Wasserlösliche Peptide sehr schwer löslicher Aminosäuren

Abstract

 Tripeptide, die durch Anlagerung von 2 Mol der an sich wasserunlöslichen Aminosäuren Tyrosin und Cystin an die beiden Aminogruppen des Lysins erhalten werden, sind wasserlösliche Verbindungen die, im Organismus durch Peptid-Hydrolasen gespalten werden. Sie sind bei oraler Anwendung leicht resorbierbar oder können in Infusionslösungen gelöst parenteral appliziert werden.

Beschreibung

[0001] Die Aminosäuren sind Bestandteile des Eiweißes. Sie werden dem Organismus u.a. durch eiweißhaltige Nahrung zugeführt und daraus im Magen-Darm-Trakt durch die Wirkung der Verdauungsenzyme freigelegt und dann resorbiert. Beim Ausfall oder bei Insuffizienz dieser Enzyme oder bei stark geschwächten Patienten, ferner in Situationen, bei denen der Abbau von körpereigenem Protein den Aufbau überwiegt, weiterhin im Falle von spezifischen Krankheitsbildern, z.B. chronischem Nierenversagen oder Leberinsuffizienz, welche hochgradige und weit über das Normalmaß hinausgehende Supplementation mit essentiellen Aminosäuren in geeigneten Proportionen erfordert, müssen die freien Aminosäuren mittels entsprechender Präparate oral zugeführt werden, um zum Aufbau körpereigenen Eiweißes unmittelbar zur Verfügung zu stehen.

[0002] In vielen Fällen schwerer Erkrankung ist die Ernährung auf oralem Wege-- nicht oder nur schwer möglich. Insbesondere bei postoperativen und posttraumatischen Zuständen und in schweren Fällen von Karzinomen, Verbrennungen, Infektionen, akutem und chronischen Nierenversagen, Leberinsuffizienz, sowie langanhaltender Bewußtlosigkeit oder schweren Stoffwechselstörungen müssen die Patienten dann parenteral mit Infusionslösungen ernährt werden, wobei zur Aufrechterhaltung der Ernährung dem Organismus neben Kohlenhydraten und Fett insbesondere auch Aminosäuren parenteral zugeführt werden müssen. Wegen der negativen Stickstoffbilanz, besonders bei postoperativer und posttraumatischer Stoffwechsellage, ist die Versorgung mit Aminosäuren von besonderer Bedeutung, wobei das Angebot nicht nur die essentiellen Aminosäuren umfassen soll, die der Organismus nicht selbst synthetisieren kann, sondern auch die anderen Aminosäuren, damit der Verlust an körpereigenen Proteinen möglichst schnell durch erneuten Aufbau dieser Proteine wieder ausgeglichen werden kann.

[0003] Zu den wichtigen Aminosäuren, die hierbei dem Organismus zur Verfügung gestellt werden, gehören u.a. auch die in Wasser nur sehr schwer löslichen Aminosäuren Tyrosin, deren Zufuhr essentiell ist bei Nierenversagen, und Cystin, das essentiell ist bei Neugeborenen und Säuglingen. Wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit ist die Bioverfügbarkeit dieser Aminosäuren nur gering. In Aminosäure-Infusionslösungen sind sie ebenfalls aus diesen Gründen nicht oder nur in sehr geringer Menge vorhanden und applizierbar.

[0004] Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß durch eine Bindung dieser schwerlöslichen Aminosäuren an die beiden Aminogruppen der Aminosäure Lysin sich Tripeptide herstellen lassen, die trotz des Gehalts dieser beiden Aminosäuren im Verhältnis 2 : 1 Mol Lysin dennoch eine gute Wasserlöslichkeit aufweisen. Die Aminosäure Lysin besitzt außer der primären Aminogruppe in AC-Stellung noch am endständigen C-Atom, d.h. inf-Stellung, eine zweite primäre Aminogruppe, die substituierbar ist. An diese beiden Aminogruppen sind bei den neuartigen Tripeptiden der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 jeweils Tyrosin-oder Cystin-Reste peptidartig gebunden. Während das Tyrosin nur eine Löslichkeit von 0,384 g/L H₂0 aufweist, beträgt die Löslichkeit des N²-Tyrosinyl-N⁶-ytyrosinyl-lysins 622 g/L H₂O. Das Tripeptid ist somit um den Faktor 1,62 . 10³besser löslich in Wasser als das freie Tyrosin.

