Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung von Tabak, bei dem zunächst unlösliche Proteinbestandteile und Proteinuntereinheiten durch Behandlung mit proteolytischen Enzymen in lösliche Proteinfragmente zerlegt werden und dann die löslichen Bestandteile in Wasser gelöst werden und die gewonnene Lösung vom behandelten Tabak abgetrennt wird und Tabak, aufbereitet nach diesem Verfahren.

Bei einem aus der US-PS 3 132 651 bekannten Verfahren, bei dem durch Enzyme der Alterungsprozeß - sogenanntes aging - beschleunigt und Nikotin entfernt werden soll, werden aus dem Tabak Proteinbestandteile zusammen mit löslichen Inhaltsstoffen des Tabaks extrahiert. Man gewinnt so einen aufbereiteten Tabak, in dem zwar die Proteinbestandteile, die dort unerwünscht sind, fehlen, der aber außerdem viele seiner löslichen Inhaltsstoffe entbehrt und damit nur noch ein kaum genießbares Tabakprodukt ist.

Aus LU-A 64076 ist es bekannt, die Tabakfermentation durch Zugabe proteolytischer Enzyme zu beschleunigen oder zu verbessern. Proteine werden dabei zerkleinert aber nicht entfernt.

Aus EP-A 0 024152 ist es bekannt, Nitrat, Nitrit und Ammoniumverbindungen aus einem Tabakextrakt zu entfernen. Dazu werden aber keine Enzyme eingesetzt. Da nur ein kleiner Teil der im getrockneten Tabak enthaltenen Proteine wasserlöslich ist, wird bei der anschließenden Extraktion nur dieser kleine Teil der Proteine aus dem Tabak entfernt.

Dem erfinderischen Verfahren liegt die Aufgabe zugrunde, einen aufbereiteten Tabak zu erzielen, dessen Gehalt an Proteinbestandteilen und deren Untereinheiten erheblich reduziert ist, dessen Gehalt an übrigen löslichen Bestandteilen jedoch möglichst nicht reduziert ist.

Das erfinderische Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß auf die abgetrennte Lösung Mikroorganismen angewendet werden, die Proteinbestandteile, Proteinuntereinheiten und niedermolekulare Stickstoffverbindungen metabolisch assimilieren können und daß die Proteinbestandteile, Proteinuntereinheiten und niedermolekularen Stickstoffverbindungen in die Biomasse durch die metabolische Assimilation überführt werden, daß die Biomasse von der Restlösung abgetrennt wird und daß die in der Restlösung verbleibenden Lösungsbestandteile vorbehandeltem Tabak zugesetzt werden.

Durch die metabolische Assimilation gelangen die unerwünschten Proteinbestandteile und deren Untereinheiten sowie niedermolekulare Stickstoffverbindungen, wie Amine, Ammoniak, Nitrat und, falls vorhanden, Nitrit in die Biomasse, während die übrigen löslichen Bestandteile, die aus dem Tabak herausgelöst wurden, im wesentlichen in der Restlösung verbleiben und dem Tabak gegebenenfalls nach Einengung der Restlösung wieder zugesetzt werden können.

Im grünen Tabak sind die meisten Proteinbestandteile löslich, so daß man sie ohne enzymatische Behandlung herauslösen könnte. Das empfiehlt sich aber nicht, weil dann diese Proteinbestandteile nicht mehr bei der Trocknung, dem sogenannten curing, zur Verfühgung stehen, bei der sie eine wichtige Funktion übernehmen. Beim Trocknen jedoch wird ein Großteil der ursprünglich löslichen Proteinbestandteile denaturiert zu unlöslichen Proteinuntereinheiten. Diese können dann aber nach dem erfinderischen Verfahren durch die vorgesehene enzymatische Vorbehandlung größtenteils wieder löslich gemacht werden.

