PROCÉDÉ DE MANIPULATION DE MICROGOUTTES INCLUANT DES ÉCHANTILLONS

Description

[0001] La présente invention concerne un procédé microfluidique de manipulation d'échantillons, notamment biologiques, dans des microgouttes d'hydrogel. L'invention se rapporte également à un dispositif pour mettre en œuvre un tel procédé et à un produit d'échantillons obtenu en mettant en œuvre un tel procédé.

[0002] Il est connu de Guo, Rotem, Heyman, & Weitz, « Droplet microfluidics for high-throughput biological assays », Lab. Chip. 12 (2012), que les gouttes dans des systèmes microfluidiques (ou « microgouttes ») peuvent être utilisées pour contenir des réactions chimiques ou biologiques. Dans ces systèmes, le contenu de ces gouttes peut être testé en observant la fluorescence de la goutte quand elle passe devant un laser focalisé. Cependant, ces systèmes ne permettent pas d'observer l'évolution en fonction du temps du contenu de ces gouttes sans les extraire du dispositif microfluidique.

[0003] Il est connu aussi, par exemple de Joensson, H. N. & Andersson Svahn, H., « Droplet microfluidics - a tool for single-cell analysis », Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 12176-12192 (2012), d'étudier des cellules individualisées dans des microgouttes. Ces microgouttes forment en effet des compartiments bien définis qui permettent d'isoler des échantillons biologiques comme des cellules, par exemple. Ce document enseigne notamment que la localisation des populations de cellules encapsulées peut être contrôlée grâce à l'accumulation des gouttes dans des chambres de culture, dans des canaux allongés, ou encore dans des pièges statiques. Ce document enseigne encore que les cellules peuvent être encapsulées dans des hydrogels fonctionnalisés, entourés d'une phase huileuse.

[0004] Cependant, l'apport de nutriments ou de manières plus générales de molécules d'intérêt biologique pour les cellules dans de tels dispositifs s'avère limités et les méthodes mises en œuvre (par exemple par électro-fusion ou pico-injection) complexes. En conséquence, ces dispositifs présentent de nombreuses limites pour l'étude du comportement cellulaire, en particulier au niveau temporal.

[0005] Par ailleurs, il est connu de L. Yu, M. C.W. Chen and K. C. Cheung, « Droplet-based microfluidic system for multicellular tumor spheroid formation and anticancer drug testing », Lab Chip (2010) un procédé pour manipuler des microgouttes d'hydrogel contenant des sphéroïdes multicellulaires. Selon ce procédé, des microbilles d'hydrogels incluant des cellules sont réalisées dans un premier système microfluidique. Elles sont ensuite récupérées et lavées dans un bain, avant d'être injectées dans un deuxième système microfluidique comprenant des pièges permettant de fixer les microgouttes.

[0006] Un tel procédé est cependant complexe, qui nécessite deux systèmes microfluidiques distincts et trois dispositifs au total. En outre, il ne permet pas d'observer les échantillons en continu. En particulier il ne permet pas d'observer les moments initiaux entre la formation des gouttes et leur capture.

[0007] Il est également connu de la demande de brevet US 2008/241841 une méthode d'amplification d'ARN messager molécule par molécule comportant les étapes de formation de gouttes contenant un ou plusieurs acide nucléique et un agent gélifiant dispersé sous forme d'émulsion dans une solution d'huile, d'amplification PCR par un dispositif de contrôle de la température et de détection par fluorescence. Une telle méthode d'amplification d'ARN messager nécessite l'utilisation de deux systèmes microfluidiques.

[0008] Il est aussi connu de la demande de brevet US 2003/0049320 un procédé d'encapsulation d'une émulsion pour proposer un nouveau format de porteur d'agent actif, notamment utile dans le cas de médicaments. Cette demande décrit une dispersion gélifiée contenant une ou plusieurs gouttes d'un solvant aqueux contenant un polymère biocompatible.

[0009] De plus, il est connu de la demande de brevet US 2017/0015614 un dispositif de tri, amplification, détection et identification d'acides nucléiques qui comprend un générateur de goutelettes, un substrat divisé en cellules, chacune étant destinées à contenir une goutelette, ainsi qu'un moyen d'injection d'un réactif dans lesdites cellules.

[0010] Il existe donc un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes contenant des échantillons plus simple et permettant cependant une vaste gamme de tests sur les échantillons. Il existe également un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes permettant un tri plus efficace des microgouttes.

[0011] À cette fin, l'invention propose un procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes incluant des échantillons selon la revendication 1 ou la revendication 2.

[0012] Ainsi, selon l'invention, pour trier les microgouttes d'intérêt - c'est-à-dire les microgouttes qui contiennent des échantillons d'intérêt - ces microgouttes sont tout d'abord piégées dans des pièges de tension de surface (ou piège capillaire), puis certaines des microgouttes ou une partie de l'huile qui les entoure sont gélifiées. La gélification des microgouttes ou de l'huile qui les entoure facilite le tri en accentuant la force de piégeage des microgouttes dans les pièges. En d'autres termes, l'étape de gélification permet d'éviter que des microgouttes d'intérêt soient perdues.

[0013] En outre, cette gélification permet d'éviter que des microgouttes ne puissent fusionner, ce qui provoquerait un mélange des échantillons de ces microgouttes.

[0014] Par piège de tension de surface, on entend un piège une zone du système microfluidique dont la géométrie, avec la tension interfaciale de la microgoutte, permet le maintien en position de la microgoutte.

[0015] Toutes les étapes du procédé sont réalisées dans un système microfluidique unique. Par système microfluidique, on entend un système dont les pièces sont fabriquées selon des procédés de microfabrication. Un tel système présente des conduits dont au moins une dimension est typiquement inférieure au millimètre.

[0016] La forme de la microgoutte peut être contrôlée. Ce contrôle de la forme de la microgoutte peut être combiné avec le contrôle de l'instant de gélification de la microgoutte ou d'une partie de l'huile l'entourant, pour donner accès à des applications différentes, notamment sur la manipulation de cellules.

[0017] Par cellules, on entend les cellules eucaryotes (par exemple cellules végétales, champignons, levures, cellules mammifères) et les cellules procaryotes (par exemple bactéries). Pour les cellules de mammifères, on distingue les cellules indépendantes à l'ancrage (par exemple certaines cellules de la lignée sanguine et les cellules tumorales hautement transformées) et les cellules dépendantes à l'ancrage (la majorité des autres types cellulaires), dont certains sous-types peuvent s'organiser sous forme de sphéroïdes. On entend par sphéroïdes, des structures multicellulaires organisées sous formes de micro-tissus dont les fonctionnalités sont similaires à celles de tissus dérivés d'organes.

[0018] Selon des modes de réalisation préférés, le procédé selon l'invention comporte une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises seules ou en combinaison :

• l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie de l'huile de la zone de piégeage, à l'exclusion des microgouttes ;
• l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes, à l'exclusion de l'huile entourant les microgouttes dans la zone de piégeage ;
• l'échantillon est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules ;
• l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons, notamment des cellules, dans les microgouttes piégées, en particulier après formation de sphéroïdes ;
• l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons dans les microgouttes piégées ;
• le procédé comprend en outre l'étape consistant à :
  iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes gélifiées par une solution aqueuse ;
• la solution aqueuse remplaçant l'huile contient une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines ;
• la zone de piégeage est formée par une puce microfluidique comprenant les pièges de tension de surface ;
• l'étape i) consiste à :
  a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage, une solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant,

  b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des microgouttes contenant des échantillons, puis

  c) déplacer les microgouttes jusqu'au niveau de la zone de piégeage et piéger les microgouttes dans la zone de piégeage ;
• les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage, en réalisant les actions consistant à :
  • remplir la zone de piégeage de solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à
  • injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, les pièges de tension de surface étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes contenant des échantillons au niveau des pièges de tension de surface ;
• l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :
  • refroidir ou chauffer des microgouttes et/ou l'huile,
  • injecter une solution contenant un agent chimique de gélification,
  • soumettre les microgouttes et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélification, notamment une lumière UV.
• l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv) ;
• le procédé comprend une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface en fonction de la forme désirée des microgouttes ;
• la zone de piégeage et les pièges sont choisis pour :
  • former des microgouttes piégées avec un fond plat, ou
  • former des microgouttes piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe ;
• le procédé comprend une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifier au moins certaines des microgouttes gélifiées à l'étape iii) ;
• le procédé comprend une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes dégélifiées et/ou les échantillons contenus dans ces microgouttes dégélifiées hors de la zone de piégeage ;
• le procédé comprend une étape d'application d'un stimulus aux échantillons contenus dans au moins une partie des microgouttes piégées, gélifiées ou non ; et
• le procédé comprend une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée, pour ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.

