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(11) | EP 0 106 749 A1 |
| (12) | DEMANDE DE BREVET EUROPEEN |
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| (54) | Procédé de détection du pouvoir mutagène de substances, susceptibles d'induire la détérioration d'ADN cellulaires, mettant en jeu la production d'une réponse SOS |
| (57) @ Procédé pour la détection de l'effet mutagène d'une substance. Il comprend la réalisation
d'une culture de E coli hébergeant un recombinant d'un gène sfi et d'un gène codant
pour une enzyme dosable, plus particulièrement une fusion sfiA::opéron lacz, en présence
de la substance à étudier et la mesure de l'activité β-gaiactosidase, éventuellement
induite sous le contrôle du gène sfi, et l'on mesure également l'activité d'une enzyme
distincte synthétisée par le même micro-organisme, mais codéepar un gène non impliqué
dans le processus d'activation du gène sfi, le caractère éventuellement mutagène de
la substance étudiée découlant de la variation observée, plus particulièrement de
l'augmentation du rapport de l'activité de la susdite enzyme dosable à l'activité
de l'autre enzyme, notamment eu égard à l'évolution du même rapport dans une culture
du même micro-organisme, mais en l'absence de substance mutagène. |
[0001] L'invention concerne un procédé de détection du pouvoir mutagène de substances susceptibles d'induire la détérioration d'ADN cellulaire, mettant en jeu la production d'une réponse SOS. Plus particulièrement, elle consiste en un perfectionnement du procédé de détection du caractère éventuellement mutagène de substances, qui fait l'objet de la demande de brevet européen n° 82 400664. Ce procédé consiste à cultiver au sein d'un milieu approprié un micro-organisme transformé par un recombinant d'un gène sfi, notamment sfiA, et d'un gène codant pour une enzyme dosable, avantageusement la S-galactosidase, en présence de la substance étudiée, le caractère mutagène de cette dernière étant évalué par la détection d'un accroissement éventuel de l'enzyme dosable, ou de l'enzyme hybride, constituée au moins en partie par ladite enzyme dosable.
[0002] On a cependant constaté que les réponses suscep- tibles d'être obtenues à l'occasion de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit dans la demande de brevet européen étaient susceptibles d'être modifiées, au moins pour certaines concentrations de la substance à tester, par exemple lorsque celle-ci s'avère exercer des actions distinctes, indépendantes, sur le micro-organisme étudié, par exemple lorsqu'elle possède la propriété d'induire une inhibition de la synthèse des protéines. Dans un tel cas, l'induction de la 8-galactosidase ou de l'enzyme hybride contenant la β-galactosidase peut être suffisamment réduite, même lorsque la substance étudiée possède effectivement des propriétés mutagènes, pour rendre aléatoires les conclusions susceptibles d'être tirées des résultats obtenus, au moins en ce qui concerne l'intensité des propriétés mutagènes effective de la substance étudiée.
[0003] L'invention a pour but de remédier à ce type de difficultés, plus particulièrement d'obvier aux perturbations éventuelles dues à des propriétés souvent non connues de la substance à l'étude et s'ajoutant à ses propriétés effectivement mutagènes ou génotoxiques, et par conséquent de remédier au masquage éventuel de l'induction de l'enzyme dosable, par lesdites perturbations.
[0004] Le procédé selon l'invention pour détecter l'éventuel effet mutageène d'une substance ou composition, qui comprend la réalisation d'une culture d'un micro-organisme, notamment E.coZi, hébergeant un recombinant d'un gène sfi et d'un gène codant pour une enzyme dosable, plus particulièrement une fusion sfiA :: opéron lacZ, en présence de la substance à étudier et la mesure de l'activité S-galactosidase, éventuellement induite sous le contrôle du gène sfi, lorsque celui-ci est activé du fait du caractère mutagène de ladite substance ou composition, est caractérisé en ce que l'on mesure également l'activité d'une enzyme distincte, susceptible d'être synthétisée par le micro-organisme en question, cette enzyme étant codée par un gène non impliqué dans les processus d'activation des gènes intervenant dans la production d'une réponse SOS, le caractère éventuellement mutagène de la substance étudiée découlant de la variation, plus particulièrerement de l'augmentation du rapport de Inactivité de la susdite enzyme dosable à l'activité de l'autre enzyme, notamment eu égard à la valeur observée du même rapport dans une culture du même micro-organisme, mais en l'absence de substance mutagène.
[0005] De préférence, l'autre enzyme est choisie parmi celles que le micro-organisme hébergeant le susdit recombinant est capable de produire en quantités significatives. Au besoin, il est rendu constitutif pour ce qui est de la synthèse de l'enzyme choisie. Cette enzyme est avantageusement constituée par la phosphatase alcaline.
[0006] Bien entendu, toute autre enzyme que la phosphatase alcaline peut être utilisée comme référence. A titre d'exemple d'enzyme susceptible d'être mise en jeu en lieu et place de la phosphatase alcaline, on citera :
la tryptophanase et la glucuronidase.