Die enzymatische Behandlung erfolgt zweckmäßig in einer Mischung aus zerkleinertem Tabak und Wasser im Gewichtsverhältnis 1 : 3 bis 1 : 12, vorzugsweise 1 : 5. Dabei kann man zerkleinerten, getrockneten, grünen Tabak oder zur Wiederaufbereitung zerkleinerte Tabakabfälle einsetzen. Wenn man den Tabak pulverisiert einsetzt, genügt ein Gewichtsverhältnis von Tabak zu Wasser von 1 : 3 bis 1 : 5. Die enzymatische Behandlung in einer Aufschlämmung ist vorteilhaft, weil dadurch eine intensive Einwirkung des Enzyms auf die Proteinbestandteile und Proteinuntereinheiten begünstigt wird. Wenn man dagegen ganze Tabakblätter oder Strips - das sind entrippte Tabakblätter - einsetzt, benötigt man ein Gewichtsverhältnis von Tabak zu Wasser von 1 :8 bis 1 12, vorzugsweise 1 : 10. Die optimalen Bedingungen bei enzymatischer Behandlung hinsichtlich des Tabak-Wasser-Verhältnisses, des pH-Wertes, der Lösung und der Behandlungstemperatur hängen von dem jeweils eingesetzten Enzym ab. Man findet sie gegebenenfalls durch Probieren. Die optimale Behandlungstemperatur bei den meisten Enzymen liegt im Bereich zwischen 30 °C (Grad Celsius) und 70 °C. Viele Enzyme, auch die Proteasen, haben ein Optimum bei 37 °C. Daneben gibt es aber auch Proteasen, die bei wesentlich höheren Temperaturen am aktivsten sind, zum Beispiel Waschmittelenzyme. Der optimale pH-Wert liegt für viele Enzyme im Bereich zwischen pH 7,0 un pH 7,5. Eine Ausnahme bilden jedoch die sauren Proteasen, zum Beispiel Pepsin, deren pH-Optimum zwischen 1,5 und 5 liegt. Der optimale pH-Wert wird vorzugsweise mit 1 N KOH (1 normale Kaliumhydroxydlösung) oder 85 %iger H₃P0₄ (Phosphorsäure) eingestellt.

Vorzugsweise wird das Enzym mit einer Konzentration eingesetzt, die so groß gewählt ist, daß bei für das eingesetzte, aktive Enzym optimaler Behandlungstemperatur im Bereich zwischen 30 °C und 70 °C, optimalem pH-Wert und unter ständigem Umrühren ehe das Enzym 9/10 seiner ursprünglichen Aktivität verloren hat, der Gehalt des Tabaks an unlöslichen Proteinstoffen und Proteinuntereinheiten auf 20 bis 40 % (Prozent), vorzugsweise 33 %, des Ausgangswertes reduziert.

Erreicht man bis zu dem angegebenen Enzymabbau die angestrebte Proteinreduktion nicht, dann wird zweckmäßig eine höhere Enzymkonzentration eingesetzt; erreicht man die angestrebte Proteinreduktion schon ehe der angegebene Enzymabbau stattgefunden hat, dann war die Enzymkonzentration unnötig hoch angesetzt und man kann sie für spätere Chargen reduzieren. So findet man durch Probieren leicht die für das jeweils eingesetzte Enzym vorteilhafte Konzentration. Man kann bei so als optimal ermittelten Enzymkonzentrationen die Proteinreduktion weniger weit treiben, indem man die Behandlung vorzeitig abbricht. Dann hat man aber das Enzym nicht ausgenutzt.

Geeignete Enzyme mit proteolytischer Aktivität sind bekannt und werden auf dem Markt angeboten. Von den so angebotenen Enzymen wählt man vorläufig diejenigen aus, von denen bekannt ist oder vermutet werden kann, daß sie in der Lage sind, den hier geforderten Abbau zu leisten, nämlich unlösliche Proteinbestandteile und Proteinuntereinheiten des Tabaks in lösliche Proteinfragmente zu zerlegen. Bei dieser Vorauswahl beschränkt man sich zweckmäßig auf solche Enzyme, die zu kommerziell günstigen Bedingungen bereitgestellt sind. Aus den vorausgewählten Enzymen findet man durch Probieren solche Enzyme, die besonders gut für dieses Verfahren geeignet sind.

Eine Auswahl gut geeigneter Enzyme ist in Tabelle 1 am Schluß der Beschreibung angegeben.

