on forme alors, pour chaque catégorie de taille d'amas triés,
une capsule de taille prédéterminée enveloppant au plus près chaque amas de cette
catégorie, de préférence avec une taille de capsule d'environ D
a+20 µm à D
a+150 µm, préférentiellement D
a+50 µm, pour une catégorie d'amas triés selon une taille critique inférieure à une
valeur D
a.
[0046] De préférence, on forme ces capsules pour chaque catégorie d'amas trié par un dispositif
choisi dans le groupe constitué par les dispositifs à jonction en « T », les dispositifs
microfluidiques de focalisation d'écoulement « MFDD », les dispositifs à réseau de
microcanaux structurés « MC array » et les dispositifs à réseau de microbuses « MN
array ».
[0047] En variante, on peut former ces capsules par échange de matière entre une phase aqueuse
comprenant les amas triés au sein de chaque catégorie et une phase non miscible avec
cette phase aqueuse, par exemple huileuse, la rupture de l'interface entre ces deux
phases par une surpression générant ces capsules.
[0048] Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on gélifie ensuite les capsules
formées, par un transfert de ces capsules et de la phase d'encapsulation les contenant,
par exemple de type huile-alginate, vers une phase de gélification aqueuse ou non.
[0049] Le polymère utilisé pour l'encapsulation peut être par exemple un hydrogel d'alginate,
polymère le plus couramment utilisé pour l'encapsulation. Toutefois, l'encapsulation
selon l'invention ne se limite pas à cet hydrogel et d'autres matières d'encapsulation
pourraient être choisie, comme le chitosan, les carraghénanes, les gels d'agarose,
les polyéthylènes glycols (PEG), à titre non limitatif, à condition d'adapter l'unité
d'encapsulation au type de gélification que requiert le polymère choisi.
[0050] De préférence, avant chaque encapsulation, l'on transfère les amas triés d'un milieu
de culture les contenant vers la phase d'encapsulation destinée à les contenir, pour
minimiser les pertes de charge lors du tri.
[0051] Egalement à titre préférentiel, le procédé selon l'invention comprend en outre un
couplage fluidique entre le tri et l'encapsulation ayant pour effet de maintenir un
régime fluidique laminaire dans les microcanaux correspondants, ce couplage faisant
communiquer directement ou bien sélectivement lesdits amas triés avec la phase d'encapsulation.
[0052] Comme indiqué précédemment, on peut réaliser ce couplage au moyen de microcanaux
intermédiaires de dimensions et de géométrie adaptées pour le maintien du régime laminaire
lors du tri et de l'encapsulation.
[0053] En variante, on réalise préférentiellement ce couplage en réglant la concentration
de chaque catégorie d'amas triés dans un microréservoir tampon de stockage des amas
communiquant avec l'un desdits microcanaux de tri et relié sélectivement par ladite
vanne fluidique à un microcanal de sortie véhiculant les amas triés et concentrés,
l'ouverture et la fermeture de cette vanne abaissant et élevant respectivement la
concentration des amas triés dans le microréservoir en fonction du nombre de capsules
en cours de formation, pour minimiser la formation de capsules vides. Ce microréservoir
est en outre avantageusement pourvu d'une pluralité de fins microcanaux transverses
de sortie conçus pour évacuer la seule phase contenant ces amas sans ces derniers,
lorsque la vanne est fermée.
[0054] Avantageusement, lesdits amas de cellules triés dans le procédé de l'invention sont
des îlots de Langerhans qui sont encapsulés avec une taille de capsules variant de
70 µm à 200 µm pour les îlots triés selon une taille inférieure à 50 µm, avec une
taille de capsules pouvant atteindre 650 µm pour les plus gros îlots triés selon une
taille de 500 µm par exemple.
[0055] Une utilisation selon l'invention d'un système microfluidique tel que présenté ci-dessus
consiste à trier soit des cellules, bactéries, organelles, liposomes, soit des amas
de cellules, de préférence selon des catégories d'intérêt via des molécules d'adhésion
dans le premier cas, ou bien selon des catégories de tailles dans le cas d'amas de
cellules, puis à les encapsuler en continu et de manière automatisée pour chaque catégorie
triée.
[0056] On notera en effet que l'invention n'est pas limitée au seul tri par taille puis
à l'encapsulation d'amas de cellules, mais qu'elle vise d'une manière générale tout
couplage d'une encapsulation à un tri préalable de cellules, de bactéries, d'organelles
ou de liposomes au sein d'une population hétéroclite de ces particules très différentes,
de façon à n'encapsuler que les cellules/bactéries/organelles/liposomes d'intérêt.