[0007] Cela vaut également en ce qui concerne la susdite enzyme dosable, laquelle peut éventuellement consister en l'enzyme codée par l'un des gènes suivants : UVR A, reca ou umuC.
[0008] L'utilisation du rapport susdit comme paramètre à prendre en considération, rend le diagnostic essentiellement indépendant des perturbations auxquelles la synthèse de l'enzyme dosable peut être soumise, en réponse à l'induction du gène sfi, comme conséquence des propriétés distinctes de la substance étudiée et susceptibles d'influencer les synthèses enzymatiques. On a en effet constaté que les perturbations en cause s'exerçaient toujours de façon telle, vis-à-vis tant de l'enzyme dosable induite que de l'enzyme de référence,que le susdit rapport tend de toute façon à s'accroitre de façon très notable, lorsque la substance étudiée présente effectivement un caractère mutagène, quels que soient les degrés d'inhibition relatifs des synthèses de l'enzyme dosable, alors induite par l'activation du gène sfi et de l'enzyme de référence.
[0009] L'invention concerne également plus particulièrement les souches des micro-organismes hébergeant les susdits recombinants, dans la mesure où ils ont été rendus constitutifs pour ce qui est de la synthèse de l'enzyme de référence. A ce titre, l'invention concerne en particulier les souches de micro-organismes, plus particulièrement de E. coli, hébergeant le recombinant sfi :: opéron lacZ et autorisant l'expression du gène lacZ, comme suite à l'activation du gène sfiA, ces micro-organismes étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont égalements constitutifs pour la synthèse de la phosphatase alcaline.
[0010] Un micro-organisme hébergeant un recombinant sfi :: opéron lac constitutif pour la synthèse de la phosphatase alcaline peut être obtenu par l'induction d'une mutation dans le gène de régulation phoR ou par transduction du marqueur phop au moyen du bactériophage P1.
[0011] D'autres caractéristiques de l'invention appa- raitront encore au cours de la description de modes de mise en oeuvre préférés du procédé selon l'invention, en mettant en oeuvre une souche également conforme à l'invention, hébergeant un recombinant sfiA::lac, et rendue constitutive pour la synthèse de la phosphatase alcaline. Référence sera faite au dessin, dans lequel : -
- la fig. 1 contient des courbes représentatives des variations des activités (en unités enzymaticrues : u.e.) de la β-galactosidase et de la phosphatase alcaline respectivement, d'une part, et du rapport de l'activité β-galactosidase à l'activité phosphatase alcaline, d'autre part, en fonction de la' teneur (en nananles: nM du milieu de culture du susditmicro-organisme) en composé carcinogène (ou génotoxique) bien connu, constitué par le 4-nitroquinoline-l-oxyde (4NQO),
- les fig. 2 et 3 contiennent des courbes représentatives des variations du logarithme du susdit rapport, ci-après dénommées SOSIF (abréviation de "SOS induction factor"), mesurables dans des cultures semblables, en présence de différentes substances génotoxiques, en fonction de leurs concentrations respectives dans les milieux de culture, en nanomoles :par échantillon étudié.
[0012] Le micro-organisme mis en oeuvre dans les essais dont la description suit est une souche de E. coli transformée, dénommée PQ37, déposée à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.
[0013] de l'INSTITUT PASTEUR de Paris, sous le n° I-205 à la date du 24 septembre 1982 . Les caractéristiques génétiques de ce micro-organisme sont les suivantes : F- thr leu his-4 pyrD thi galE galK ou T lacAUI69 sr1300::Tn10 rpoB rpsL uvrA rfa trp::Muc+ sfiA::Mud(Ap, lac)c-Ts. Il est constitutif pour la synthèse de l'alcaline phosphatase (Phoc).
[0014] Cette souche a été obtenue par les recombinaisons génétiques appropriées pour lui conférer le génotype sus-indiqué, à partir de la souche contenant le recombinant sfiA::lacZ déposé à la C.N.C.M. sous le n° I-152 le 13 avril 1981.
[0015] Le procédé selon l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions suivantes :
Une culture du susdit micro-organisme préalablement développé jusqu'à la phase exponentielle dans le - milieu de culture LB (3acto tryptone 10 g, Bacto yeast extract 5 g, NaCl 10 g, eau Q.S.P. 1 1), contenant également de l'ampicilline,est diluée dix fois soit dans du milieu frais, soit dans le mélange d'activation décrit par AMES B.N. et Coll. (1975), "Mutation Research" 31, 347-364. Des aliquotes de 0,6 ml sont réparties dans des tubes à essais en verre contenant chacun une dose déterminée de la substance à tester. Après deux heures d'incubation à 37°C sous agitation, les activités S-galactosidase et phosphatase alcaline sont dosées.