[0019] Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un dispositif selon la revendication 15 ou la revendication 16.

[0020] Le dispositif comprend:

• des moyens pour former des microgouttes contenant des échantillons,
• une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes à des endroits prédéterminés, et
• des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes piégées ou de l'huile.

[0021] Les moyens de gélification peuvent comprendre un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage.

[0022] Le dispositif peut en outre comprendre des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées ou d'une partie de l'huile gélifiée, le cas échéant.

[0023] L'invention vise également un produit de microgouttes gélifiées selon la revendication 17.

[0024] Ce produit comprend
une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant cryo-préservées.

[0025] Pour ce faire, et en vue du stockage et/ou de la distribution de ce produit de microgouttes, la solution biochimique peut contenir des agents de cryo-protection (DMSO, glycérol, tréhalose etc.) pour permettre la cryo-préservation des échantillons.

[0026] Les microgouttes gélifiées peuvent également baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservées.

[0027] L'invention se rapporte aussi à un produit de microgouttes selon la revendication 18.

[0028] Ce produit comprend une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, et des microgouttes incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes et l'huile gélifiée étant de préférence cryo-préservées.

[0029] Les échantillons peuvent être des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.

[0030] L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de mise en œuvre de l'invention, en regard des dessins ci-annexés sur lesquels :

• La figure 1 représente schématiquement une puce microfluidique,
• La figure 2 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 où des pièges sont occupés par une microgoutte d'hydrogel contenant des échantillons,
• La figure 3 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 contenant un mélange d'hydrogel et d'échantillons à tester,
• Les figures 4 à 6 illustrent schématiquement un moyen d'évacuer une partie des échantillons contenus dans des microgouttes d'hydrogel piégées dans une puce microfluidique, hors de cette puce microfluidique,
• Les figures 7 à 12 illustrent schématiquement des exemples de géométries de pièges à tension de surface et les formes de microgouttes qu'ils permettent d'obtenir, et
• Les figures 13 à 15 illustrent schématiquement des exemples de sédimentation d'échantillons dans des microgouttes d'hydrogel.

[0031] L'invention se rapporte à un procédé de manipulation de microgouttes d'hydrogel incluant des échantillons à tester.

[0032] Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement à des échantillons sous forme de cellules, mais d'autres types d'échantillons peuvent bien entendu être mis en œuvre.

[0033] Le procédé comprend essentiellement trois étapes, toutes mises en œuvre dans un unique système microfluidique, les trois étapes consistant à :

• former dans une huile, des microgouttes de solution aqueuse, liquide, contenant une ou des cellules, l'huile ou la solution aqueuse comprenant un agent gélifiant,
• piéger les microgouttes, liquides, au moyen de pièges de tension de surface prédisposés dans une zone de piégeage, et
• gélifier l'huile ou au moins une partie des microgouttes piégées, le cas échéant.

[0034] Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement au cas où la solution aqueuse est une solution d'hydrogel, l'huile ne comprenant pas d'agent gélifiant et où la dernière étape ci-dessus consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes piégées, sans que l'huile ne soit elle gélifiée. Dans ce cas, suite aux trois étapes mentionnées ci-dessus, le procédé peut se poursuivre en mettant en œuvre différentes étapes, en fonction du test que l'on souhaite mettre en œuvre, notamment.

[0035] Le procédé peut notamment se poursuivre par une étape consistant à remplacer l'huile autour des microgouttes gélifiées, par une solution aqueuse, sans déplacer les microgouttes des pièges de tension de surface. La solution aqueuse peut contenir une solution biochimique avec au moins l'un parmi des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des molécules de médicament et des tampons de pH et/ou de salinité.

[0036] Selon un autre aspect, le procédé permet le contrôle de la forme tridimensionnelle de billes d'hydrogel dans un canal microfluidique et/ou dans des pièges de tension de surface, avec pour application première l'encapsulation de cellules dans ces microgouttes. Ainsi, selon la forme des microgouttes et la concentration de cellules par microgoutte, l'encapsulation des cellules dans de l'hydrogel permet leur culture ou leur analyse, tout en les perfusant avec des solutions biochimiques, ou en leur appliquant des stimuli physiques tels que de la chaleur ou de la lumière, par exemple.

[0037] Par gel, on entend un milieu composé d'une majorité de liquide et contenant des molécules ou des particules pouvant s'organiser pour lui conférer un aspect solide, comme par exemple l'absence d'écoulement à son état stable. Cette solution peut être manipulée à l'état liquide et peut ensuite être « gélifiée » par des moyens chimiques ou physiques. La gélification peut être réversible dans certains cas. Quand le liquide est l'eau, on parle d'hydrogel.

[0038] Comme indiqué ci-avant, le procédé microfluidique proposé comporte une première étape de formation de microgouttes d'hydrogel contenant des cellules biologiques dans une huile.

[0039] Ici, les microgouttes (ou microbilles) présentent un diamètre de l'ordre du micromètre, notamment un diamètre compris entre 10 et 1000 micromètres.

[0040] L'hydrogel est par exemple une solution aqueuse comprenant un agent gélifiant. L'agent gélifiant est choisi par l'utilisateur en fonction de l'application. Un exemple d'agent gélifiant pouvant être gélifié de manière physique est l'agarose, liquide à température ambiante et qui gélifie à basse température. Un agent gélifiant pouvant être gélifié de manière chimique est par exemple l'alginate, liquide en solution et qui gélifie en cas d'apport d'ions calcium Ca²⁺.

[0041] Au niveau biologique, les propriétés biochimiques et biomécaniques de l'hydrogel peuvent permettre aux cellules sensibles à l'ancrage d'établir des interactions spécifiques avec la matrice ainsi formée. Ces interactions sont essentielles pour la survie des cellules mammifères dépendantes de l'ancrage et participent à la régulation de leur phénotype. La nature de la matrice peut par exemple permettre d'observer la migration cellulaire ou protéolyse (digestion de la matrice par les cellules). Des expériences particulièrement concluantes ont été menées avec de l'agarose, de l'alginate, du PEG-DA (Polyéthylène glycol Diacrylate), mais aussi de la gélatine, du collagène de type I ou du Matrigel ®. Par exemple, les hydrogels contenant diverses protéines, glycoaminoglycans et autres composants de la matrice extracellulaire (par exemple le collagène de type I, la gélatine ou le Matrigel®) ont démontré leur capacité à maintenir la viabilité, à soutenir la prolifération et la capacité de migration, ainsi qu'à maintenir le phénotype de certaines populations de cellules dépendantes à l'ancrage. Il est à noter ici que les gels peuvent être combinés, par apport de microgouttes successives, par exemple. À chacun des hydrogels mentionnés correspond une procédure de gélification spécifique. Certains hydrogels, tel le PEG-DA, peuvent en outre être fonctionnalisés pour permettre la survie et/ou le développement des cellules, en incorporant des peptidomimetiques (par exemple les hydrogels peuvent être fonctionnalisés avec des séquences consensus type RGD sur lesquelles certains types de cellules mammifères peuvent établirent des interactions spécifiques ou encore des séquences consensus PRCG[V/N]PD ou HEXGHXXGXXH spécifiques aux métallo protéases) ou le capteur de molécules spécifiques via l'incorporation d'anticorps ou d'aptamères, par exemple la capture in situ de cytokines sécrétées par des lymphocytes encapsulés. Les propriétés mécaniques de ces hydrogels peuvent aussi être modulées pour différentes applications, en faisant par exemple varier leur taux de réticulation et/ou leur concentration. L'ensemble de ces propriétés physico-chimiques peuvent être différentes d'un piège à l'autre au sein de la zone de piégeage. L'instauration d'un gradient de rigidité au sein des microgouttes d'hydrogels piégées permet par exemple la différenciation contrôlée de cellules souches en différents types cellulaires. Enfin, plusieurs hydrogels peuvent coexister dans une même microgoutte suite à un mélange ou à la formation successive de plusieurs couches autour du cœur gélifié dans le piège.