[0057] D'autres avantages, caractéristiques et détails de l'invention ressortiront du complément
de description qui va suivre en référence à des dessins annexés, donnés uniquement
à titre d'exemples et dans lesquels :
la figure 1 est une vue schématique en coupe transversale d'un système microfluidique
selon l'invention dans une première phase de son procédé de fabrication montrant l'oxydation
du substrat,
la figure 2 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
1 dans une seconde phase de son procédé de fabrication montrant l'étalement d'une
résine photosensible sur ce substrat oxydé,
la figure 3 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
2 dans une troisième phase de son procédé de fabrication montrant le résultat d'étapes
suivantes de photolithographie et de gravure sèche, permettant de créer les microcanaux,
la figure 4 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
3 dans une quatrième phase de son procédé de fabrication montrant le résultat d'étapes
de gravure profonde,
la figure 5 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
4 dans une cinquième phase de son procédé de fabrication montrant le résultat d'une
étape de délaquage de la résine et de désoxydation par gravure humide,
la figure 6 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
5 dans une sixième phase de son procédé de fabrication montrant le résultat d'une
étape de d'oxydation,
la figure 7 est une vue schématique en coupe transversale du système de la figure
6 dans une septième phase de son procédé de fabrication montrant le résultat d'une
étape de scellement d'un capot de protection afin de délimiter la section des microcanaux,
la figure 8 est une vue schématique partielle de dessus d'un système microfluidique
selon un exemple de réalisation de l'invention, montrant une unité de tri par filtration
hydrodynamique et une unité d'encapsulation par des jonctions en T qui lui est couplée,
la figure 9 est un cliché modélisant les lignes d'écoulement au sein d'un exemple
d'unité de tri selon l'invention par focalisation hydrodynamique,
la figure 10 est une vue schématique de dessus d'un microcanal d'une unité de tri
selon l'invention qui est équipé de moyens de déviation par déplacement latéral déterministe
(« DLD »),
la figure 11 est une vue de détail du médaillon de la figure 10 montrant de manière
symbolique un exemple de déviation de trajectoire obtenu par ces moyens de déviation,
la figure 12 est un cliché modélisant les lignes d'écoulement au sein d'un autre exemple
d'unité de tri selon l'invention par filtration hydrodynamique,
la figure 13 est un cliché représentant schématiquement un agencement de microcanaux
formant un module de transfert des îlots triés d'un milieu de culture vers une solution
d'alginate utilisée pour l'encapsulation,
la figure 14 est un diagramme à blocs illustrant quatre étages de tri respectivement
couplés à quatre sous-unités d'encapsulation dans un exemple de mise en oeuvre du
procédé de tri/ encapsulation selon l'invention,
les figures 15 et 16 sont respectivement deux clichés représentant schématiquement
une jonction en T et un dispositif focalisant de type « MFFD », chacun étant destiné
à la formation d'une émulsion dans chaque sous-unité d'encapsulation selon l'invention,
la figure 17 est une vue schématique d'un module de gélification inclus dans l'unité
d'encapsulation selon l'invention, pour transférer les capsules formées d'une phase
huileuse vers une phase aqueuse,
la figure 17a est une vue schématique en coupe verticale d'un module de gélification
selon une variante de la figure 17, qui peut être inclus dans l'unité d'encapsulation
selon l'invention,
la figure 17b est une vue schématique en coupe verticale d'un module de gélification
selon une variante de la figure 17a, qui peut être inclus dans l'unité d'encapsulation
selon l'invention,
la figure 17c est une vue schématique partielle en coupe verticale d'une variante
selon l'invention de l'élément séparateur prévu en sortie du module de gélification
des figures 17a ou 17b,
les figures 18 et 19 sont respectivement deux vues schématiques de modules de couplage
selon un premier et un second exemples de l'invention, qui sont chacun reliés à un
étage de tri et à une sous-unité correspondante d'encapsulation,
la figure 20 est une vue schématique d'une unité d'encapsulation par fluidique passive
selon un autre exemple de réalisation de l'invention, suite à un tri par taille effectué
de préférence par déplacement latéral déterministe (« DLD »), et
la figure 21 est une vue schématique d'une unité d'encapsulation selon l'invention
illustrant notamment les étapes de formation de capsules à trois couches par un dispositif
focalisant, et leur gélification.
[0058] Un système microfluidique 1 selon l'invention peut par exemple être réalisé comme
suit, en référence aux figures 1 à 7 qui rendent compte de diverses étapes se basant
sur des procédés connus de microélectronique sur silicium, i.e. notamment la lithographie,
la gravure profonde, l'oxydation, le « stripping » et le scellement d'un capot de
protection 2 sur le substrat 3. Cette technologie sur silicium présente l'avantage
d'être très précise (de l'ordre du micromètre) et non limitative tant dans les profondeurs
de gravure qu'au niveau des largeurs des motifs. Plus précisément, le protocole de
réalisation du microsystème 1 est le suivant :
[0059] Un dépôt d'oxyde de silicium 4 (figure 1) est effectué sur le substrat de silicium.
Puis une résine photosensible 5 est déposée par étalement en face avant (figure 2),
suite à quoi l'oxyde de silicium 4 est gravé à travers la couche de résine 5 par photolithographie
et gravure sèche de l'oxyde de silicium 4 en s'arrêtant sur le substrat 3 de silicium
(figure 3).
[0060] Ce substrat 3 est ensuite gravé à la profondeur souhaitée des microcanaux par une
gravure profonde 6 (figure 4), puis la résine est « délaquée » (figure 5). L'oxyde
de silicium 4 thermique restant est ensuite éliminé par désoxydation au moyen d'une
gravure humide (figure 5), puis une nouvelle couche d'oxyde thermique 7 est déposée
(figure 6).
[0061] Les puces obtenues sont ensuite découpées et un capot de protection 2 en verre -
ou en un autre matériau transparent pour permettre l'observation - est scellé, par
exemple par scellement anodique ou scellement direct (figure 7).
[0062] Avant montage des microcanaux ou capillaires (non illustrés), un traitement de surface
du type silanisation hydrophobe peut aussi être effectué.
