Antikonzeptionsmittel enthaltend ein Peptid

Abstract

 Die Verwendung von LHRH-Peptidderivaten in denen in 6-Stellung D-Serin-tert. butyläther oder D-Glutaminsäure - cyclohexylamid enthalten ist, als Antikonzeptiva bei wiederholter täglicher Dosierung, während die gleichen Verbindungen, wie in der DOS 2 438 350 beschrieben, nach einmaliger Gabe die umgekehrte Wirkung haben, d.h. die Ausschüttung von Gonadotropinen aus dem Hypophysen - Vorderiappen bewirken..

Beschreibung

[0001] Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Peptiden der allgemeinen Formel I

in der X für D-Serin-tert-butyläther (la) oder D-Glutaminsdure-γ-cyelohexylamid (Ib) steht, als Antikonzeptiva.

[0002] Die Verbindungen der Formel I werden gemäß DOS 2 438 350 bzw. der älteren Anmeldung P 26 17 646.5 hergestellt. Sie bewirken nach einmaliger Gabe in Dosierungen von 1.4-20 meg (das entspricht 20-300 ng/kg) intravenös (i.v.) subcutan (s.c.) oder intramuskulär (i.m.) bzw. 50-1000 mcg (das entspricht 100-5000 ng/kg) intranasal (i.n.) bei Versuchspersonen die Ausschüttung von Gonadotropinen aus dem Hypophysen-Vorderlappen.

[0003] Es wurde nun gefunden, daß bei wiederholter täglicher Dosierung über mindestens 4 Tage von mehr als 2.5 mcg i.v., s.e. oder i.m. (Tagesdosis) bzw. mehr als etwa 100 mcg i.n. die Wirkung sich nicht verstärkt, sondern überraschenderweise umkehrt, sodaß bei entsprechender Dosierung diese Verbindungen als Antikonzeptiva verwendet werden können.

[0004] Die Dosierung beträgt z.B. für die Verbindung Ia täglich 3 x 5 meg s.e., i.v. oder i.m., kann aber unbedenklich auf das Vielfache gesteigert werden, da die erfindungsgemäßen Peptide untoxisch sind. In praxi bewegt man sich zwischen 5-500 mcg täglich. Bei intranasaler Anwendung muß diese Dosis wegen der Resorption von nur ca. 1 % auf das etwa Hundertfache angehoben werden.

[0005] Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beim Mann zur temporären Unterdrückung der Testosteronproduktion und damit Spermatogenese verwendet werden, bei der Frau zur Unterdrückung der Ovulation. Die Applikation bei der Frau beginnt z.B. am ersten Cyclustag und wird jeweils etwa 14 Tage fortgesetzt. Auf diese Weise wird die Ovulation während des Behandlungszeitraumes mit Sicherheit verhindert. Der LH-Spiegel sinkt auf Basalwerte, und eine Stimulierung der Hypophyse ist nicht mmhr möglich. Bei kurzzeitiger Behandlung kann somit die Ovulation verschoben werden bei längerer Behandlung wird sie unterdrückt. Letzteres gilt ggf. auch für die Nidation, da beide Vorgänge von der Höhe des FSH- und LH-Spiegel abhängen.

[0006] Bisher war versucht worden, die LH- und FSH-Ausschüttung durch Anwendung kompetitiver Hemmer des LH-RH zu unterdrücken. Das gelang aber nur unzureichend und mit Konzentrationen, die um das etwa Tausendfache höher liegen als die der erfindungsgemäßen Verbindungen.

[0007] Zudem entfallen die z.B. bei steroidhaltigen Kontrazeptiva zu berücksichtigenden Rückstands- und Metabolismusproblers. Die erfindungsgemäß verwendeten Zubereitungen enthalten Poptide, die im Körper leicht zu Aminosäuren abgebaut und ausgeschieden oder über diese Aminsoäuren in physiologischer Weise metabolisiert werden.