[0042] Les cellules sont mélangées à l'hydrogel, a priori avant la formation des microgouttes. Cependant, le mélange de l'hydrogel et des cellules peut être réalisé directement dans le dispositif microfluidique, avant la formation des microgouttes.

[0043] De nombreux procédés ont déjà été proposés pour former de telles microgouttes dans une phase mobile tel que de l'huile. On peut par exemple citer les exemples de procédé :

• procédé dit de « flow-focusing » décrit par exemple dans S.L. Anna, N. Bontoux et H.A. Stone, « Formation of dispersions using 'Flow-Focusing' in microchannels », Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003),
• procédé dit à «jonction en T » décrit par exemple dans « Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device » par T. Thorsen, R. W. Roberts, F. H. Arnold et S. R. Quake, Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4166 (2001), ou bien
• procédé dit « à gradient de confinement» décrit par exemple dans la demande FR-A-2 958 186.

[0044] Ces procédés permettent de former des microgouttes de dimensions sensiblement égales.

[0045] Après formation de ces microgouttes, les microgouttes sont acheminées depuis la zone où elles ont été formées jusqu'à la zone de piégeage par des microcanaux, entraînées par un flux d'huile et/ou par des pentes ou des rails. Il a été constaté que cet acheminement aide à la formation de sphéroïdes dans les microgouttes. Les microgouttes sont ensuite piégées par des pièges de tension de surface disposés dans la zone de piégeage, notamment dans une puce microfluidique. La zone de piégeage (ou la puce microfluidique 10) est traitée par un traitement de surface hydrophobe, et remplie d'une huile contenant un surfactant. L'utilisation de surfactant permet la stabilisation des microgouttes et la reproductibilité de leur formation. Les surfactants permettent de plus d'empêcher la coalescence des microgouttes en cas de contact pendant leur acheminement du dispositif de production aux pièges de la zone de piégeage.

[0046] La puce microfluidique 10, telle qu'illustrée sur la figure 1, est composée d'une chambre de culture, possiblement de plusieurs centimètres carrés, contenant de nombreux pièges de tension de surface organisés en tableau ou matrice. Les pièges de tension de surface 12 peuvent avoir des formes variées. Par exemple, dans le cas de pièges cylindriques, leur diamètre peut s'étendre de quelques dizaines de microns à plusieurs centaines en fonction de l'application souhaitée. Pour l'encapsulation de cellules uniques ou individualisées dans les microgouttes, le diamètre des pièges peut être par exemple de 50 microns, ce qui correspond à une densité d'environ 5000 pièges par centimètre carré. Pour l'étude de larges agrégats cellulaires ou de sphéroïdes, ce diamètre peut passer à 250 microns, ce qui correspond alors à une densité de pièges de l'ordre de 250 pièges par centimètre carré.

[0047] Comme illustré à la figure 1, les microgouttes 14 incluant les cellules biologiques 16, formées à l'extérieur de la puce microfluidique 10, sont entraînées dans cette dernière, par exemple à l'aide d'un flux d'huile illustré par la flèche 18 de telle sorte que certaines de ces microgouttes sont piégées dans les pièges de tension de surface 12.

[0048] En variante cependant, il est proposé ici de former des microgouttes d'hydrogels contenant des cellules biologiques, dans une huile, sans contrôle précis de l'écoulement d'hydrogel contenant les cellules biologiques dans l'huile. En effet, seules les microgouttes présentant des dimensions adéquates sont par la suite piégées dans la zone de piégeage, de sorte que cette dernière est occupée par des microgouttes présentant finalement une grande homogénéité de dimension, de forme et de concentration en cellules biologiques.

[0049] Selon une autre variante, illustrée à la figure 3, la zone de piégeage, notamment une puce microfluidique 10, contient une solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16. On injecte alors dans la zone de piégeage de l'huile (l'injection est schématisée par la flèche 18), qui pousse la solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16 vers une sortie de la zone de piégeage. Les microgouttes se forment alors directement au niveau des pièges de tension de surface 12, par piégeage de l'hydrogel dans ces pièges de la puce microfluidique, ceci jusqu'à obtenir une configuration sensiblement identique à celle illustrée sur la figure 2. Les microgouttes se forment ainsi par division spontanée (ou cassure) de la solution d'hydrogel contenant les cellules biologiques, sur les pièges de tension de surface. Ici aussi, un contrôle précis des écoulements n'est pas nécessaire et il est même possible de pousser les seringues à la main, sans avoir recours à des instruments sophistiqués. Dans ce cas, on préfère des pièges de tension de surface profonds pour permettre la cassure des microgouttes (c'est-à-dire leur formation) au niveau des pièges de tension de surface. De tels pièges seront décrits ultérieurement.

[0050] Il est à noter ici que les pièges peuvent être de formes très différentes, notamment en fonction de l'application recherchée, c'est-à-dire en particulier en fonction de la forme des microgouttes piégées recherchée. La cavité formant piège peut aussi se trouver indifféremment sur la paroi supérieure, inférieure ou une des parois latérales de la zone de piégeage, notamment de la puce microfluidique.

[0051] Les figures 7 à 12 illustrent des formes envisageables des pièges de tension de surface 12 de la puce microfluidique 10 et la forme des microgouttes 14 qui peut être obtenue à l'aide de ces pièges de tension de surface 12.

[0052] En particulier, la forme du piège 12 permet de contrôler la forme des microgouttes piégées, selon les paramètres géométriques du canal microfluidique dans lequel est formé le piège 12, et le volume des microgouttes piégées. La figure 7 illustre schématiquement les paramètres à prendre en compte pour déterminer le profil de la microgoutte, à savoir le rayon R de la microgoutte confinée dans un canal contenant un piège 12, la hauteur h de ce canal, inférieure au rayon R de la microgoutte dans le canal, et le diamètre d et la profondeur p du piège 12.

[0053] Quand le piège 12 est cylindrique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal, comme illustré aux figures 8 à 10, alors la microgoutte 14 rentre autant que possible dans le piège 12. Selon les volumes relatifs du piège 12 et de la microgoutte 14, la microgoutte 14 peut présenter ou non une calotte hémisphérique, et avoir ou non une partie plate, confinée par les parois du canal. Ainsi, sur la figure 8, le volume de la microgoutte 14 est supérieur au volume du piège 12. Dans ce cas, la microgoutte 14 remplit presque totalement le piège 12 et présente une forme aplatie contre les parois du canal et du piège. Sur la figure 9, la microgoutte 14 présente un volume légèrement plus faible que celui du piège 12, alors la microgoutte 14 présente deux calottes hémisphériques et ne fait qu'effleurer les parois du canal. Enfin, si la microgoutte 14 présente un volume nettement plus faible que le volume du piège 12, comme cela est illustré sur la figure 10, alors la microgoutte 14 (voire plusieurs microgouttes 14) sont entièrement reçu dans le piège 12.