[0063] Le protocole décrit ci-dessus est l'un des multiples protocoles de fabrication pouvant
être suivis. Par ailleurs, on pourrait utiliser pour le substrat 3 un matériau autre
que le silicium, par exemple un PDMS (polydiméthylsiloxane) ou bien un autre élastomère,
par moulage sur un « master » (i.e. matrice) préalablement préparé par photolithographie
par exemple. On notera que cette technique de fabrication est bien adaptée au cas
ou le système microfluidique comporte un module de couplage entre l'unité de tri et
celle d'encapsulation à vannes fluidiques, en référence aux figures 18 et 19.
[0064] Le système microfluidique 101 selon l'exemple de l'invention illustré à la figure
8 comporte, d'une part, une unité de tri par taille 110 d'amas A par filtration hydrodynamique
se terminant par quatre microcanaux transverses de tri 111 à 114, et une unité d'encapsulation
120 subdivisée en quatre sous-unités d'encapsulation 121 à 124 respectivement couplées
à ces microcanaux et véhiculant autant de catégories de tailles d'amas triés At.
[0065] Le principe de cette unité de tri 110 est illustré à la figure 12 et repose sur une
focalisation des amas A à la paroi. Plus précisément en relation avec cette figure
12, on adapte les résistances fluidiques des microcanaux transverses 111 à 113 en
choisissant un rapport de débits approprié entre le microcanal principal 115 et ces
microcanaux transverses. De ce fait, les amas A ne peuvent pénétrer que dans l'un
des microcanaux transverses 111 à 113, en fonction de leur taille et des résistances
fluidiques respectives de ces microcanaux transverses, qui sont ainsi finement calculées
pour déterminer la gamme de taille d'amas A pouvant pénétrer dans tel ou tel microcanal
111, 112, 113 ou 114.
[0066] La solution S permettant la focalisation des amas A à la paroi est injectée en un
microcanal secondaire 116 communiquant avec le microcanal principal 115 par des embranchements
117 à 119, et cette solution S peut être la même que celle contenant les amas A injectés
à l'entrée E de l'unité 110, étant par exemple un milieu de culture ou de l'alginate.
[0067] L'unité de tri 110 permet ainsi de trier des amas de cellules A, tels que des îlots
de Langerhans, selon les quatre catégories suivantes :
- îlots At plus petits que 100 µm,
- îlots At de 100 à 200 µm,
- îlots At de 200 à 300 µm, et
- îlots At dépassant les 300 µm.
[0068] En variante de la figure 12, il serait possible d'utiliser dans le système de la
figure 8 l'unité de tri 210 par focalisation hydrodynamique de la figure 9, dans laquelle
est visible l'entrée des amas A non triés, un dispositif de focalisation dynamique
211 utilisant un fluide focalisant S et, en sortie d'une zone de déviation 212, un
premier microcanal de tri 213 véhiculant des amas triés At
1 déviés du fait qu'ils sont les plus petits et un second microcanal de tri 214 véhiculant
les amas triés At
2 comme étant les plus gros suivant l'hypothèse que les amas de cellules suivent les
lignes d'écoulement sur lesquelles leurs centres d'inertie sont positionnés. Un microcanal
215 de sortie pour une partie du fluide focalisant (dépourvu d'amas) est en outre
agencé en sortie de cette zone 212.
[0069] Selon une autre variante de la figure 12, il serait également possible d'utiliser
dans le système de la figure 8 l'unité de tri 310 par « DLD » des figures 10 et 11,
utilisant un réseau de plots 311 qui est agencé de manière prédéterminée à l'intérieur
d'un microcanal 312 et dont les caractéristiques géométriques imposent une taille
critique Dc pour les amas de cellules. Les particules plus petites que Dc ne sont
pas déviées par le réseau de plots 312 et suivent globalement les lignes d'écoulement
du fluide, alors que les particules plus grosses que Dc sont déviées à chaque rangée
transversale de plots 312 et de ce fait séparées des plus petites. On notera que plusieurs
étages de tri peuvent être mis en cascade les uns à la suite des autres. Cette unité
de tri 310 utilise une solution tampon de focalisation F, qui est injectée en même
temps que la solution contenant les amas A à trier.
[0070] Comme visible à la figure 10, on récupère en sortie de cette unité 310, d'une part,
la solution tampon F sans amas et, d'autre part, trois catégories d'amas triés At
1, At
2 et At
3 qui correspondent respectivement dans cet exemple de réalisation à des îlots de Langerhans
plus petits que 200 µm, de 200 à 300 µm et plus gros que 300 µm. On a ainsi dans cet
exemple mis en cascade deux étages de tri de caractéristiques géométriques différentes,
permettant d'obtenir deux tailles critiques de tri Dc
1=200 µm et Dc
2=300 µm.
[0071] En revenant à la figure 8, les quatre microcanaux transverses de tri 111 à 114 véhiculant
les amas triés At débouchent respectivement sur les quatre sous-unités d'encapsulation
121 à 124, qui sont ici de type à jonction en T parcourues chacune par une huile H
pour former les capsules C, en référence à la figure 15 qui montre de manière connue
la formation d'une émulsion via le contact entre les deux phases d'huile et d'alginate
se rencontrant dans cette jonction. En variante, il serait possible de remplacer les
jonctions en T de la figure 8 par les dispositifs focalisants « MFFD » de la figure
16 faisant dans cet exemple converger deux phases huileuses et une phase d'alginate.
