Bacillus subtilis DSM 2704 und Verfahren zur Herstellung von Alpha-Amylase

Abstract

 Der neue Mikroorganismus Bacillus subtilis DSM 2704 zeichnet sich durch eine hohe Produktivität an Alpha-Amylase aus.

Beschreibung

[0001] Alpha-Amylase ist eines der industriell bedeutsamsten Enzyme und wird in großem Umfang beispielsweise in der Stärke-, TextiL-, LebensmitteL-Industrie zur HydroLyse von Stärke eingesetzt. Die industrielle HersteLLung von Alpha-Amylase hat daher wirtschaftlich einiges Gewicht.

[0002] Zur HersteLLung von Alpha-Amylase ist es allgemein bekannt, daß durch Fermentierung verschiedener Arten von Mikroorganismen der Gattung BaciLLus, darunter BaciLLus subtilis und dessen Varietäten, Alpha-Amylase in wirtschaftlich vertretbarer Ausbeute gewonnen werden kann. Besonders vorteilhaft ist es dabei, wenn schon in dem Fermentationsmedium möglichst hohe Konzentrationen an aktivem Enzym vorliegen. Es mangelt daher nicht an Bemühungen, um durch züchterische und verfahrenstechnische Maßnahmen im Fermentationsmedium eine möglichst hohe Enzymkonzentration zu erzielen. So wird zum BeispieL von Yoneda et aL. in der Zeitschrift "AppLied and EnvironmentaL MicrobiLogy"; Jahrgang 1980, Band 39, S. 274 ff und in dem Buch "Molecular Cloning and Gene ReguLation in Bacilli", herausgegeben von Ganesan, Chang und Hoch, erschienen 1982 bei Academic Press, Inc., New York, ein Verfahren beschrieben, wie bei einem industriell genutzten Stamm von BaciLLus subtilis durch gezielte Übertragung von Genfragmenten die Ausbeute der ALpha-AmyLase in der Fermentationsbrühe von 130 bis 150 U/mL auf 25000 U/mL gesteigert werden konnte. Diese Steigerung stellt in diesem FaLL eine ca. 170fache Verbesserung der Produktivität dar. Eine derartige Produktivität ist jedoch für eine industrielle HersteLLung von Alpha-Amylase immer noch ungenügend.

[0003] Der Erfindung Liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Mikroorganismus der Art BaciLLus subtilis bereitzustellen bzw. ein Verfahren zur HersteLLung von ALpha-AmyLase unter Verwendung eines solchen Mikroorganismus zu entwickeln, bei dem eine wesentlich höhere Produktivität erzielbar ist.

[0004] Die Lösung dieser Aufgabe gelingt durch BereitsteLLung des Mikroorganismus BaciLLus subtilis DSM 2704 bzw. durch ein Verfahren zur HersteLLung von Alpha-Amylase unter Verwendung dieses Mikroorganismus.

[0005] Der neue Mikroorganismus DSM 2704 wurde bei den in der industriellen Fermentation üblichen KontroLLuntersuchungen (Anfertigung von Ausstrichen von Proben der Fermentationsbrühe, Fermentierung von KoLonien solcher Ausstriche im Schüttelkolben, Anfertigung von Ausstrichen von Proben der Fermantionsbrühe aus den Schüttelkolben) als abweichende KoLonie auf dem Kontrollausstrich einer Probe aus dem Schüttelkolben beobachtet, durch systematisches Screening rein isoliert und als im morphologischen und physiologischen VerhaLten sich vom ursprünglichen Mikroorganismus unterscheidende Mutante erkannt.

[0006] Der neue Mikroorganismus mit der internen Bezeichnung A4 ist unter der HinterLegungsnummer DSM 2704 bei der Deutschen SammLung von Mikroorganismen hinterlegt.