[0054] Dans le cas de la figure 11, par contre, le piège a un diamètre d inférieur à deux fois la hauteur h du canal. Par suite, la microgoutte 14 reste essentiellement confinée dans le canal et ne présente qu'une petite calotte hémisphérique dans le piège 12.

[0055] Enfin, dans le cas de la figure 12, le piège 12 est conique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal. La microgoutte 14 épouse alors la forme de la paroi du piège 12 pour former une calotte hémisphérique dans le piège 12.

[0056] Par ailleurs, comme illustré sur la figure 13, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond plat, les cellules 16 sédimentent et se déposent de manière statistiquement uniforme au fond de la microgoutte 14. Les cellules peuvent alors être observées individuellement, et ne s'agrègent pas. Au contraire, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond non plat, notamment convexe, comme illustré sur les figures 14 et 15, alors les cellules 16 rencontrent l'interface de la microgoutte 12 lors de leur sédimentation, et se retrouvent obligées de glisser le long de cette interface. Les cellules 16 se concentrent ainsi au fond de la microgoutte 14, et peuvent éventuellement s'agréger et former des sphéroïdes dans le cas de certaines cellules dépendantes de l'ancrage.

[0057] Le procédé microfluidique proposé ici comprend, après le piégeage des microgouttes, une étape de gélification de ces microgouttes.

[0058] Cette étape peut être réalisée de manières variées, en fonction notamment de l'agent gélifiant de l'hydrogel utilisé. Ainsi, selon un premier exemple, l'hydrogel contient, de préférence est de l'agarose. La gélification des microgouttes est alors réalisée en refroidissant la puce microfluidique. Lorsque l'hydrogel contient ou, de préférence, est de l'alginate, il est possible d'amener des ions calcium Ca²⁺ dans l'huile dans laquelle baignent les microgouttes, ou bien de pré-mélanger des particules calcaires avec l'alginate et de saturer en CO₂ l'huile dans laquelle baignent les microgouttes. On acidifie ainsi l'alginate et on libère des ions calcium. Bien entendu, d'autres agents gélifiants pouvant être utilisés, d'autres moyens de gélification peuvent être mis en œuvre.

[0059] Par ailleurs, en fonction de l'application recherchée, cette étape de gélification peut être mise en œuvre à des instants différents du procédé de manipulation. En particulier, la gélification peut se faire immédiatement après le piégeage de façon à figer les cellules sur place, dans la microgoutte, et ne pas leur permettre de sédimenter. On peut alors observer les cellules indépendamment les unes des autres. Alternativement, la gélification est réalisée après la sédimentation des cellules pour former des sphéroïdes. Ceci permet d'observer le comportement des cellules ayant formé un sphéroïde. Selon une autre alternative, la gélification des microgouttes n'est mise en œuvre qu'après des manipulations des cellules en milieu liquide, par exemple pour extraire certaines cellules - celles dans des microgouttes non gélifiées - de façon sélective. Ceci peut être utile pour des cellules comme des bactéries ou des érythrocytes et leucocytes, qui sont indépendantes de l'ancrage.

[0060] Après gélification, il est possible de remplacer l'huile dans laquelle baignent les microgouttes par une solution aqueuse contenant notamment une solution biochimique comportant des composants biochimiques tels que des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des drogues ou des molécules de médicament, par exemples. Ces composants biochimiques diffusent dans le gel et atteignent les cellules. Il est ainsi possible d'étudier la réaction des cellules, indépendantes ou sous forme de sphéroïdes, à ces stimuli. L'hydrogel permet ainsi de maintenir les cellules dans un emplacement précis, tout en permettant leur perfusion par une phase aqueuse et en ayant préalablement compartimenté l'échantillon biologique lors de l'encapsulation des cellules dans des microgouttes.

[0061] Pour réaliser cette opération avec succès, il est préférable de chasser le surfactant des interfaces des microgouttes. La coque que forment les surfactants au niveau de l'interface des microgouttes peut en effet être si efficace qu'elle empêche la phase aqueuse, que l'on injecte pour remplacer l'huile, de remplir la puce microfluidique, en conservant les microgouttes gélifiées dans leurs pièges respectifs. Comme la coalescence est combattue par la présence de surfactant, l'arrivée de l'interface de la phase aqueuse au niveau d'un piège résulte en une force appliquée sur la microgoutte gélifiée qui peut être chassée du piège si l'hydrogel qui la compose est suffisamment compressible. C'est pourquoi il est préférable de favoriser la coalescence en diminuant la concentration de surfactant au niveau de l'interface. Pour ce faire, la puce microfluidique est perfusée avant injection de la phase aqueuse par de l'huile qui, à la différence de l'huile utilisée précédemment, ne contient pas de surfactant. La concentration de surfactant dans l'huile de la puce microfluidique diminue, ce qui permet de déplacer l'équilibre d'adsorption de surfactant à l'interface vers la désorption. Pour des concentrations élevées de surfactant, par exemple de l'ordre de quelques pourcents en masse, il est préférable de perfuser la puce microfluidique avec une quantité d'huile équivalente à 50 fois le volume de la puce microfluidique. Ce ratio dépend de la nature du ou des surfactants et de son/leur affinité pour les deux phases.

[0062] La forme des pièges peut également être optimisée pour assurer le maintien en position des microgouttes gélifiées dans les pièges. Ainsi, dans le cas d'un piège cylindrique suffisamment profond, si la hauteur du canal est plus grande que le rayon du piège, l'entrée de la microgoutte dans le piège va être minime, résultant en une faible efficacité de piégeage. Par suite, il existe une vitesse limite du flux extérieur au-delà de laquelle les microgouttes sont chassées des pièges. À l'inverse, quand la hauteur du canal est plus petite que le rayon du piège, la microgoutte, à condition qu'elle soit suffisamment grande, pénètre fortement dans la cavité du piège, résultant en une forte efficacité de piégeage. Les microgouttes restent en place indépendamment de la vitesse du flux extérieur. Dans le premier cas, la forme de la microgoutte est très proche de sa forme dans le canal alors que dans le deuxième cas, elle adopte localement la forme du piège.

[0063] Lorsque l'agent gélifiant de l'hydrogel choisi est réversible, il est possible de dégélifier les microgouttes puis d'évacuer leur contenu hors de la puce microfluidique, comme illustré aux figures 4 à 6. Dans le cas de ces figures 4 à 6, les microgouttes 14 sont des microgouttes d'agarose gélifiées, par exemple. Ces microgouttes 14 d'agarose sont dégélifiées une par une en les chauffant localement (le chauffage étant illustré par les éclairs 21), notamment à l'aide d'un laser infra-rouge ou d'électrodes. La chaleur liquéfie l'agarose. Lorsque la phase entourant les microgouttes 14 est aqueuse, le contenu 16 de l'agarose dégélifié se mélange avec la phase aqueuse. Il est alors possible d'entraîner ce contenu par le flux 22 de la phase aqueuse, éventuellement pour le récupérer. Il est également possible d'éliminer ainsi les cellules jugées non intéressantes de la puce microfluidique 10. De nouveau, la forme et la taille du piège sont de préférence choisies pour permettre l'extraction des cellules. Par exemple, dans le cas où les cellules doivent rester viables, le piège est dimensionné suffisamment grand pour que le chauffage de l'hydrogel n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire.

[0064] Alternativement, lorsque la phase entourant les microgouttes est huileuse, un flux d'huile peut être imposé pour déloger la microgoutte liquide du piège. Dans ce cas, la forme et la force du piège sont de préférence dimensionnées de façon à permettre l'extraction de la microgoutte choisie uniquement, et non pas des autres. Ce dimensionnement dépend notamment de la valeur de la tension de surface entre la phase aqueuse et l'huile, ainsi que de la rigidité des microgouttes de gel et leur forme à l'intérieur du piège.