[0072] La figure 17 montre à titre d'exemple une structure possible d'un module de gélification
125 qui est utilisable dans chaque sous-unité d'encapsulation 121 à 124 de la figure
8, et qui est apte à transférer les capsules C à base d'alginate d'une phase huileuse
vers une phase aqueuse pour les gélifier. Ce module 125 par exemple globalement en
forme de « H » comprend :
- raccordés en amont d'une extrémité supérieure d'un pied vertical du H, un microcanal
d'entrée 126 destiné à véhiculer des ions Ca2+ en solution aqueuse et, à l'autre extrémité inférieure de ce même pied, un dispositif
d'encapsulation 127 de type « MFFD » à trois microcanaux convergents dont deux sont
destinés à véhiculer la phase huileuse et le troisième de l'alginate pour former dans
de l'huile les capsules C à base de Na-alginate, et
- raccordés en aval de l'extrémité supérieure de l'autre pied vertical du H, un microcanal
de sortie 128 destiné à contenir un mélange de la solution aqueuse contenant les ions
Ca2+ et ces capsules C transférées à base d'alginate et, à l'extrémité inférieure de cet
autre pied, un microcanal 129 contenant la phase huileuse.
[0073] Le module de gélification 135 illustré dans la variante de la figure 17a comporte
essentiellement :
- deux entrées 136 et 137 comprenant :
* un microcanal horizontal d'entrée 136 destiné à l'acheminement d'une phase huileuse
contenant les amas de cellules At encapsulés en amont, et
*un microcanal vertical d'entrée 137 communiquant avec le précédent et destiné à y
injecter transversalement une phase aqueuse contenant un agent, tel que du calcium,
apte à gélifier par polymérisation les capsules enrobant ces amas (à base d'un composé
hydrophile, tel que l'alginate) ; et
- deux sorties 138 et 139 qui sont séparées l'une de l'autre par un séparateur ou «
mur » 140 (réalisé par exemple en silicium, en verre ou en un élastomère tel qu'un
PDMS, à titre non limitatif) et qui comprennent de part et d'autre de ce mur 140 :
* une sortie supérieure 138 destinée à véhiculer la phase aqueuse contenant les amas
de cellules At encapsulés, par migration de ces amas de la phase huileuse vers la phase aqueuse
supérieure du fait du caractère hydrophile du matériau (e.g. l'alginate) constituant
les capsules, et
* une sortie inférieure 139 destinée à l'extraction de la phase huileuse.
[0074] Le module de gélification 145 illustré à la figure 17b se différencie uniquement
de celui de la figure 17a en ce qu'il est pourvu, dans la zone du microcanal horizontal
d'entrée 136 qui est le siège de la migration précitée par attraction hydrophile,
d'un agencement de piliers ou plots 146 modificateurs de trajectoire de type utilisé
dans les dispositifs « DLD » (i.e. avec un espacement entre deux piliers 146 adjacents
supérieur à la taille des amas A
t encapsulés) permettant d'amplifier, par l'effet du déplacement latéral déterministe
s'ajoutant à cette migration, le déplacement latéral des amas A
t encapsulés de la phase huileuse vers la phase aqueuse supérieure.
[0075] Comme illustré à la figure 17c qui présente une variante de réalisation du séparateur
140 du module de gélification 135, 145 selon les figures 17a ou 17b, on peut avantageusement
utiliser un séparateur 150 sous forme de « double mur » pour optimiser la séparation
des phases aqueuse et huileuse. Ce séparateur 150 se distingue uniquement du précédent
en ce qu'il est formé de deux parois ou cloisons superposées 151 et 152 séparées l'une
de l'autre par un canal interstitiel central 153, ce qui permet de récupérer en sortie
du module 135 ou 145 des phases huileuse et aqueuse qui sont chacune plus pures et
d'éliminer par ce canal interstitiel 153 l'interface centrale solution aqueuse/ huile.
Plus précisément, la largeur de ce canal 153 est prévue pour que ce dernier ne véhicule
pas les amas A
t encapsulés hors du module de gélification 135, 145. On notera que ce séparateur à
double cloison 150 permet notamment de réduire les traces de solution aqueuse dans
l'huile, autorisant ainsi une réutilisation de celle-ci.
[0076] En variante de ces figures 17, 17a, 17b et 17c, on peut par exemple utiliser, à titre
non limitatif, un module de gélification 225 tel que celui inclus dans l'unité d'encapsulation
220 à trois couches Alginate-Poly-L-Lysine-Alginate selon la figure 21, où la gélification
se fait directement dans du 1-undécanol et non pas en phase aqueuse.
[0077] Comme visible à cette figure 21, les capsules sont produites au niveau d'un dispositif
d'encapsulation 221 du type « MFFD », puis gélifiées dans le module 225 par introduction
d'un flux de 1-undécanol contenant du Cal
2. Elles sont ensuite transférées en phase aqueuse et rincées, au niveau d'un premier
module de rinçage 226 en forme de « H ».
[0078] Puis les capsules sont mises en contact avec une solution de polycations de PLL (Poly-L-Lysine)
dans un canal en forme de serpentin 227, qui permet d'ajuster le temps d'incubation
des capsules dans cette solution de PLL. Les capsules sont par la suite rincées dans
une solution de NaCl, pour éliminer le PLL non lié dans un second module de rinçage
228, et l'on élimine également ensuite la solution de NaCl de rinçage dans les microcanaux
229.