[0005] Die oral oder parenteral applizierten wasserlöslichen Tripeptide der schwer löslichen Aminosäuren mit dem Lysin besitzen die Eigenschaft, daß sie im Organismus durch körpereigene Aminopeptidasen, wie Peptidhydrolasen, gespalten werden, so daß mit dieser Applikation die schwer löslichen Aminosäuren dem Organismus leicht zum Aufbau körpereigener Proteine in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden können, wobei ihm gleichzeitig auch noch die essentielle Aminosäure Lysin zugeführt wird. Beim erfindungsgemäß verwendeten N²-Cystinyl-N⁶-cystinyl-lysin werden dem Lysin sogar vier Mole Cystein bereitgestellt, da das freigelegte Cystin bekanntlich durch hydrierende Enzyme an der Disulfidbrücke in 2 Mole Cystein gespalten wird. Dies ist inbesondere wichtig für Neugeborene und Säuglinge, weil für diese Patientengruppe Cystin/Cystein essentiell ist. Daher kann diese schwe-_- felhaltige Aminosäure, die einen wichtigen Baustein der Keratine in Haut, Haaren und Nägeln darstellt, und zur Vernetzung der linearen Eiweißmoleküle beiträgt, in ausreichender Menge als leicht resorbierbares Derivat zur Verfügung gestellt werden.

[0006] Im allgemeinen werden die erfindungsmäßen Peptide dem Organismus zusammen mit anderen Aminosäuren und gegebenenfalls anderen niederen Peptiden mittels Infusionslösung appliziert. Das _N² -Cystinyl-N⁶-cystinyl-lysin kann hierbei in einer Menge von 0,1 - 10 g je Liter, das N ²-Tyrosinyl-N⁶-tyrosinyl-lysin in einer Menge von 0,1 - 20 g je Liter Infusionslösung enthalten sein.

[0007] Durch Auflösen der gereinigten Peptide und der gewünschten Aminosäuren in Aqua dest. werden diese Infusionslösungen erhalten, die gegebenenfalls noch Mineralsalze und andere Stoffe für die parenterale Ernährung aufweisen können und sich leicht isotonisch einstellen lassen. Die Lösungen können in üblicher Weise hitzesterilisiert werden, (z.B. 0,5 h, 120°C, pH = 5,5 - 7,5), ohne Gefahr einer Veränderung der neuartigen Tripeptide, da diese sehr hitzestabil sind. Im Falle der Verwendung zusammen mit Glucose oder anderen Kohlenhydraten in Infusionslösungen für parenterale Ernährung sind diese jedoch erst nach der Sterilisierung oder kurz vor der Verwendung beim Patienten zuzufügen, um Nebenreaktionen der freien Aminogruppe des Peptids mit der Glucose bei der Hitzesterilisierung auszuschließen.

[0008] Aber auch für die orale Applikation sind diese wasserlöslichen Tripeptide geeignet und können gegebenenfalls zusammen mit Aminosäuren und anderen Peptiden als Granulat oder in Dragees verabreicht werden.

[0009] Die neuen Tripeptide enthalten vorzugsweise die Aminosäuren jeweils in ihrer-physiologisch aktiven-L-For.m.Sowohl das N²-Cystinyl-N⁶-cystinyl-lysin als auch das N²-Tyrosinyl-N⁶-tyrosinyl-lysinyl-lysin lassen sich in einfacher Weise nach der N-Carboxy-Anhydrid-Methode herstellen, wobei die freie Aminogruppe der vorgelegten Aminosäure mit dem jeweiligen N-Carboxyanhydrid der anzuhängenden Aminosäure reagiert; R. Hirschmann et al, J.Org. Chem., Bd. 32, 3415-3425 (1967); J.Am.Chem.Soc., Bd. 93, 2746-2754 (1971). Diese Methode ist sehr vielseitig anwendbar und läßt sich in automatischen Vorrichtungen durchführen, siehe P. Pfaender et al, Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., Bd. 354, S. 267-285 (1973) und DE-OS 24 16 941 sowie US-PS 3 951 741. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Tripeptide werden die N-Carboxy-anhydride des Cystins oder Tyrosins mit dem Lysin umgesetzt unter Anknüpfung der Aminosäuren an die beiden Aminogruppen des Lysins.

[0010] Bei der bekannten Synthesemethode unter Verwendung der N-Carboxy-Anhydrid-Aminosäure-Verbindungen wird in Gegenwart eines Boratpuffers gearbeitet. Da die für therapeutische Zwecke notwendige Abtrennung des erhaltenen Tripeptids von dem Boratpuffer Schwierigkeiten bereitet, kann man diese Synthese auch in Aqua dest. durchführen, was überraschenderweise mit guten Ausbeuten gelingt. Um es von Nebenprodukten, d.h. eventuell entstandenen höheren Peptiden abzutrennen, werden dann die Tripeptide chromatographisch gereinigt, z.B. unter Verwendung von Sephadex-Säulen.