[0065] Une autre alternative est de maintenir les microgouttes liquides pour la manipulation de cellules en suspension, par exemple des bactéries. La gélification est alors mise en œuvre uniquement pour l'extraction sélective des microgouttes. Dans ce cas, on peut soit gélifier toutes les microgouttes avant extraction et appliquer le protocole décrit ci-avant, soit au contraire gélifier uniquement les microgouttes qu'on souhaite conserver dans les pièges.

[0066] Le procédé présenté permet grâce à de légères modifications de s'intéresser à des applications biologiques très variées. Dans chaque cas, le dispositif peut bien sûr aussi être modifié en ajustant la hauteur du canal dans la puce microfluidique et la géométrie des pièges.

[0067] Ainsi, par exemple, une gélification rapide avec une faible concentration de cellules permet d'individualiser quelques cellules uniques dans chaque microgoutte en essayant de limiter leurs interactions directes. Ces cellules peuvent par exemple être des bactéries, des levures ou des cellules de mammifères.

[0068] Alternativement, une forte concentration en cellules avec toujours une gélification rapide, permet d'obtenir un grand nombre de cellules toujours individualisées mais proches les unes des autres. On peut alors s'intéresser par exemple aux interactions entre cellules, possiblement en co-culture, via des secrétions paracrines.

[0069] Les cellules peuvent cependant être maintenues encapsulées longtemps en phase liquide avant gélification. Une faible concentration en cellules permet alors, par exemple, d'étudier des cellules en suspension, indépendantes de l'ancrage, comme les lymphocytes. Une forte concentration en cellules et une forme des microgouttes piégées permettant la sédimentation des cellules, permet de mettre en contact les cellules qui vont pouvoir se réorganiser en sphéroïdes.

[0070] Le procédé peut également permettre de former des sphéroïdes directement dans la puce de manière contrôlée. Le volume des microgouttes créées peut être contrôlé par le dispositif de formation de microgouttes en amont de la puce microfluidique. Ce volume est de préférence réglé de manière que les microgouttes, une fois piégées, aient un diamètre égal à celui du piège et une forme sphérique. Pour ce faire, la profondeur du piège est de préférence au moins égale à son diamètre. Le fait que le diamètre de la microgoutte piégée coïncide avec celui du piège, permet d'assurer une efficacité de piégeage importante. La forme sphérique favorise la formation de sphéroïdes. Pour cette application particulière, les microgouttes contiennent de préférence des cellules en suspension dans une phase aqueuse comprenant ou constituée de milieu de culture et d'hydrogel. Une fois les pièges remplis par une telle microgoutte, le flux d'huile extérieur est arrêté, ce qui stoppe les recirculations au sein des microgouttes et favorise la sédimentation des cellules. La forme sphérique des microgouttes dans les pièges induit alors une concentration des cellules en leur points le plus bas, jusqu'à ce qu'elles entrent en contact. Garder alors la puce au repos, dans des conditions favorables à la survie et au bon fonctionnement métabolique des cellules, notamment en température, pendant une durée allant de plusieurs heures à plusieurs jours, permet la réorganisation des cellules concentrées au fond de la microgoutte piégée, en sphéroïde.

[0071] La durée nécessaire à la formation de sphéroïdes peut notamment dépendre du type cellulaire utilisé et de la composition de l'hydrogel. Pour des cellules hépatiques de rat H4IIEC3 dans une solution d'agarose à 1% en masse dilué dans du milieu de culture, il a été constaté que cette durée est inférieure à 24 heures. Bien entendu, l'hydrogel est maintenu liquide pendant le temps de formation des sphéroïdes.

[0072] Ce procédé permet de former rapidement un grand nombre de sphéroïdes de tailles très homogènes. En effet, la taille des sphéroïdes est donnée par le nombre de cellules encapsulées dans chaque microgoutte et donc par la concentration de la solution de cellules injectée dans la puce microfluidique. La distribution du nombre de cellules par microgoutte, et donc celle de la taille des sphéroïdes formés, est très homogène à condition que les cellules soient suffisamment individualisées au moment de l'injection. En moyenne, dans les expériences menées par les inventeurs, 98% des pièges ont été remplis avec une microgoutte d'agarose liquide qui après 24 heures d'incubation contenait un sphéroïde bien réorganisé.

[0073] Les sphéroïdes obtenus dans la puce microfluidique peuvent être gardés en culture plusieurs jours. Par exemple, des sphéroïdes de cellules H4IIEC3 encapsulés dans l'agarose peuvent être mis en culture dans la puce pendant une semaine sans altération significative de leur viabilité tout en conservant une fonctionnalité forte (dans cet exemple une sécrétion d'albumine forte et continue).

[0074] Le procédé présenté ici et la puce microfluidique obtenue en le mettant en œuvre, constituent un excellent outil de criblage de médicaments. On peut par exemple créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses et observer si leur viabilité décroit au cours du temps en fonction de l'exposition à une molécule testée. En ajoutant à la puce un dispositif qui permet d'instaurer un gradient de concentration au sein de la chambre, ou bien en mettant en place des puces parallèles, on peut tester tout une gamme de concentrations dans un même système. La grande efficacité du procédé de formation de ces sphéroïdes permet aussi d'en créer un grand nombre à partir d'échantillons très limités. 500 sphéroïdes d'environ 70 µm de diamètre peuvent ainsi être formés avec seulement 100 000 cellules.

[0075] Les cellules qui composent les sphéroïdes peuvent aussi être de différents types pour aborder des thématiques de co-culture. Ces types cellulaires peuvent être mélangés de manière homogène en solution avant l'injection dans la puce ou être agencés selon une certaine organisation structurelle, dans plusieurs couches d'hydrogels successives ou simplement par adhésion à l'hydrogel après avoir été perfusées dans la phase aqueuse externe. On peut par exemple associer des fibroblastes et des cellules épithéliales pour former un modèle de peau et tester la toxicité de produits cosmétiques, des neurones et des astrocytes pour modéliser le cerveau, ou encore des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses comme dans la paroi des vaisseau sanguins.

[0076] Comme le procédé présenté ici permet d'atteindre un contrôle très poussé du microenvironnement des cellules en culture, il est aussi un excellent outil pour l'étude de la différenciation de cellules souches. Les cellules encapsulées peuvent en effet être soumises à toute une gamme de concentration de facteurs de différenciation et, potentiellement en même temps, à toute une gamme de rigidité de la matrice en jouant par exemple sur la concentration de l'hydrogel. De la même manière, le procédé peut être utilisé pour observer le développement embryonnaire au cours du temps en interaction avec les facteurs physico-chimiques du milieu extérieur.

[0077] Dans le cas de cellules primaires, issues d'un patient, ce procédé permet de faire un diagnostic médical basé sur la réponse des cellules à certains marqueurs. Dans ce cas, les cellules sont capturées avec un très faible taux de pertes. On peut alors soumettre les cellules à des tests connus de diagnostic de certaines maladies, comme une caractérisation d'une biopsie cancéreuse. Par exemple, on peut tester la présence d'une mutation dans le génome des cellules encapsulée, par exemple par réactions en chaîne par polymérase (PCR, pour l'anglais « Polymerase Chain Reaction ») in situ, ou par la méthode FISH. On peut encore détecter l'expression de protéines spécifiques par des méthodes de marquages, par exemple en apportant des anticorps pour l'immuno-marquage ou pour une méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») in situ.

[0078] Le procédé décrit ci-avant offre la possibilité d'effectuer toutes les étapes d'analyse et de culture de cellules dans une puce microfluidique, grâce à la gélification des microgouttes suite à leur piégeage dans la puce. Ceci permet d'utiliser des volumes de réactifs beaucoup moins importants que pour des tests réalisés en plaques multi-puits ou en boîtes de cultures. Ceci permet également de suivre les réponses de cellules au cours du temps, suite à différents stimuli.

[0079] Le procédé décrit ci-avant peut être mis en œuvre facilement dans un dispositif comprenant :

• des moyens pour former des microgouttes d'hydrogel contenant des cellules,
• une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes d'hydrogel à des endroits prédéterminés, et
• des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes piégées.