[0079] En dernière étape, les capsules sont recouvertes d'une couche externe d'alginate
dans un module d'accrochage 230, pour l'obtention en sortie de l'unité 220 des capsules
à trois couches Alginate-PLL-Alginate.
[0080] La figure 13 illustre une structure utilisable d'un module de transfert 20 d'amas
triés de cellules (e.g. des îlots de Langerhans) d'un milieu de culture vers une solution
d'alginate utilisée pour l'encapsulation, qui peut être avantageusement inclus dans
un système microfluidique selon l'invention. Les résistances fluidiques et les tailles
respectives des microcanaux formant ce module de transfert 20 sont ajustées de telle
sorte que ces amas triés soient forcés de s'écouler dans le microcanal principal et
de passer ainsi du milieu de culture vers la solution d'alginate (ou d'un autre polymère).
[0081] Les figures 18 et 19 illustrent deux exemples préférentiels de modules de couplage
30 et 40 qui peuvent être chacun couplés à l'un des étages de tri 111 à 114 de la
figure 8 et à chaque sous-unité correspondante d'encapsulation 121 à 124 de cette
même figure 8. Chaque module de couplage 30, 40 est conçu pour maintenir un régime
fluidique laminaire à la fois dans l'unité de tri 110 et dans l'unité d'encapsulation
120, en faisant communiquer sélectivement ces deux unités 110 et 120 entre elles.
[0082] En référence à ces deux figures 18 et 19, le module de couplage 30, 40 correspondant
comprend dans les deux cas un microréservoir tampon de stockage 31, 41 des amas triés,
où débouche un microcanal de tri 111 à 114 et qui est relié sélectivement par l'intermédiaire
d'une vanne fluidique 32, 42, à une sous-unité d'encapsulation 121 à 124 par un microcanal
de sortie 33, 50 destiné à véhiculer les amas triés et concentrés lorsque la vanne
32, 42 est ouverte. Chaque microréservoir 31, 41 est en outre pourvu d'une pluralité
de fins microcanaux transverses de sortie 34, 44 pour permettre l'évacuation de la
phase contenant les amas sans ces derniers (e.g. l'évacuation du milieu de culture
ou de la solution d'alginate), lorsque la vanne 32, 42 est fermée.
[0083] La fermeture de la vanne 32, 42 permet de stocker et surtout de concentrer les amas
de manière que leur concentration dans la solution d'encapsulation soit suffisante
pour limiter le nombre de capsules vides formées. Les microcanaux fins 34, 44 permettent
de faire en sorte que la fermeture de la vanne 32, 42 ne modifie pas les lignes d'écoulement
du fluide en amont dans l'étage de tri correspondant (la taille de ces microcanaux
34, 44 est telle que les amas ne peuvent pas y pénétrer et sont donc forcés de se
concentrer dans le microréservoir 31, 41).
[0084] Plus précisément en référence à la figure 18, on utilise dans cet exemple une vanne
32 de type « bulle d'air », dont l'ouverture et la fermeture sont contrôlées thermiquement
au moyen d'une résistance chauffante 32a incorporée à une puce, de la manière suivante.
Lorsque l'air est maintenu à température ambiante, la vanne 32 est ouverte. En augmentant
la température de l'air contenu dans une chambre d'activation 32b de la vanne, on
augmente la pression du gaz qui s'introduit dans le microcanal de sortie 33 et bloque
le passage du fluide.
[0085] Plus précisément en référence à la figure 19, on utilise dans cet exemple une vanne
42 de type à gel bloquant pouvant être dissous et de préférence à gel d'alginate.
La fermeture de la vanne 42 s'effectue par formation d'un gel d'alginate 42a par mise
en contact d'une solution d'alginate avec des ions Ca
2+. L'ouverture de la vanne 42 correspond à la dissolution du gel d'alginate 42a par
une solution d'EDTA ou de tout autre chélateur des ions Ca
2+ de type citrate de sodium ou EGTA. En contrôlant les pressions relatives des solutions
d'EDTA et de Ca
2+, on contrôle la quantité de chaque espèce de manière que si l'EDTA est en excès,
alors tous les ions Ca
2+ sont chélatés et le gel d'alginate 42a est dissous par l'EDTA, et qu'au contraire
les ions Ca
2+ libres permettent la formation du gel.
[0086] La position du gel 42a est déterminée par les pressions relatives des phases d'alginate,
de Ca
2+ et d'EDTA. Pour éviter que le microcanal 45 véhiculant l'alginate ne se bouche, on
peut introduire une faible quantité d'EDTA en même temps que cet alginate.
[0087] Une fois l'étape de concentration des amas terminée et le gel d'alginate 42a dissous,
la pression de circulation de l'EDTA (injecté dans deux microcanaux différents 46
et 47 opposés par rapport au microcanal de sortie 43) et la pression de circulation
des ions Ca
2+ (injectés dans un microcanal 48 adjacent à un microcanal 49 véhiculant le milieu
de culture) peuvent être quasiment nulles: seuls l'alginate et ce milieu de culture,
complètement inoffensifs pour la viabilité des amas, circulent alors dans la chambre
43. Cette dernière est en outre pourvue d'une sortie 50 pour l'acheminement des amas
triés et concentrés vers la sous-unité d'encapsulation 121 à 124 correspondante, et
d'une sortie 51 équipée de fins microcanaux de filtrage 51a pour l'évacuation des
seuls ions Ca
2+.