[0016] On peut en particulier effectuer le dosage de la phosphatase alcaline dans les conditions suivantes : 2,7 ml de tampon T (solution de 121 g de Tris (hydroxy- méthyl)-aminométhane par litre, dont le pH a été ajusté à 8,8 avec HCl) sont ajoutés à 0,3 ml de la culture des cellules. Les membranes cellulaires sont rompues par addition d'une solution de dodécyl-sulfate de sodium à 0,1 % et de 0,15 ml de chloroforme et par agitation vigoureux dans un agitateur du type VORTEX. Les tubes sont ensuite amenés à la température stabilisée de 28°C. La réaction débute par addition de 0,6 ml d'une solution de paranitrophénylphosphate (PNPP)(4 mg/ml dans le tampon T). Elle est ensuite arrêtée par addition de 1 ml de HC1 2N. 5 minutes plus tard, 1 ml de Tris 2'N est ajouté pour restituer la couleur, laquelle est mesurée au spectrophotomètre à 420 nm. Les unités enzymes sont calculées comme pour la β-galactosidase, selon la méthode décrite par MILLER J. (1972) "Cold Spring Harbour Laboratory", New York.
[0017] Le dosage de l'activité β-galactosidase est effectué selon la méthode également décrite par MILLER. Le protocole opératoire est le même que pour la phosphatase alcaline, sauf que le tampon T est remplacé par le tampon Z dont la composition est indiquée ci-après et que l'on utilise à la place du PNPP le substrat constitué par
(ONPG) et enfin que la réaction est interrompue avec du carbonate de sodium.
[0019] Les courbes de la fig. 1 sont représentatives des variations, en fonction des concentrations en substance génotoxique (4NQO) :
- de l'activité β-galactosidase (courbe a) ;
- de l'activité de la phosphatase.alcaline (courbe b);
- du rapport SOSIF (courbe c).
[0020] Les différentes mesures ont été effectuées 2 heures après le début de l'expérience. En effet, l'expérience montre que la courbe représentative du facteur SOSIF,pour toute concentration en substance génotoxique, atteint un plateau au bout de 70 à 100 minutes, et reste stable en général pendant plus de 2 heures.
[0021] Les courbes montent en outre,au-delà d'une certaine concentration en substance génotoxique,qu'il s'ensuit un effet inhibiteur de la synthèse des protéines se manifestant par une réduction des activités β-galactosidase et phosphatase alcaline. Cependant, le rapport SOSIF, utilisé pour l'appréciation de l'effet mutagène ou génotoxique de la substance étudiée, n'est pratiquement pas affecté. En effet, il reste sensiblement constant à des concentrations de la substance génotoxique qui sont de nature à inhiber la synthèse des protéines.
[0022] Les courbes des fig. 2 et 3 sont représentatives des variations du rapport SOSIF en fonction des concentrations utilisées en divers agents génotoxiques.
[0023] Les substances génotoxiques utilisées ont été les suivantes :
R 5255 : 2-nitro-5-méthoxybenzofuranne
AF B1 : aflatoxine
4NQO : 4-nitroquinoline-1-oxyde
R 5144 2-nitro-benzofuranne
AF Gl : aflatoxine G
AF B2 : aflatoxine B
B(a)P : benzo-a-pyrène
MNNG . N-rnéthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
[0024] Il est particulièrement remarquable que le facteur SOSIF soit en fonction sensiblement linéaire de la concentration de la substance génotoxique utilisée, en particulier pour des doses contenues dans un intervalle de doses relativement faibles.La sensibilité du test est particulièrement remarquable, si l'on observe que les variations des valeurs mesurées s'étendent dans un intervalle de 1 à 60 millions, lorsque l'on passe de la limite inférieure à la limite supérieure de l'intervalle des concentrations exprimées en abscisse.
1 - Procédé pour détection de l'éventuel effet mutagène d'une substance ou composition,
qui comprend la réalisation d'une culture d'un micro-organisme, notamment E. eoli,
hébergeant un recombinant d'un gène sfi et d'un gène codant pour une enzyme dosable,
plus particulièrement une fusion sfiA::opéron lacZ, en présence de la substance à
étudier et la mesure de l'activité β-galactosidase, éventuellement induite sous le
contrôle du gène sfi, lorsque celui-ci est activé du fait du caractère mutagène de
ladite substance ou composition, caractérisé en ce que l'on mesure également l'activité
d'une cnzyme distincte, susceptibles d'être synthétisée par le micro-organisme en
question, cette enzyme étant codée par un gène non impliqué dans les processus d'activation
des gènes intervenant dans la production d'une réponse SOS, le caractère éventuellement
mutagène de la substance étudiée découlant de la variation observée, plus particulièrement
de l'augmentation du rapport de l'activité de la susdite enzyme dosable à l'activité
de l'autre enzyme, notanment eu égard à l'évolution du même rapport dans une culture
du même micro-organisme, mais en l'absence de substance mutagène.
2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme dosable est constituée
par la S-galactosidase.
3 - Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme distincte
est constituée par la phosphatase alcaline.
4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que
le micro-organisme a été rendu constitutif pour la synthèse de l'enzyme distincte.
5 - Micro-organisme,particulièrement E. coli, hébergeant le recombinant sfiA::opéron
lacZ et autorisant l'expression du gène lacZ, comme suite à l'activation du gène sfiA,
ces micro-organismes étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont également
consti tutifs pour la synthèse de la phosphatase alcaline.