[0080] Les moyens de gélification comprennent par exemple un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage et/ou des moyens de régulation de la température, par exemple pour refroidir la puce microfluidique.

[0081] Le dispositif peut également comprendre des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées, par exemple un laser.

[0082] Le procédé décrit ci-avant permet également de réaliser un produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune une ou des cellules, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant cryo-préservées. Les cellules peuvent être agrégées sous forme d'amas ou de sphéroïdes. Les microgouttes gélifiées peuvent baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservés. Cette cryo-préservation permet notamment le maintien des cellules dans des conditions stables durant une longue période, en vue de les transporter ou de les stocker pour une analyse ultérieure.

[0083] Les cellules biologiques encapsulées dans les microgouttes peuvent être des bactéries, des levures, des cellules eucaryotes, des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, de préférence encore des cellules de rat ou d'autres mammifères, ou des cellules humaines isolées de leur environnement naturel.

[0084] Bien entendu, l'invention ne se limite pas aux seuls exemples décrits ci-avant mais est, au contraire, susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, dans le cadre du jeu de revendications ci-joint.

[0085] En particulier, les échantillons mis en œuvre, outre des cellules, peuvent notamment être également des molécules, des billes de plastiques fonctionnalisées en les couplant à des molécules.

[0086] Par ailleurs, les microgouttes piégées peuvent être fusionnées avec d'autres microgouttes apportées par le flux de solution aqueuse.

[0087] Également, la solution aqueuse dont sont constituées les microgouttes, peut contenir une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi des lipides (acides gras, etc.), des glucides (sous forme monomérique ou de polysaccharides etc.), des acides aminés et protéines (facteurs de croissances, cytokines, anticorps, antigènes etc.), ainsi que des tampons de salinité et/ou de pH.

[0088] Enfin, selon une variante, l'huile (ou phase huileuse) entourant les microgouttes peut contenir des huiles fluorées (type FC40) ou encore des solutions photo-réticulables non miscibles à l'eau (type Norland Optical Adhesive), qui, une fois polymérisées permettent de gélifier l'huile et d'ainsi isoler physiquement et sélectivement les microgouttes. On peut ainsi cloisonner, isoler de manière plus robuste, les microgouttes les unes par rapport aux autres. Ceci permet d'éviter que deux microgouttes ne fusionnent, provoquant un mélange des échantillons qu'elles contiennent. Ceci permet également de stocker de manière durable les échantillons, les risques d'évaporation, notamment, des microgouttes étant fortement diminués du fait du cloisonnement des microgouttes par l'huile gélifiée, qui forme un compartiment solide autour des microgouttes.

[0089] Une fois qu'une partie de l'huile a été gélifiée, on peut pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée. Pour ce faire, on peut mettre en œuvre un flux d'huile ou d'un autre fluide dans la zone de piégeage, le flux étant suffisamment fort pour entraîner les microgouttes. On peut ainsi ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.

[0090] Il est à noter ici que des microgouttes peuvent être gélifiées même dans le cas où l'huile est gélifiée. En outre, le procédé peut bien entendu comporter dans ce cas où une partie de l'huile est gélifiée, une étape postérieure de dégélification de l'huile gélifiée.

Revendications

1. Procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à :

i) former dans une huile des microgouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), la solution aqueuse contenant un échantillon (16) comprenant un agent gélifiant,

ii) piéger les microgouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et

iii) gélifier au moins une partie des microgouttes (14) piégées,

les étapes du procédé étant réalisées dans un unique système microfluidique.

2. Procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à :

i) former dans une huile des microgouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), l'huile comprenant un agent gélifiant,

ii) piéger les microgouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et

iii) gélifier au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage (10).

3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes, le procédé comprenant en outre l'étape consistant à :
iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes (14) gélifiées par une solution aqueuse,
la solution aqueuse remplaçant l'huile contenant de préférence une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines.

4. Procédé selon la revendication 1 ou 3, comprenant une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifier au moins certaines des microgouttes (14) gélifiées à l'étape iii), le procédé comprenant de préférence une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes (14) dégélifiées et/ou les échantillons (16) contenus dans ces microgouttes (14) dégélifiées hors de la zone de piégeage (10).

5. Procédé selon la revendication 2, comprenant une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon (16) est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons (16), notamment des cellules, dans les microgouttes (14) piégées, en particulier après formation de sphéroïdes ou dans lequel l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons (16) dans les microgouttes (14) piégées.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de piégeage est formée par une puce microfluidique (10) comprenant les pièges de tension de surface (12).

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape i) consiste à :

a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage (10), une solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant,

b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des microgouttes (14) contenant des échantillons (16), puis

c) déplacer les microgouttes (14) jusqu'au niveau de la zone de piégeage (10).

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage (10), en réalisant les actions consistant à :

- remplir la zone de piégeage (10) de solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à

- injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage (10) pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), les pièges de tension de surface (12) étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes (14) contenant des échantillons (16) au niveau des pièges de tension de surface (12).

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :

- refroidir ou chauffer des microgouttes (14) et/ou l'huile,

- injecter une solution contenant un agent chimique de gélification dans la zone de piégeage,

- soumettre les microgouttes (14) et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélification, notamment une lumière UV.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv).

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface (12) en fonction de la forme désirée des microgouttes (14), de préférence la zone de piégeage et les pièges étant choisis pour :

- former des microgouttes (14) piégées avec un fond plat, ou

- former des microgouttes (14) piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe..

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape d'application d'un stimulus aux échantillons (16) contenus dans au moins une partie des microgouttes (14) piégées, gélifiées ou non.

15. Dispositif pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3 et 4 ou l'une quelconque des revendications 6 à 13 en combinaison avec au moins la revendication 1, comprenant :

- une solution d'hydrogel contenant des échantillons (16),

- des moyens pour former des microgouttes (14) de solution d'hydrogel contenant des échantillons (16),

- une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes (14) à des endroits prédéterminés,

- des moyens de gélification d'une partie au moins des microgouttes (14) piégées, les moyens de gélification comprenant de préférence un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage (10), et

- optionnellement des moyens de dégélifier au moins certaines des microgouttes (14) d'hydrogel gélifiées.

16. Dispositif pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 5 ou l'une quelconque des revendications 6 à 13 en combinaison avec au moins la revendication 2, comprenant :

- des moyens pour former des microgouttes (14) contenant des échantillons (16),

- une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes (14) à des endroits prédéterminés, la zone de piégeage contenant une huile comprenant un agent gélifiant,

- des moyens de gélification de l'huile, les moyens de gélification comprenant de préférence un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage (10), et

- optionnellement des moyens de dégélifier au moins d'une partie de l'huile gélifiée.

17. Produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique (10), et des microgouttes (14) gélifiées incluant chacune un échantillon (16), piégées dans la zone de piégeage (10),
les microgouttes (14) gélifiées étant cryo-préservées, les échantillons (16) étant de préférence des cellules de mammifères, par exemple des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.

18. Produit de microgouttes comprenant une zone de piégeage de microgouttes présentant une pluralité de pièges de tensions de surface (12), en particulier une puce microfluidique (10), et des microgouttes (14) incluant chacune un échantillon (16), piégées dans les pièges de tensions de surface (10),
les microgouttes (14) baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes (14) et l'huile gélifiée étant de préférence cryo-préservées,
les échantillons (16) étant de préférence des cellules de mammifères, par exemple des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.

Ansprüche

1. Verfahren zur Handhabung von Mikrotröpfchen (14), die Proben (16) enthalten, in einem Mikrofluidiksystem, bei dem man in den folgenden Schritten:

i) in einem Öl Mikrotröpfchen (14) einer eine Probe (16) enthaltenden wässrigen Lösung bildet, wobei die eine Probe (16) enthaltende wässrige Lösung ein Geliermittel umfasst,

ii) die Mikrotröpfchen (14) mithilfe von in einer Einfangzone (10) vorgesehenen Oberflächenspannungsfallen (12) einfängt, und

iii) mindestens einen Teil der eingefangenen Mikrotröpfchen (14) geliert,

wobei die Schritte des Verfahrens in einem einzigen Mikrofluidiksystem durchgeführt werden.