[0088] On notera que le principal avantage de ce type de vanne 42 est qu'il n'y a aucune
complication d'ordre technologique pour l'incorporer au microsystème selon l'invention.
[0089] La figure 20 illustre schématiquement une variante d'unité d'encapsulation 320 selon
l'invention, suite à un tri par taille effectué par déplacement latéral déterministe
(« DLD »). Les amas triés At de cellules sont encapsulés par fluidique passive, l'encapsulation
étant générée à la rupture de l'interface phase aqueuse - huile lorsqu'une surpression
locale apparaît.
[0090] Plus précisément, cette unité d'encapsulation 320 comporte :
- une première entrée 321 de phase aqueuse incluant les amas triés At en solution (e.g.
dans du sérum physiologique, dans un milieu de culture ou dans de l'alginate, à titre
non limitatif), cette entrée 321 définissant un microcanal horizontal 321a,
- une seconde entrée 322 d'une phase non miscible avec cette phase aqueuse (e.g. une
huile, de l'undécanol, du « FC »), cette entrée 322 étant prévue à l'opposé et en
contrebas de la première entrée 321,
- deux sorties opposées 323 et 324 pour la phase aqueuse introduite par la première
entrée 321, qui sont prévues en dessous de cette dernière mais au-dessus de la seconde
entrée 322 et qui sont reliées entre elles par deux microcanaux latéraux 323a et 324a
(horizontaux) communiquant avec un microcanal vertical 325 prolongeant à angle droit
le microcanal 321 a, et
- une sortie 326 pour l'évacuation de la phase non miscible ou huileuse contenant les
amas At de cellules encapsulés qui est prévue à l'opposé et à la même hauteur que
la seconde entrée 322 de cette phase non miscible, formant avec celle-ci un microcanal
inférieur 327 d'encapsulation qui communique avec le microcanal vertical 325 de sorte
à recevoir par gravité les amas provenant de la première entrée 321.
[0091] On notera que cette unité d'encapsulation 320, qui est formée en trois dimensions
(en ce sens que les entrées et sorties microfluidiques 321, 322, 323, 324 et 326 ne
sont pas situées dans un même plan), est apte à former les capsules C non seulement
par la surpression locale précitée résultant de l'obstruction des deux microcanaux
latéraux 323a et 324a, mais aussi par la force de sédimentation des amas de cellules
due à la gravité.
[0092] En conclusion et comme l'illustre à titre d'exemple la figure 14, le procédé de tri/
encapsulation de l'invention permet de coupler en continu et de manière automatisée
un nombre donné de sous-unités d'encapsulation 121-124 à autant d'étages de tri 111-114
d'une unité de tri 110 de préférence par taille, via un nombre correspondant de modules
de couplage 30, 40. On peut ainsi par exemple trier des îlots de Langerhans en quatre
catégories respectivement associées à des tailles de capsules en rapport :
- îlots de taille inférieure à 100 µm triés en 111 et encapsulés en 121 par des capsules
de 200 µm de diamètre ;
- îlots de taille comprise entre 100 et 200 µm triés en 112 et encapsulés en 122 par
des capsules de 300 µm de diamètre ;
- îlots de taille comprise entre 200 et 300 µm triés en 113 et encapsulés en 123 par
des capsules de 400 µm de diamètre ; et
- îlots de taille supérieure à 300 µm triés en 114 et encapsulés en 124 par des capsules
de 500 µm de diamètre.
[0093] De cette manière, on comprend que le procédé selon l'invention permet d'adapter au
plus près la taille des capsules formées, suite au tri des amas de cellules, à la
taille des diverses catégories d'amas triés. Il en résulte avantageusement :
- une minimisation de la quantité de polymère à former autour des amas et donc du temps
de réponse de ces derniers,
- une optimisation de la viabilité des amas encapsulés, notamment du fait que la diffusion
de l'oxygène y est plus rapide, ce qui réduit les risques d'apparition de zones nécrosées
lors des transplantations, et
- une minimisation du volume de capsules à transplanter, ce qui peut permettre l'implantation
des capsules dans des zones plus propices à la revascularisation des tissus.
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- 17. Sugiura, Size control of calcium alginate beads containing living cells using micronozzle
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- 18. Wyman, Immunoisolating pancreatic islets by encapsulation with selective withdrawal.
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1. Système microfluidique (1, 101) comportant un substrat (3) dans lequel est gravé un
réseau de microcanaux comprenant une unité de tri (110, 210, 310) de cellules et autour
duquel est scellé un capot de protection (2), caractérisé en ce que l'unité de tri comporte des moyens de déviation (211, 311) aptes à séparer lors de
leur écoulement des amas (A) de cellules peu cohésifs de taille variant de 20 µm à
500 µm et de 20 à 10 000 cellules chacun environ, tels que des îlots de Langerhans,
au moins deux microcanaux de tri (111 à 114) agencés en parallèle en sortie de ladite
unité étant respectivement conçus pour véhiculer autant de catégories d'amas triés
(At) vers une unité d'encapsulation (120, 220, 320) de ces derniers également formée
dans ledit réseau, ladite unité de tri (110, 210, 310) comprenant de préférence au
moins un étage de tri par taille desdits amas (A) qui est conçu pour générer dans
lesdits microcanaux de tri (111 à 114) respectivement au moins deux catégories de
tailles pour lesdits amas triés (At).
2. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens de déviation (211, 311) dudit ou de chaque étage de tri sont hydrodynamiques
à fluidique passive, étant de préférence de type à focalisation hydrodynamique, de
type à déplacement latéral déterministe (« DLD ») au moyen d'un arrangement de plots
(311) de déviation que comporte au moins un microcanal (312) de cet étage, ou bien
de type à filtration hydrodynamique au moyen de microcanaux de filtration (111 à 114)
agencés transversalement à un microcanal principal (115).
3. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens de déviation dudit ou de chaque étage de tri sont de type hydrodynamiques
couplés à des forces électrostatiques, magnétiques ou à des ondes électromagnétiques
ou acoustiques.
4. Système microfluidique (1, 101) selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une unité d'encapsulation (120, 220, 320), apte à encapsuler de manière automatisée
lesdits amas triés (At) en fonction de leur catégorie, est en outre formée dans ledit
réseau en communication fluidique avec lesdits microcanaux de tri (111 à 114), cette
unité d'encapsulation étant apte à former en continu autour de chaque amas trié une
capsule (C) monocouche ou multicouches biocompatible, mécaniquement résistante et
à perméabilité sélective.
5. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'unité d'encapsulation (120) comprend une pluralité de sous-unités d'encapsulation
(121 à 124) qui sont respectivement agencées en parallèle en communication avec lesdits
microcanaux de tri (111 à 114) pour former, pour chaque catégorie de taille d'amas
triés (At) y circulant, une capsule (C) de taille prédéterminée conçue pour envelopper
au plus près chaque amas de cette catégorie.
6. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 5, caractérisé en ce que chaque sous-unité d'encapsulation (121 à 124) comporte un dispositif de formation
(127, 221) desdites capsules (C) choisi dans le groupe constitué par les dispositifs
à jonction en « T », les dispositifs microfluidiques de focalisation d'écoulement
« MFDD », les dispositifs à réseau de microcanaux structurés « MC array » et les dispositifs
à réseau de microbuses « MN array ».
7. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 5, caractérisé en ce que chaque sous-unité d'encapsulation (121 à 124) comporte un échangeur de matière entre
une phase aqueuse (321) comprenant lesdits amas triés (At) au sein de chaque catégorie
et une phase non miscible (322) avec cette phase aqueuse, par exemple huileuse, cet
échangeur étant conçu pour former les capsules (C) par rupture de l'interface entre
ces deux phases due à une surpression.
8. Système microfluidique (1, 101) selon une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que ladite unité d'encapsulation (120, 220) comprend en outre des moyens de gélification
(125, 135, 145, 225) des capsules (C) formées, comprenant un échangeur de matière
constitué de microcanaux et dédié au transfert de ces capsules d'une phase d'encapsulation
les contenant, par exemple de type huile-alginate, vers une phase de gélification
aqueuse ou non.
9. Système microfluidique (1, 101) selon une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'est en outre formé dans ledit réseau de microcanaux un module microfluidique de transfert
(20) conçu pour transférer lesdits amas triés (At) d'un milieu de culture les contenant
vers une phase d'encapsulation destinée à les contenir dans ladite unité d'encapsulation
(120, 220, 320), ce module de transfert étant en communication fluidique avec chacun
desdits microcanaux de tri (111 à 114) et étant conçu pour minimiser les pertes de
charge dans ladite unité de tri (110, 210, 310).
10. Système microfluidique (1, 101) selon une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un module de couplage (30, 40) de ladite unité de tri (110, 210,
310) à ladite unité d'encapsulation (120, 220, 320), qui est conçu pour maintenir
un régime fluidique laminaire dans ces deux unités en faisant communiquer directement
ou bien sélectivement l'unité d'encapsulation avec l'unité de tri.
11. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit module de couplage est constitué de microcanaux intermédiaires qui relient
respectivement lesdits microcanaux de tri (111 à 114) à ladite unité d'encapsulation
(120, 220, 320) et qui présentent des dimensions et une géométrie adaptées pour le
maintien dudit régime laminaire en amont et en aval.
12. Système microfluidique (1, 101) selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit module de couplage (30, 40) comprend des microréservoirs tampon de stockage
(31, 41) desdits amas triés (At), dans chacun desquels débouche l'un desdits microcanaux
de tri (111 à 114) et qui sont chacun reliés sélectivement à ladite unité d'encapsulation
(120, 220, 320) par un microcanal de sortie (33, 43) qui est destiné à véhiculer lesdits
amas triés et concentrés et qui équipé d'une vanne fluidique (32, 42) par exemple
de type à bulle d'air ou à gel bloquant pouvant être dissous, de sorte que l'ouverture
et la fermeture de cette vanne abaisse et élève respectivement la concentration desdits
amas triés dans chaque microréservoir en fonction du nombre de capsules (C) en cours
de formation dans ladite unité d'encapsulation, chaque microréservoir (31, 41) étant
en outre de préférence pourvu d'une pluralité de fins microcanaux transverses de sortie
(34, 44) qui sont conçus pour permettre l'évacuation de la phase contenant lesdits
amas (At) à l'exception de ces derniers, lorsque ladite vanne (32, 42) est fermée.