Beispiel 1

(Herstellung von N²-Cystinyl-N⁶-L-cystinyl-L-lysin)

[0011] a) Da Cystin-bis-N-Carboxy-Anhydrid sich nicht nach der üblichen Phosgenmethode herstellen läßt, wurde die Phosphor-Tribromid-Methode (Ben-Ishai u. Katchalski, J.Amer.Chem.Soc., Bd. 74, S. 3688 - 3689 (1952)) angewendet. Es wurden 7,8 g (≙ 1,535 x 10 ² Mol) getrocknetes Di-Z-L-Cystin in 200 ml abs. Diethylether suspendiert und bei 30°C im Wasserbad unter Rühren mit 1,15 mL PBr₃ versetzt. Die Suspension wurde hierbei zunächst dickflüssig, nach 30 min jedoch wieder dünner. Nach 18 h Rühren unter Rückfluß wurde der Niederschlag abgenutscht, der Filterkuchen noch einmal in wenig Ether suspendiert und erneut 30 min gerührt. Danach wurde wieder abgenutscht und das gebildete Cystin-bis-N-Carboxyanhydrid mit wenig Ether gewaschen.

[0012] b) 1,875 g Lysin·HCl (^e 1,5 g oder 0,0103 Mol freies Lysin) wurden in 400 mL H₂O bidest. unter Rühren gelöst, wobei unter Stickstoff gearbeitet wurde. Nach dem Kühlen der Lösung auf 0°C und Einstellung auf pH 10,2 mit ca. 50% NaOH wurden 3,30 g Cystin-bis-N-carboxy-anhydrid (≙ 0,0113 Mol) bei 10000 UpM in kleinen Anteilen zugegeben, um die pH-Schwankungen möglichst gering zu halten. Nach 15 min wurde zur Decarboxylierung des entstandenen Peptidcarbaminats mit ca. 50% H₂S0₄ auf pH 3,5 eingestellt,worauf das Reaktionsgemisch mit 1 N NaOH neutralisiert wurde. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch durch Lyophilisation von Wasser befreit. Der Rückstand betrug 8,6 g. Das trockene Rohprodukt wurde in 20 mL H₂0 bidest. gelöst und nach Abzentrifugieren von einem geringen Rückstand (Cystin) auf die Sephadex-G-10-Säule (2,5 cm x ₂₅₀ cm) gegeben. Als Elutionsmittel diente 0,5% Essigsäure. Als Eluat wurden 6 Fraktionen erhalten, die dünnschicht-chromatographisch untersucht wurden. Die 1. Fraktion enthielt reines Tripeptid, während die 5.und 6. Fraktion nur Cystin und Nebenprodukte enthielten. Die 2. und 4. Fraktion wurden zusammen erneut in Aqua dest. aufgenommen und erneut auf die Sephadex-Säule gegeben. Insgesamt konnten 1,04 g N²,N⁶-Di-L-cystinyl-L-lysin erhalten werden, das noch etwas mit dem Dipeptid (Cystinyl-Lysin) verunreinigt war. Im allgemeinen ist dessen Abtrennung nicht nötig, da auch das Dipeptid vom Organismus verwertet wird. Das erhaltene Produkt zeigte eine Löslichkeit von 125 g/L H₂0 (20°C), während die Werte für Cystin 0,09 g/L H₂0 (20°C) und für Lysin 666,0 g/L H₂0 (20°C) betragen.

Beispiel 2

(Herstellung von N^2-Tyrosinyl-N⁶-L-tyrosinyl-L-lysin)

[0013] Es wurde ein durch Umsetzung von Phosgen mit Tyrosin in TetrahydroJfuran als Lösungsmittel in üblicher Weise hergestelltes Tyrosin-N-Carboxy-Anhydrid verwendet. Die Umsetzung mit dem Lysin wurde in der automatischen Vorrichtung, wie sie in der DE-OS 24 16 941 oder US-PS 3 951 741 beschrieben ist, in Gegenwart eines NA-Boratpuffers, pH 10,2, durchgeführt, wobei das Lysin in der Pufferlösung gelöst mit dem feinst gepulverten Tyrosin-N-Carboxy-Anhydrid im Mol-Verhältnis 1 : 2 umgesetzt wurde. Nach 5 min wurde mit ca. 50% H₂S0₄ auf pH 3,5 angesäuert und dadurch das gebildete Tripeptid-Carbaminat decarboxyliert, worauf mit ca. 50% NaOH neutralisiert wurde. Zur Abtrennung von Natriumborat und Reinigung des Tripeptids wurde das lyophilisierte Reaktionsgemisch mit Methanol extrahiert. Der eingedampfte Methanolextrakt wurde dann in Aqua dest. gelöst und analog, wie in Beispiel 1 beschrieben, chromatographisch an einer Sephadex-G-10-Säule gereinigt. Das erhaltene N^2-Tyrosinyl-N6-L-tyrosinyl-L-lysin wurde durch Säurehydrolyse und übliche _ASAR-Analyse der daraus erhaltenen Aminosäuren (2 Mol Tyrosin, 1 Mol Lysin) charakterisiert.