[0008] Verbindungen der Formel I können zur erfindungsgemäßen Verwendung z.B. in physiologischer Kochsalzlösung intravenös intramuskulär oder subkutan appliziert werden. Als medizinisch besonders wertvolle Anwendungsform eignen sich insbesondere für Dauerbehandlung wäßrige oder ölige Zubereitungen zur intranasalen Applikation. In Form einer Zubereitung als Zäpfchen ist auch rektale oder vaginale Anwendung möglich.

a) Beobachtung an Männern

[0009] 3 Männer im Alter von 30 - 55 Jahren erhielten 10 Tage lang täglich 50 meg Verbindung Ia subkutan in wäßriger Zubereitung. Die Testosteronspiegel wurden durch Radioimmunoassay gemessen. Es fand sich eine Senkung der Testosteronspiegel im Plasma auf ca. 1/3 des Ausgangswertes. 6 Wochen nach Absetzen der Behandlung wurden die Testosteronspiegel erneut gemessen. Sie hatten wieder ihren normalen Wert erreicht.

[0010] Dieselben Ergebnisse wurden erhalten, wenn 10 Tage lang täglich 2 mg in öliger Zubereitung intranasal verabreicht wurden.

b) Beobachtung an Frauen

[0011] 4 Frauen im Alter von 22 - 30 Jahren erhielten täglich 3 x 5 mcg Verbindung Ia subkutan in wäßriger Zubereitung ab Zyklusbeginn. Wenige Tage nach Behandlung waren die Plasmaspiegel an luteinisierenden und follikeJstimulierendem Hormon auf Basalwerte abgesunken und eine Stimulierung der Hypophyse trat nicht mehr ein.

[0012] Bei kurzzeitiger- Behandlung wurde die Ovulation verschoben, während sie bei längerer Behandlung gans unterdrückt wurde.

c) Beobachtung an Tieren

[0013] 2 Gruppen von je 5 geschlechtsreifen, reinrassigen Beagle-Rüden, Gewicht 6-8 kg, erhielten 1 x täglich 2.5 mcg/kg Verbindung Ia in isotonischer Kochsalzlösung subkutan verabreicht. Die Testosteronspiegel sanken bereits nach 1 Monat auf 30 % des Ausgangswerts, nach 3 Monaten auf 6 % des Ausgangswertes ab.

[0014] Die Behandlung wurde 6 Monate fortgesetzt. Im Verlauf der Behandlung trat deutlichte Hodenathrophie auf, jedoch stieg 8 Wochen nach Absetzen der Behandlung die Hodengröße wieder deutlich an, und die Tiere zeigten einen normalen Geschlechtstrieb.

[0015] In den folgenden Beispielen wird die Zubereitung entsprechender Präparate beschrieben.

Beispiel 1

[0016] 500 mg Verbindung Ia werden in 100 Liter physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Man filtriert steril und füllt in Ampullen zu je 1 ml ab. Diese Zubereitung kann zur intravenösen, intrasmuskulären oder subkutanen Verabreichung der Verbindung Ia oder ganz allgemein einer Verbindung der allgemeinen Formel I dienen.

Beispiel 2

[0017] 600 mg Verbindung Ib werden in 100 1 isotonischer wäßriger Mannitlösung gelöst und wie in Beispiel 1 weiterbehandelt. Die ampullierte Lösung wird gefriergetrocknet zum Gebrauch wieder in 1 ml dest. Wasser gelöst.

Beispiel 3

[0018] 9 1 dest. Wasser werden zum Sieden erhitzt und darin 20 g 4-Hydroxybenzoesäure-methylester gelöst. Man kühlt auf ca. - 30°C, gibt 89.6 g Na₂HFO₄, 13.5 g Citronensäure, 10 g Natriumchlorid und 250 g Mannit zu und löst dann darin 100 g Verbindung Ia. Dann füllt man mit dest. Wasser auf 10 1 auf und filtriert.

[0019] 1 ml Lösung wird z.B. in einen Behälter gefüllt, der mit einem Entnahme-Dosierventil versehen ist, das pro Applikation 0.05 ml der Lösung freigibt.

Beispiel 4

[0020] 10 g Benzylalkohol werden mit 2-Octyldodekanol auf 0.990 1 aufgefüllt. Dazu gibt man 10 g mikrofein gemahlene Verbindung Ia und homogenisiert.

[0021] 1_-2 ml dieser Suspension werden in kleine Behälter abgefüllt. Die Behälter sind mit einem Entnahmeventil versehen, das pro Applikation 0.05 ml der Suspension freigibt.

Beispiel 5

[0022] 2 kg handelsüblicher Suppositorienmassen wird auf ca. 60°C erwärmt. Man versetzt mit 2 g mikrofein gemahlener Verbindung Ia und homogenisiert. Die Masse wird in Formen gegossen, die nach dem Erkalten Suppositorien im Gewicht von jeweils 2 g freigeben.