[0007] Die morphologischen und stoffwechselphysiologischen Eigenschaften des Mikroorganismus DSM 2704 wurden untersucht und zur Bestimmung mit den in "Bergey's Manual of determinative bacteriology" aufgeführten Eigenschaften verglichen. Im einzelnen wurden folgende Eigenschaften festgestellt:

[0008] Die morphologischen MerkmaLe der EinzeLLen entsprechen den von BaciLLus subtilis bekannten; ebenso ist die Koloniemorphologie mit der bekannter Stämme von BaciLLus subtilis weitgehend identisch. Im direkten Vergleich mit den Ausgangskulturen fällt der Stamm A4 durch stark gekräuselte KoLonien mit unebener Oberfläche auf, die im DurchLicht bräunlich dunkel mit körniger Struktur erscheinen.

[0009] Unter Anwendung der im "Bergey's ManuaL of determinative bacteriology" angegebenen BestimmungstabeLLe wurde größtmögliche Ähnlichkeit festgestellt zu BaciLLus subtiLis (Ehrenberg) Cohn. Wir möchten daher diesen Stamm als zur Spezies BaciLLus subtilis (Ehrenberg) Cohn gehörig bezeichnen.

[0010] Der neue Mikroorganismus DSM 2704 ist in der Produktivität von ALpha-AmyLase allen bekannten Mikroorganismen der gleichen Gattung und Art weit überlegen. Die Konzentration an ALpha-AmyLase in den Fermentationsmedien Liegt konstant über 250000 U/mL und reicht zum TeiL über 300000 U/mL hinaus. Besonders vorteilhaft an dem neuen Mikroorganismus ist insbesondere, daß er weniger Protease als die bekannten Mikroorganismen der Art BaciLLus subtiLis bildet. So Lag die Konzentration an Protease im Fermentationsmedium in keinem FaLL höher als 10 NU/100000 AmyLaseeinheiten. Typischerweise Liegt die Konzentration an Protease unter 8 NU/100000 Amylaseeinheiten.

[0011] Beansprucht werden auch alle natürlichen und künstLichen Mutanten des neuen Mikroorganismus BaciLLus subtiLis DSM 2704, insbesondere wenn sie bei Fermentation mindestens 200000 U/mL, vorzugsweise mindestens 250000 U/mL, Alpha-Amylase bilden.

[0012] SoLche natürlichen und künstlichen Mutanten werden insbesondere dann beansprucht, wenn sie bei Fermentation höchstens 10 NU/100000 Amylaseeinheiten, vorzugsweise höchstens 8 NU/100000 Amylaseeinheiten, Protease bilden.

[0013] Die Fermentation des neuen Mikroorganismus BaciLLus subtilis DSM 2704 beziehungsweise die erfindungsgemäße HersteLLung von Alpha-Amylase unter Verwendung des Stammes DSM 2704 kann sowohl in flüssigen Nährböden submers als auch auf festen Nährböden erfolgen, wobei die HersteLLung in flüssiger KuLtur im allgemeinen vorteilhafter ist. Die Fermentation erfolgt nach heute allgemein üblichen Verfahren. Die HersteLLung der verwendbaren Nährböden erfolgt ebenso auf bekannte Weise. Die Nährböden enthalten assimiLierbare KohLenstoffqueLLen, assimiLierbare Stickstoffquellen und andere, für das Wachstum des Mikroorganismus günstige oder notwendige Nähr- und HiLfsstoffe. ALs Kohlenstoffquellen geeignet haben sich verschiedene Zucker und zuckerhaltige Stoffe erwiesen, wobei die Zucker in unterschiedlichen PoLymerisationsstufen vorliegen können; als Beispiel seien genannt Stärke, Dextrine, Rohrzucker, MiLchzucker, MaLtose, Fructose, GLucose. ALs Stickstoffquellen können sowohl anorganische als auch organische Stickstoffverbidnungen sowohl einzeln als auch in Kombination verwendet werden. ALs Beispiel seien genannt proteinhaltige Substanzen, wie z.B. Pepton aus Soja, FLeisch und Casein, GeLatine, Hefeeiweiß oder Hefeextrakt, AbfäLLe aus der FLeischerzeugung oder Tierkörperverwertung, Ammoniumsalze. Darüberhinaus kann der Zusatz von anorganischen SaLzen, insbesondere von ALkaLi- und ErdaLkaLi-MetaLLSaLzen und Phosphaten, von Vorteil sein, sowie die Zugabe von SpureneLementen, wie beispielsweise Fe, Mg, Mn, Co, Ni.