[0014] Das erhaltene N²-Tyrosinyl-N⁶-L-tyrosinyl-L-lysin läßt sich als Tyrosinquelle den Aminosäure-Infusionslösungen wegen seiner großen Wasserlöslichkeit leicht in den gewünschten Mengen zusetzen. Für die vollständige parenterale Ernährung sollte in der Infusionslösung vorzugsweise das Tripeptid entsprechend einer Menge von 0,5 bis 0,8 g Tyrosin je Liter (2,762 - 10^-3 bis ₄,4₂0 ·10^-2 Mol) vorhanden sein. In einer 5%igen Aminosäurelösung sollte daher das N²-Tyrosinyl-N⁶-L-tyirosinyl-L-lysin in einer Menge von 0,6 bis 1,32 mMol 100 mL enthalten sein, um den biologisch und therapeutisch erforderlichen Mengen in der Infusionsmischung gerecht werden zu können. Wegen der guten Löslichkeit des Tripeptids kann erfindungsgemäß die erforderliche Menge an Tyrosin nun in solche Lösungen eingebracht werden.

[0015] Die nachfolgenden Beispiele 3 - 6 zeigen die Verwendung des erfindungsgemäßen N² -Cystinyl-N⁶-L-cystingyl-L-lysins (Cys-Lys(Cys)) und des _N ² -Tyrosinyl-N⁶-L-tyrosinyl-L-lysins (Tyr-Lys(Tyr)) in Kombination mit Aminosäuren und Peptiden bei Infusionslösungen. Das Tripeptid Glycyl-L-alanyl-L-glutamin (Gly-Ala-Gln) dient in der Lösung der Beispiele 5 und G als Glutaminquelle, wie dies in einer gleichzeitig eingereichten Anmeldung näher beschrieben ist. Bei der Herstellung der Lösungen können außer den angegebenen Bestandteilen gegebenenfalls noch Mineralsalze, Vitamine oder dergl. in üblichen Mengen zugesetzt werden.

B e i s p i e 1 3

[0016] Die erfindungsgemäßen beiden Tripeptide wurden zusammen mit den anderen Substanzen (essentielle Aminosäuren und Histidin) in Aqua dest. gelöst, die Lösung in Infusionsflaschen abgefüllt und sterilisiert (0,5 h bei 120°C).

Beispiel 5

[0017] 

Beispiel 6

Ansprüche

1. Wasserlösliche Peptide sehr schwer löslicher Aminosäuren der allgemeinen Formel

wobei R jeweils ein Tyrosinyl- oder Cystinylrest ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet , daß man Lysin und Tyrosin-N-Carboxy-Anhydrid oder Cystin-bis-N-Carboxy-Anhydrid im Mol-Verhältnis 1 : 1 bis 4 umsetzt, das Reaktionsprodukt durch Ansäuren decarboxyliert und N²-Tyrosinyl-N⁶-L-tyrosinyl-L lysin oder das N²-Cystinyl-N⁶-L-cystinyl-L-lysin isoliert.

3. Verwendung der wasserlöslichen Peptide nach Anspruch 1 in oralen Aminosäure-Präparaten.

4. Verwendung der wasserlöslichen Peptide nach Anspruch 1 in Infusionslösungen für parenterale Ernährung.

5. Verwendung von N^2-Tyrosinyl-N^6-L-tyrosinyl-L-lysin in Mengen von 0,1 - 20 g, vorzugsweise 2 - 20 g, je Liter Infusionslösung.

6. Verwendung von N²-Cystinyl-N⁶-L-cystinyl-L-lysin in Mengen von 0,1 - 10 g, vorzugsweise 1 - 10 g, je Liter Infusionslösung.

Ansprüche

Patentansprüche für folgende(n) Vertragsstaat(en) : Österreich

1. Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher Peptide sehr schwer löslicher Aminosäuren der allgemeinen Formel

wobei R jeweils ein Tyrosinyl- oder Cystinylrest ist, dadurch gekennzeichnet , daß man Lysin und Tyrosin-N-Carboxy-Anhydrid oder Cystin-bis-N-Carboxy-Anhydrid im Mol-Verhältnis 1 : 1 bis 4 umsetzt, das Reaktionsprodukt durch Ansäuren decarboxyliert und N2-Tyrosinyl-N6-L-tyroSinyl-L-lysin oder das N^2-Cystinyl-N^6-L-cystinyl-L-lysin isoliert.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Peptide zur Herstellung oraler Aminosäurepräparate oder Infusionslösungen für parenterale Ernährung