13. Procédé de tri d'amas (A) peu cohésifs de cellules de taille variant de 20 µm à 500
µm et de 20 à 10 000 cellules environ, tels que des îlots de Langerhans,
caractérisé en ce qu'il consiste à faire circuler ces amas dans un réseau de microcanaux d'un système microfluidique
(1, 101) de géométrie adaptée à la taille et au nombre de ces amas à séparer, et à
les dévier les uns des autres selon l'un de leurs paramètres, tel que leur taille,
de manière à les diriger vers au moins deux microcanaux de tri (111 à 114) véhiculant
en parallèle autant de catégories d'amas triés (At) en vue de leur encapsulation dans
ce même système, et
en ce que de préférence l'on utilise au moins un étage de tri par taille desdits amas (A) pour
générer dans lesdits microcanaux de tri (111 à 114) respectivement au moins deux catégories
de tailles pour lesdits amas triés (At), chaque étage utilisant :
- une déviation hydrodynamique à fluidique passive, de préférence par focalisation
hydrodynamique, par déplacement latéral déterministe (« DLD ») ou par filtration hydrodynamique,
ou
- une déviation hydrodynamique couplée à des forces électrostatiques, magnétiques
ou à des ondes électromagnétiques ou acoustiques.
14. Procédé de tri selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on encapsule en outre de manière automatisée lesdits amas triés (At) en parallèle
en fonction de leur catégorie, en formant en continu autour de chaque amas trié une
capsule (C) monocouche ou multicouches biocompatible, mécaniquement résistante et
à perméabilité sélective, cette capsule étant par exemple à base d'un hydrogel d'alginate.
15. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on forme, pour chaque catégorie de taille d'amas triés (At), une capsule (C) de
taille prédéterminée enveloppant au plus près chaque amas de cette catégorie, de préférence
avec une taille de capsule d'environ Da+20 µm à Da+150 µm pour une catégorie d'amas triés selon une taille critique inférieure à une
valeur Da.
16. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que l'on forme lesdites capsules (C) pour chaque catégorie d'amas trié (At) par un dispositif
(127, 221) choisi dans le groupe constitué par les dispositifs à jonction en « T »,
les dispositifs microfluidiques de focalisation d'écoulement « MFDD », les dispositifs
à réseau de microcanaux structurés « MC array » et les dispositifs à réseau de microbuses
« MN array », et en ce que de préférence l'on forme lesdites capsules (C) par échange de matière entre une phase
aqueuse (321) comprenant lesdits amas triés (At) au sein de chaque catégorie et une
phase non miscible (322) avec cette phase aqueuse, par exemple huileuse, la rupture
de l'interface entre ces deux phases par une surpression générant ces capsules.
17. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon une des revendications 14 à 16,
caractérisé en ce que l'on gélifie ensuite les capsules (C) formées, par un transfert de ces capsules et
de la phase d'encapsulation les contenant, par exemple de type huile-alginate, vers
une phase de gélification aqueuse ou non.
18. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon une des revendications 14 à 17,
caractérisé en ce que, avant chaque encapsulation, l'on transfère lesdits amas triés (At) d'un milieu de
culture les contenant vers la phase d'encapsulation destinée à les contenir, pour
minimiser les pertes de charge lors du tri.
19. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon une des revendications 14 à 18,
caractérisé en ce qu'il comprend en outre un couplage fluidique entre le tri et l'encapsulation ayant pour
effet de maintenir un régime fluidique laminaire dans les microcanaux correspondants,
ce couplage faisant communiquer directement ou bien sélectivement lesdits amas triés
(At) avec la phase d'encapsulation.
20. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'on réalise ce couplage au moyen de fins microcanaux intermédiaires qui présentent
des dimensions et une géométrie adaptées pour le maintien du régime laminaire lors
du tri et lors de l'encapsulation.
21. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'on réalise ce couplage en réglant la concentration de chaque catégorie d'amas triés
(At) dans un microréservoir tampon de stockage (31, 41) de ces amas communiquant avec
l'un desdits microcanaux de tri (111 à 114) et relié sélectivement par une vanne fluidique
(32, 42) à un microcanal de sortie (33, 43) véhiculant les amas triés et concentrés,
l'ouverture et la fermeture de cette vanne abaissant et élevant respectivement la
concentration des amas triés dans le microréservoir en fonction du nombre de capsules
(C) en cours de formation, pour minimiser la formation de capsules vides, ce microréservoir
étant pourvu d'une pluralité de fins microcanaux transverses de sortie (34, 44) conçus
pour évacuer la phase contenant ces amas à l'exception de ces derniers, lorsque la
vanne est fermée.
22. Procédé de tri et d'encapsulation en continu selon une des revendications 14 à 21,
caractérisé en ce que lesdits amas de cellules (At) sont des îlots de Langerhans et sont encapsulés avec
une taille de capsules (C) variant de 70 µm à 200 µm pour les îlots triés selon une
taille inférieure à 50 µm, avec une taille de capsules pouvant atteindre 650 µm pour
les plus gros îlots triés.
23. Utilisation d'un système microfluidique (1, 101) selon une des revendications 1 à
12 pour trier soit des cellules, bactéries, organelles, liposomes, soit des amas de
cellules (At), de préférence selon des catégories d'intérêt via des molécules d'adhésion
dans le premier cas, ou bien selon des catégories de tailles dans le cas d'amas de
cellules, puis pour les encapsuler en continu et de manière automatisée pour chaque
catégorie triée.