[0014] Die Fermentation wird bei pH-Werten zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, und einer Temperatur zwischen 25 und 50 °C, vorzugsweise 33 und 45 °C, durchgeführt. Die Fermentationsdauer beträgt zwischen 30 und 90 Stunden, vorzugsweise zwischen 50 und 70 Stunden.

[0015] Nachstehend sind die BeispieLe für Fermentationen aufgeführt, die die Erfindung beschretben, ohne daß diese auf die aufgeführten BeispieLe beschränkt wird.

[0016] Die Bestimmung der Alpha-Amylase-Aktivität erfolgt nach einer von FUWA (1954) in der Zeitschrift "Journal of Biochemistry (Tokyo)", Jahrgang 1954, Band 41, Seite 583 ff beschriebenen Methode. ALs Enzymsubstrat wurde hochgereinigte Amylose (Sigma Chemicals Co., Bestellnr. A 0512) verwendet. Alle anderen Reagentien waren Standardqualität "pro analysi".

[0017] Amyloselösung 0,2 X:

200 mg AmyLose werden in 4 ml 1 N NaOH gegeben und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Nach Verdünnung auf ca. 80 ml wird mit 1 N Essigsäure neutralisiert und auf 100 ml aufgefüLLt. Diese Lösung muß täglich frisch bereitet werden.

[0018] Reagenz A:

Lösung mit 0,2 % Jod und 2 % Kaliumjodid. Diese Lösung wurde täglich aus einer fünffach konzentrierten StammLösung durch Verdünnen mit Wasser hergesteLLt.

[0019] Arbeitsweise:

500 µl 0,5 M Acetatpuffer und 500 µl enzymhaltige Lösung, gegebenenfalls mit Kalziumacetatlösung verdünnt, wurden mit 100 µl Amyloselösung (0,2 X) gemischt und 30 Minuten im Wasserbad bei 37 °C inkubiert.

[0020] Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2000 µl 1 N Essigsäure gestoppt, das Gemisch 1 : 50 mit Reagenz A verdünnt und die Extinktion bei 700 nm und 10 mm Lichtweg gemessen. Eine Amylaseeinheit (U) entspricht einer 10 %igen Reduktion des JodstärkefarbkompLexes. Im Bereich von 1 bis ca. 5 Einheiten ist die Eichkurve linear.

[0021] Die Bestimmung der Protease-Aktivität erfolgt nach folgender Methode:

CaseinLösung:

0,2 % Casein nach Hammarsten (Merck, Art.-Nr. 2242) in Puffer 1, durch Erwärmen auf 40 °C für 45 Minuten, Lösen.

[0022] Puffer 1:

10,3 g Borsäure, 46,18 g Dinatriumhydrogenphosphat x 7 H₂O, 60,7 g Trinatriumcitrat x 2 H₂0 auf 2 L mit destilliertem Wasser auffüllen; pH = 8,0.

[0023] Puffer 2:

120 g Natriumacetat x 3 H₂O und 160 ml Essigsäure auf 2 L mit destilliertem Wasser auffüllen; pH = 4,0.

[0024] Arbeitsweise:

ParaLLeL zur Probe wird ein durch Erhitzen denaturierter Blindwert gemessen. 50 ml CaseinLösung (vortemperiert auf 40 °C) + 1 mL EnzymLösung bzw. BLindwert (EnzymLösung so verdünnen, daß die Aktivität zwischen 0,07 und 0,11 NU/mL Liegt) 35 Minuten bei 40 °C inkubieren; Reaktion durch Zugabe von 25 mL Puffer 2 stoppen.