2. Verfahren zur Handhabung von Mikrotröpfchen (14), die Proben (16) enthalten, in einem Mikrofluidiksystem, bei dem man in den folgenden Schritten:

i) in einem Öl Mikrotröpfchen (14) einer eine Probe (16) enthaltenden wässrigen Lösung bildet, wobei das Öl ein Geliermittel umfasst,

ii) die Mikrotröpfchen (14) mithilfe von in einer Einfangzone (10) vorgesehenen Oberflächenspannungsfallen (12) einfängt, und

iii) mindestens einen Teil des Öls in der Einfangzone (10) geliert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem in Schritt iii) mindestens ein Teil der Mikrotröpfchen geliert wird, wobei das Verfahren außerdem den folgenden Schritt umfasst:
iv) Ersetzen des Öls, das die gelierten Mikrotröpfchen (14) umgibt, durch eine wässrige Lösung, wobei die das Öl ersetzende wässrige Lösung vorzugsweise eine biochemische Lösung enthält, wobei die biochemische Lösung vorzugsweise mindestens eines aus einem oder mehreren pH- oder Salzgehaltpuffern, einem oder mehreren Nährstoffen, einem oder mehreren Wachstumsfaktoren, Cytokinen, einem oder mehreren Antikörpern, einem oder mehreren Antigenen, einem oder mehreren Molekülen, insbesondere Arzneistoffmolekülen, einer oder mehreren Zellen, Lipiden, Kohlenhydraten, insbesondere in monomerer oder Polysaccharidform, Aminosäuren und/oder Proteinen umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, umfassend einen Schritt v) nach Schritt iii) und vorzugsweise nach Schritt iv), bei dem man mindestens einige der in Schritt iii) gelierten Mikrotröpfchen (14) degeliert, wobei das Verfahren vorzugsweise einen Schritt vi) nach Schritt v) umfasst, bei dem man die degelierten Mikrotröpfchen (14) und/oder die in diesen degelierten Mikrotröpfchen (14) enthaltenen Proben (16) aus der Einfangzone (10) ausleitet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, umfassend einen Schritt nach Schritt iii), bei dem man die Mikrotröpfchen, um die das Öl nicht geliert ist, aus der Einfangzone herausschiebt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Probe (16) um eines aus einer oder mehreren Zellen, insbesondere ein Zellensphäroid, einem oder mehreren Moleküle einfangenden Kügelchen, wobei die Kügelchen insbesondere aus Kunststoffmaterial sind, einem oder mehreren Molekülen handelt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt iii) nach einer Sedimentation der Proben (16), insbesondere der Zellen, in den eingefangenen Mikrotröpfchen (14), insbesondere nach Bildung von Sphäroiden, durchgeführt wird oder wobei Schritt iii) vor einer Sedimentation der Proben (16) in den eingefangenen Mikrotröpfchen (14) durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Einfangzone von einem Mikrofluidik-Chip (10), der die Oberflächenspannungsfallen (12) umfasst, gebildet wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man in Schritt i):

a) in eine Zone stromaufwärts der Einfangzone (10) eine Proben (16) und gegebenenfalls ein Geliermittel enthaltende wässrige Lösung injiziert,

b) ein gegebenenfalls ein Geliermittel enthaltendes Öl in die Zone stromaufwärts der Einfangzone injiziert, um die Proben (16) enthaltende wässrige Lösung zu einem Auslass der Einfangzone (10) zu schieben, wobei die Ölinjektion derart durchgeführt wird, dass sich Proben (16) enthaltende Mikrotröpfchen (14) bilden, und

c) die Mikrotröpfchen (14) bis zur Einfangzone (10) verschoben werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Schritte i) und ii) gleichzeitig in der Einfangzone (10) durchgeführt werden, indem man Folgendes durchführt:

- Füllen der Einfangzone (10) mit Proben (16) und gegebenenfalls ein Geliermittel enthaltender wässriger Lösung, und

- Injizieren von Öl, das gegebenenfalls ein Geliermittel enthält, in die Einfangzone (10), um die Proben (16) enthaltende wässrige Lösung zu einem Auslass der Einfangzone (10) zu schieben, wobei die Oberflächenspannungsfallen (12) dafür ausgelegt sind, das Zerbrechen der Proben (16) enthaltenden Mikrotröpfchen (14) an den Oberflächenspannungsfallen (12) zu ermöglichen.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man in Schritt iii) mindestens eines der Folgenden durchführt:

- Abkühlen oder Erhitzen der Mikrotröpfchen (14) und/oder des Öls,

- Injizieren einer ein chemisches Geliermittel enthaltenden Lösung in die Einfangzone,

- Belichten der Mikrotröpfchen (14) und/oder des Öls mit Licht, das die Gelbildung hervorruft, insbesondere UV-Licht.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Öl ein Tensid enthält, wobei das Verfahren vorzugsweise einen Tensidwaschschritt vor Schritt iv) umfasst.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend vor Schritt i) einen Schritt der Auswahl der Form der Oberflächenspannungsfallen (12) in Abhängigkeit von der gewünschten Form der Mikrotröpfchen (14), wobei vorzugsweise die Einfangzone und die Fallen derart gewählt werden, dass:

- eingefangene Mikrotröpfchen (14) mit flachem Boden gebildet werden, oder

- eingefangene Mikrotröpfchen (14) mit nichtflachem, insbesondere gerundetem, vorzugsweise konvexem Boden gebildet werden.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen Schritt der Anwendung eines Stimulus auf die Proben (16), die in mindestens einem Teil der eingefangenen, gelierten oder ungelierten Mikrotröpfchen (14) enthalten sind.

15. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1, 3 und 4 oder einem der Ansprüche 6 bis 13 in Verbindung mit mindestens Anspruch 1, umfassend:

- eine Proben (16) enthaltende Hydrogel-Lösung,

- Mittel zum Bilden von Mikrotröpfchen (14) der die Proben (16) enthaltenden Hydrogel-Lösung,

- eine Einfangzone, insbesondere einen Mikrofluidik-Chip, zum Einfangen der Mikrotröpfchen (14) an festgelegten Stellen,

- Mittel zum Gelieren mindestens eines Teils der eingefangenen Mikrotröpfchen (14), wobei die Mittel zum Gelieren vorzugsweise eine Vorrichtung zum Injizieren eines chemischen Mittels in die Einfangzone (10) umfassen, und

- optional Mittel zum Degelieren mindestens einiger der gelierten Hydrogel-Mikrotröpfchen (14).

16. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 und 5 oder einem der Ansprüche 6 bis 13 in Verbindung mit mindestens Anspruch 2, umfassend:

- Mittel zum Bilden von Proben (16) enthaltenden Mikrotröpfchen (14),

- eine Einfangzone, insbesondere einen Mikrofluidik-Chip, zum Einfangen der Mikrotröpfchen (14) an festgelegten Stellen, wobei die Einfangzone ein Öl enthält, das ein Geliermittel umfasst,

- Mittel zum Gelieren des Öls, wobei die Mittel zum Gelieren vorzugsweise eine Vorrichtung zum Injizieren eines chemischen Mittels in die Einfangzone (10) umfassen, und

- optional Mittel zum Degelieren mindestens eines Teils des gelierten Öls.