Für die metabolische Assimilation wird zweckmäßig die abgetrennte Lösung sterilisiert und dann mit einer in ihre exponentielle Wachstumsphase versetzten Kultur von Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Proteine und Proteinuntereinheiten zu assimilieren, angeimpft und unter Zugabe von Zucker auf günstigen Lebensbedingungen hinsichtlich Energieversorgung, Temperatur, Belüftung und pH-Wert für diese Kultur gehalten, bis die gelösten Proteinfragmente und anderen niedermolekularen Stickstoffverbindungen zu mindestens 95% als Aufbaustoffe für das zelleigene Protein der Mikroorganismen verbraucht sind, und dann die metabolische Assimilation abgebrochen durch Abtrennen der Biomasse.

Durch die Sterilisation und den Einsatz in exponentieller Wachstumsphase wird sichergestellt, daß die ausgewählte Kultur selektiv tätig ist und nicht durch andere Mikroorganismen verseucht wird. Durch den Abbruch der metabolischen Assimilation wird sichergestellt, daß nur die erwünschten Reaktionen hervorgerufen werden.

Wenn hier und im folgenden davon gesprochen wird, daß dem Tabak Substanzen extrahiert werden und andere Substanzen daraus wieder zugesetzt werden, dann muß das sich nicht unbedingt auf die gleiche Tabakcharge beziehen. Man kann einer ersten Tabakcharge Substanzen entziehen und die wieder zuzusetzenden Substanzen einer zweiten Tabakcharge, die vorher einer entsprechenden Extraktion unterzogen wurde, wieder zusetzen.

Mit dem erfinderischen Verfahren ist ein aufbereiteter, als Rauchprodukt geeigneter Tabak erzielbar, der gekennzeichnet ist durch einen Proteingehalt von 2 bis 10, vorzugsweise 3, Trockengewichtsprozent und einen Amadoriverbindungsgehalt von 0,1 bis 10, vorzugsweise 5,0, Trockengewichtsprozent. Bei den Amadoriverbindungen handelt es sich um diejenigen, die beim thermischen Zerfall Tabakaromen freisetzen.

Zigaretten, die aus solchem Tabak hergestellt wurden, ergaben die in Tabelle 2 am Schluß der Beschreibung angegebenen Analysewerte.

Die Erfindung wird nun anhand einiger Beispiele näher erläutert.

In 10 I (Liter) Wasser wurden 3,75g (Gramm) des Enzyms Protease EC 3.4.24.4 mit einer Enzymaktivität von 1,0 Enzymeinheit pro mg (Milligramm) gelöst. Eine Enzymeinheit ist diejenige Aktivität, die Casein bei pH 7,5 und 37 °C (Grad Celsius) dermaßen hydrolisiert, daß pro Minute die Menge von 1 Mykromol Tyrosin freigesetzt wird. In diese 10 1 Enzymlösung wurden 1 kg (Kilogramm) aufzubereitende Tabakmischung (American Blend) in Form von sogenannten Strips (entrippte Blätter) eingeschlämmt. Diese Schlämme wurde 6 Stunden bei 37 °C stehengelassen und dabei gelegentlich umgerührt. Dann wurde die wässrige Phase von den .Strips abgetrennt und danach wurden die Strips zweimal mit je 2,5 I Wasser von 80 °C gewaschen und anschließend ausgepreßt. Die wässrige Phase, das Waschwasser und die beim Auspressen anfallende Flüssigkeit wurde zur Lösung vereinigt. Es ergaben sich insgesamt 121 Lösung.

Der vorbehandelte Tabak, das sind die ausgepreßten Strips, wurde in strömender Warmluft bis auf eine Restfeuchte von 18 % (Prozent) getrocknet und aufbewahrt. Die aufzubereitende Tabakmischung, die Lösung und der vorbehandelte Tabak wurden analytisch untersucht. Es ergaben sich dabei Analysenwerte wie in Tabelle 3 angegeben.

Die Tabelle 3 zeigt, daß 58 Trockengewichtsprozent der in der aufzubereitenden, eingesetzten Tabakmischung vorhandenen Proteine abgebaut worden sind und Abbauprodukte in die Lösung überführt wurden.