[0025] Nach 15 Minuten VerweiLdauer Lösung filtrieren (Blauband, Schleicher & Schüll Nr. 589³).

[0026] Im FiLtrat wird Stickstoff nach dem Verfahren von Kjeldahl bestimmt; der ProteingehaLt berechnet nach der FormeL
Protein = Stickstoff x 6,25.

[0027] 1 Proteaseeinheit (NU) ist definiert als die Aktivität, die unter den Bedingungen des Tests 40 % des Caseins hydrolysiert.

Beispiel 1

[0028] Zur Bereitung von 1 Liter Nährboden wurden 90 g Lactose, 30 g SojamehL, 10 g Proteosepepton Oxoid Nr. L46 gemischt, à 50 ml in ErLenmeyerkoLben abgefüllt, sterilisiert und mit BaciLLus subtilis A 4 beimpft. Nach 70 Stunden Bebrütung auf einer RundschütteLmaschine wurde scharf zentrifugiert und im Überstand die Aktivität bestimmt. Sie betrug im MitteL 300000 U/mL; die Protease- aktivität 21 NU/mL.

Beispiel 2

[0029] Zur Bereitung von 1 Liter Nährboden wurden 90 g MaLtodextrin, 30 g Soja, 10 g GeLatine, 2,5 g Diammonphosphat gemischt, ä 50 ml in Erlenmeyer-Schikanenkolben abgefüllt, sterilisert und wie in Beispiel 1 bebrütet. Die Ausbeute betrug im MitteL 280000 U/mL; die Protease- aktivität 22 NU/mL.

Beispiel 3

[0030] Das in Beispiel 1 aufgeführte Medium wurde in einem 2-Liter-Fermenter mit 650 ml NutzvoLumen mit einem Luftdurchsatz von 1,3 v/vm und einer Rührdrehzahl von 900^-1 fermentiert. Die Ausbeute betrug nach 70 Stunden 300000 U/mL; die Proteaseaktivität 24 NU/mL.

[0031] Die Aufarbeitung der erfindungsgemäß hergestellten Fermenterbrühe und die Gewinnung von Alpha-Amylase erfolgt nach allgemein bekannten Methoden und Verfahren. K C 0 0 2 7

Ansprüche

1. BaciLLus subtilis DSM 2704 und dessen natürliche und künstliche Mutanten.

2. BaciLLus subtilis DSM 2704 und dessen bei Fermentierung mindestens 200000 U/mL, vorzugsweise mindestens 250000 U/mL, Alpha-Amylase bildende natürliche und künstLiche Mutanten.

3. BaciLLus subtilis DSM 2704 und dessen bei Fermentierung mindestens 200000 U/mL, vorzugsweise mindestens 250000 U/mL, Alpha-Amylase und höchstens 10 NU/100000 Amylaseeinheiten, vorzugsweise höchstens 8 NU/100000 AmyLaseeinheiten, Protease bildende natürliche und künstLiche Mutanten.

4. BaciLLus subtilis DSM 2704.

5. Verfahren zur HersteLLung von ALpha-AmyLase durch Fermentierung nach an sich bekannten Verfahren von Mikroorganismen der Art BaciLLus subtilis in einem Nährmedium mit für Mikroorganismen der Art BaciLLus subtilis an sich bekannten Zusammensetzung und gegebenenfalls Abtrennung der Alpha-Amylase aus dem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 fermentiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH von 5,0 bis 9,0, vorzugsweise bei einem pH von 6,0 bis 8,0, fermentiert.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man bei 25 bis 50 °C, vorzugsweise bei 33 bis 45 °C, fermentiert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man 30 bis 90 Stunden, vorzugsweise 50 bis 70 Stunden fermentiert.