17. Gelierte-Mikrotröpfchen-Produkt, umfassend eine Mikrotröpfcheneinfangzone, insbesondere einen Mikrofluidik-Chip, (10) und in der Einfangzone (10) eingefangene, gelierte Mikrotröpfchen (14), die jeweils eine Probe (16) enthalten,
wobei die gelierten Mikrotröpfchen (14) kryokonserviert sind, es sich bei den Proben (16) vorzugsweise um Säugetierzellen, zum Beispiel Säugetierzellen mit Ausnahme menschlicher Zellen, Bakterien, Hefen oder andere in Bioprozessen verwendete Zellen, Moleküle, Kügelchen mit eingefangenen Molekülen auf der Oberfläche handelt.

18. Mikrotröpfchen-Produkt, umfassend eine Mikrotröpfcheneinfangzone mit einer Mehrzahl von Oberflächenspannungsfallen (12), insbesondere einen Mikrofluidik-Chip, (10) und in den Oberflächenspannungsfallen (10) eingefangene Mikrotröpfchen (14), die jeweils eine Probe (16) enthalten,
wobei die Mikrotröpfchen (14) in einem gelierten Öl schwimmen, die Mikrotröpfchen (14) und das Öl vorzugsweise kryokonserviert sind,
wobei es sich bei den Proben (16) vorzugsweise um Säugetierzellen, zum Beispiel Säugetierzellen mit Ausnahme menschlicher Zellen, Bakterien, Hefen oder andere in Bioprozessen verwendete Zellen, Moleküle, Kügelchen mit eingefangenen Molekülen auf der Oberfläche handelt.

Claims

1. Method for manipulating, in a microfluidic system, microdroplets (14) including samples (16), comprising the steps of:

i) forming, in an oil, microdroplets (14) of an aqueous solution containing a sample (16) where the aqueous solution containing a sample (16) comprises a gelling agent,

ii) trapping the microdroplets (14) by means of surface tension traps (12) pre-arranged in a trapping zone (10), and

(iii) gelling at least a portion of the trapped microdroplets (14),

where the steps of the method are carried out in a single microfluidic system.

2. Method for manipulating, in a microfluidic system, microdroplets (14) including samples (16), comprising the steps of:

i) forming, in an oil, microdroplets (14) of an aqueous solution containing a sample (16) where the oil comprises a gelling agent,

ii) trapping the microdroplets (14) by means of surface tension traps (12) pre-arranged in a trapping zone (10), and

(iii) gelling at least a portion of the oil in the trapping zone (10).

3. Method according to Claim 1, wherein step iii) comprises gelling at least a portion of the microdroplets, the method further comprising the step of:
iv) replacing the oil surrounding the gelled microdroplets (14) with an aqueous solution,
where the aqueous solution replacing the oil contains preferably a biochemical solution, where the biochemical solution comprises preferably at least one of one or more pH or salinity buffers, one or more nutrients, one or more growth factors, cytokines, one or more antibodies, one or more antigens, one or more molecules, especially of medicament, one or more cells, lipids, carbohydrates, especially in monomeric or polysaccharide form, amino acids and/or proteins.

4. Method according to Claim 1 or 3, comprising a step v) subsequent to step iii), and preferably subsequent to step iv), which comprises degelling at least some of the microdroplets (14) gelled in step iii), the method preferably comprising a step vi), subsequent to step v), of discharging the degelled microdroplets (14) and/or the samples (16) contained in these degelled microdroplets (14) out of the trapping zone (10).

5. Method according to Claim 2, comprising a step subsequent to step iii) of driving the microdroplets around which the oil has not gelled out of the trapping zone.

6. Method according to any one of the preceding claims, wherein the sample (16) is one of one or more cells, especially a spheroid of cells, one or more beads trapping molecules, the beads being especially made of plastic, and one or more molecules.

7. Method according to any one of the preceding claims, wherein step iii) is carried out after sedimentation of the samples (16), especially of the cells, in the trapped microdroplets (14), more particularly after formation of spheroids, or wherein step iii) is carried out before sedimentation of the samples (16) in the trapped microdroplets (14).

8. Method according to any one of the preceding claims, wherein the trapping zone is formed by a microfluidic chip (10) comprising the surface tension traps (12).

9. Method according to any one of the preceding claims, wherein step i) comprises:

a) injecting, into a zone upstream of the trapping zone (10), an aqueous solution containing samples (16) and a gelling agent where appropriate,

b) injecting oil, containing a gelling agent where appropriate, into the zone upstream of the trapping zone in order to drive the aqueous solution containing samples (16) towards an outlet of the trapping zone (10), the oil being injected so as to form microdroplets (14) containing samples (16), then

c) moving the microdroplets (14) into the trapping zone (10).

10. Method according to any one of Claims 1 to 5, wherein steps i) and ii) are carried out simultaneously in the trapping zone (10), by carrying out the actions of:

- filling the trapping zone (10) with aqueous solution containing samples (16) and a gelling agent where appropriate, then

- injecting oil, containing a gelling agent where appropriate, into the trapping zone (10) in order to drive the aqueous solution containing samples (16) towards an outlet of the trapping zone (10), the surface tension traps (12) being adapted to enable the breaking of the microdroplets (14) containing samples (16) in the surface tension traps (12).

11. Method according to any of the preceding claims, wherein step iii) comprises at least one of:

- cooling or heating microdroplets (14) and/or the oil,

- injecting a solution containing a chemical gelling agent into the trapping zone,

- exposing the microdroplets (14) and/or the oil to a light causing gelling, especially a UV light.

12. Method according to any one of the preceding claims, wherein the oil contains a surfactant, the method preferably comprising a step of washing the surfactant before step iv).

13. Method according to any one of the preceding claims, comprising a step, prior to step i), of choosing the shape of the surface tension traps (12) as a function of the desired shape of the microdroplets (14), where the trapping zone and traps are preferably chosen to:

- form trapped microdroplets (14) with a flat bottom, or

- form trapped microdroplets (14) with a non-flat, especially curved, preferably convex bottom.

14. Method according to any one of the preceding claims, comprising a step of applying a stimulus to the samples (16) contained in at least a portion of the trapped, gelled or ungelled, microdroplets (14).

15. Device for implementing a method according to any of Claims 1, 3 and 4 or any one of Claims 6 to 13 in combination with at least Claim 1, comprising:

- a hydrogel solution containing samples (16),

- means for forming microdroplets (14) of hydrogel solution containing samples (16),

- a trapping zone, especially a microfluidic chip, for trapping the microdroplets (14) at predetermined locations,

- means for gelling at least a portion of the trapped microdroplets (14), the gelling means preferably comprising a device for injecting a chemical agent into the trapping zone (10), and

- optionally means for degelling at least some of the gelled hydrogel microdroplets (14).

16. Device for implementing a method according to any of Claims 1 and 5 or any one of Claims 6 to 13 in combination with at least Claim 2, comprising:

- means for forming microdroplets (14) containing samples (16),

- a trapping zone, especially a microfluidic chip, for trapping the microdroplets (14) at predetermined locations, where the trapping zone contains an oil comprising a gelling agent,

- means for gelling the oil, where the gelling means preferably comprise a device for injecting a chemical agent into the trapping zone (10), and

- optionally means for degelling at least a portion of the gelled oil.

17. Product of gelled microdroplets, comprising a zone for trapping microdroplets, more particularly a microfluidic chip (10), and gelled microdroplets (14) each including a sample (16) and trapped in the trapping zone (10),
where the gelled microdroplets (14) are cryopreserved, the samples (16) being preferably mammalian cells, for example cells from mammals with the exception of human cells, bacteria, yeasts or other cells used in bioprocesses, molecules, or beads trapping molecules at the surface.

18. Product of microdroplets, comprising a zone for trapping microdroplets, having a plurality of surface tension traps (12), more particularly a microfluidic chip (10), and microdroplets (14) each including a sample (16) and trapped in the surface tension traps (10),
where the microdroplets (14) are immersed in a gelled oil, the microdroplets (14) and the gelled oil preferably being cryopreserved,
the samples (16) being preferably mammalian cells, for example cells from mammals with the exception of human cells, bacteria, yeasts or other cells used in bioprocesses, molecules, or beads trapping molecules at the surface.

Dessins