In die 12 I Lösung wurden folgende Zusätze eingegeben :

Die so aufbereitete Lösung wurde in einem Autoklaven bei 105 °C unter Druck sterilisiert und dann druckentlastet und auf 30 °C abgekühlt und in einen 20 I Fermenter überführt. Die 30 °C warme, aufbereitete Lösung wurde mit 600 ml (Milliliter) einer sich in ihrer exponentiellen Wachstumsphase befindenden Kultur von Candida utilis NCYC 707 angeimpft. Die angeimpfte Lösung wurde 8 Stunden lang unter Belüftung und laufendem Umrühren im Fermenter belassen. Der pH-Wert wurde zunächst mit KOH (Kaliumhydroxyd) und später mit Zitronensäure auf pH 5,5 stabilisiert. Dabei wurden die Proteine, Aminosäuren, Nitrate und Nitrite durch metabolische Assimilation abgebaut. Nach Ablauf der 8 Stunden wurde die Biomasse abzentrifugiert. Man erhielt 2,25 I Biomasse mit einem Feststoffgehalt von 16 %, entsprechend 360 g wasserfreier Biomasse.

Der durch das Zentrifugieren gewonnene Überstand - die sogenannte Restlösung - enthielt die Tabakalkaloide in der ursprünglich vorhandenen Konzentration, darüberhinaus aber nur noch Spuren an löslichen Stickstoffverbindungen. Das Gesamtvolumen der Restlösung betrug 9,75 I, die bis zur späteren Weiterverwendung bei 20 °C aufbewahrt wurden.

Die abfiltrierte Biomasse wurde mit 1 1 6N Salzsaüre 15 Stunden in einem Rundkolben unter Rückfluß gekocht. Dabei zerfiel die Biomasse und die Proteine wurden destruktiv hydrolisiert, wobei die Aminosäure Tryptophan so weitgehend zerstört wurde, daß sie analytisch nach der Hydrolyse nicht mehr nachweisbar war.

Das Hydrolysat wurde von den Rückständen der Biomasse durch Filtrieren getrennt, wobei die überschüssige Salzäure entwich. Der Trockenrückstand, der zu einem großen Teil aus Aminosäuren bestand, wurde mit 100 ml Wasser angerührt und vom unlöslichen Rückstand abfiltriert. Man erhielt ein Aminosäurengemisch mit einem Wassergehalt von etwa 50 %.

Dieses Aminosäurengemisch wurde mit NH₄0H (Ammoniumhydroxyd) auf pH 7 eingestellt und mit 100 g Glukose versetzt und 2 Stunden unter Rückfluß in einem Rundkolben gekocht, wobei sich der Rundkolben bräunte und Amadoriverbindungen gebildet wurden. Der noch heiße Kolbeninhalt wurde mit der vorher gewonnenen Restlösung ausgewaschen, so daß die löslichen Amadoriverbindungen in die Restlösung übergingen.

Die so gewonnene, nun mit Amadoriverbindungen angereicherte Restlösung wurde auf den vorbehandelten Tabak, also die ausgepreßten Strips, in einer rotierenden Flavourtrommel aufgesprüht, wobei während des Sprühens das überschüssige Wasser durch Einblasen von Warmluft abgedampft wurde.

Der so gewonnene, aufbereitete Tabak hatte beziehungsweise entfaltete sein volles ursprüngliches Aroma und enthielt Alkaloidstickstoff, das heißt Nikotin, in der ursprünglichen Konzentration. Dagegen war der Gehalt an Proteinstickstoff um 58 % und der Gehalt an Amin-, Ammoniak- und Nitratstickstoff um 90 % gegenüber den ursprünglichen Gehältern im eingesetzten Tabak reduziert.

Diese Beispiele unterscheiden sich vom Beispiel 1 nur durch die aus Tabelle 4 ersichtlichen Sachverhalte.

In den Beispielen 1 bis 22 wurden als Mikroorganismen die Candida utilis NCYC 707 eingesetzt. Weitere Mikroorganismen, die die Fähigkeit besitzen, Proteine und Proteinuntereinheiten zu assimilieren, und die anstelle der Candida utilis NCYC 707 einsetzbar sind, sind in Tabelle 5 angegeben.