Beispiel 6

[0023] 

a) Z-D-Gln (cyclohexyl)-OBzl

[0024] Zu einer Lösung von 12.3 g (33.1 mmol) Z-D-Glu-OBzl, 4.06 ml (33.1 mmol) Cyclohexylamin und 4.47 g 1-Hydroxybenzotriazol (33.1 mmol) in 50 ml abs. Tetrah'ydrofu- ran gibt man bei 0°C 7.35 g DCC zu, läßt 2 h bei 0⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Anderntags wird der Niederschlag abgesaugt, man wäscht mit Tetrahydrofuran nach und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung verrieben, abgesäugt und gut mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausb. 14.5 g, Schmp. 105°C. Nach Umkristallisation aus Isopropanol/Petroläther: 6 g Schmp. 163°,

(c = 1, in Eisessig)

6 g Z-D-Gln (cyclohexyl)-OBzl werden in 100 ml Dioxan/ Wasser (4:1) suspendiert und mit 1n NaOH titriert (Thymolphthalein als Indikator, Verbrauch: 14 ml 1n NaOH). Anschließend wird mit 1n HC1 neutralisiert und i. Vak. eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 1n HC1 verteilt. Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Ausb. 4.3 g Schmp. 112 - 175⁰,

= + 6.2° (c = 1, in Methanol)

[0025] Zu einer Lösung von 1.89 g (5 mmol) Z-D-Gln(cyclohexyl)-OH, 3.6 g (5 mmol) H-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-ditosylat und 1.35 g (10 mmol) 1-Hydroxybenzotriazol in 20 ml Dimethylformamid gibt man bei 0°C 1.3 ml N-Äthylmorpholin und 1.1 g DCC. Man läßt 1 h bei 0°C rühren und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Das Reaktionsprodukt fällt zusammen mit dem Dicyclohexylharnstoff aus. Die Reaktionsmischung wird mit Äther versetzt und der Niederschlag abgesaugt. Der Filterkuchen wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung verrieben und abgesaugt. Ausb. 3.2 g amorphe Masse, die in Methanol mit Pd-Katalysator analog Beispiel 1d katalytisch hydriert wird. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausb. 2.2 g einer amorphen Masse, die ohne weitere Reinigung mit 1.5 g Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH und 405 mg 1-Hydroxybenzotriazol in wenig Dimethylformamid gelöst wird. Zu dieser Lösung gibt man 0,78 ml N-Äthylmorpholin und bei 0°C 660 mg DDC. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit gesättigter NaHC0₃-Lösung verrieben, abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Ausb. 2.6 g einer amorphen Masse, die ohne Reinigung in einer Mischung aus Dimethylformamid und Methanol (1:1) katalytisch hydriert wird. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und anschließend verteilungschromatographisch gereinigt. Ausb. 420 mg einer dünnschichtchromatographisch einheitlichen, ninhydringpositiven Verbindung mit korrekter Aminosäureanalyse. (Laufmittel 1).

diacetat

[0026] 215 mg Glu-His-Trp-NH-NH₂ werden analog Beispiel 1f mit 420 mg H-Ser-Tyr-D-Gln(cyclohexyl)-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅'2HCl umgesetzt und in das Acetat überführt. Gereinigt wird die Verbindung durch Gradientenelution an einer Carboxymethylcellulose-Säule (11 x 1.5 em) mit 0.002 - 0.01 n Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel. Isoliert wurden 128.3 mg dünnschichtchromatographisch reines Produkt (Laufmittel 1). Gehalt an Peptidbase lt. UV-Spektrum und Aminosäureanalyse 80 %. Der Rest ist "asser (10 %) und Essigsäure (10 %).

= - 33.4° (c = 1, in Wasser).

[0027] Aminosäureanalyse (Hydrolyse 68 h in 6n HCl bei 110°C): Ser (0.7), Glu (2.0), Pro (0.9), Leu (1.0), Tyr (0.9), His (1.0), Arg (1.0). Der Trp-Gehalt wird durch die UV-Extinktion ermittelt (1.0).

Ansprüche

Verwendung von Peptiden der allgemeinen Formel I

in der X für D-Serin-tert-butyläther oder D-Glutaminsäure-γ-cyclohexylamid steht, als Anitikonseptive.