Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente Rezeptoren, ihre Herstellung und Verwendung

Abstract

 Die Erfindung betrifft bispezifische und oligospezi­fische, mono- und oligovalente Rezeptoren, die gentech­nisch durch Fusion von für F(ab) Fragmente der Antikörper zweier oder mehrerer verschiedener Spezifitäten kodieren­de DNA mittels geeigneter Linker hergestellt werden. Vorzugsweise ist eine Spezifität dabei entweder gegen ein auf der Zellmembran oder im Interstitium befindliches Epitop eines Tumorassoziierten Antigens (TAA) gerichtet, wahrend die weiteren Spezifitäten hochmolekulare oder niedermolekulare Liganden betreffen und z.B. mit den Komplexonen Äthylendiamintetaracetat bzw. Diäthylentri­aminpentaacetat in Y90 komplexierter Form (EDTA-Y90 bzw. DTPA-Y90) reagieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung mit den Komplexonen am Komlexon-Rezeptor-Arm über fos-jun Interaktion (oder auch Avidin-Biotin Interaktion). Weitere bevorzugte Spezifitäten haben katalytische Eigenschaften.

Beschreibung

[0001] Die Erfindung betrifft bispezifische und oligospezi­fische, mono- und oligovalente Rezeptoren, die gentech­nisch durch Fusion von für F(ab) Fragmente von Antikör­per zweier oder mehrerer verschiedener Spezifitäten kodierende DNA mittels geeigneter Linker hergestellt werden. Vorzugsweise ist eine Spezifität dabei entweder gegen ein auf der Zellmembran oder im Interstitium befindliches Epitop eines Tumor-assoziierten Antigens (TAA) oder gegen ein Epitop im Tumorendothel (TE) gerichtet, während die weiteren Spezifitäten hoch­molekulare oder niedermolekulare Liganden betreffen und z.B. mit den Komplexonen Äthylendiamintetraacetat bzw. Diäthylentriaminpentaacetat in Y90 komplexierter Form (EDTA-Y90 bzw. DTPA-Y90) reagieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung mit den Komplexonen am Komplexon-Rezeptor-Arm über fos-jun Interaktion (oder auch Avidin-Biotin Interaktion). Weitere bevorzugte Spezifitäten haben katalytische Eigenschaften.

[0002] Bispezifische Antikörper wurden bisher nach folgenden Methoden hergestellt
- chemische Kopplung von Antikörpern verschiedener Spezifität über heterobifunktionelle Linker (H. Paulus, Behring Inst. Mitt. 78, (1985), 118-132)
- Fusion von bereits vorhandenen Hybriden, die ver­schiedene monoklonale Antikörper (MAK) ausscheiden, und Isolation des bispezifisch-monovalenten Anteiles (U.S. Staerz und M. J. Bevan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, (1986) 1453-1457
- Transfektion der leichten und schweren Kettengene zweier verschiedener MAK (4 Gene) in murine Myelom­zellen oder andere eukaryotische Expressionssysteme und Isolation des bispezifisch-monovalenten Anteiles (U. Zimmermann, Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105 (1986), 176-260; J. van Dijk et al., Int. J. Cancer 43, (1989), 944-349).

[0003] Solche bispezifische Antikörper werden zur Therapie und Diagnostik von malignen Tumoren eingesetzt. Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, da im ersten Schritt durch Injektion des bispezifischen Makromoleküls über längere Zeiträume und mit hohen Dosen eine Absättigung der Epitope, die von einer der beiden Spezifitäten auf den Zielzellen erkannt werden, erreicht wird. Im zweiten Schritt, der aus einer mehrtägigen Unterbrechung der Behandlung besteht, findet die Autoelimination des unspezifisch adsorbierten bispezifischen Antikörpers aus den nicht Zielgeweben statt.

[0004] Diese Autoelimination kann durch Injektion eines mit Zucker­resten, vorzugsweise Galactose gekoppelten anti-idiotypischen Antikörpers, der gegen den Anti-Tumor-Arm des bispezifischen Rezeptors gerichtet ist, beschleunigt werden.

[0005] Der dritte Schritt des Verfahrens besteht in der i.v. Injektion eines radiomarkierten, hydrophilen, sich nicht in Zellen anreichernden niedermolekularen Liganden mit kurzer Verweilzeit im Organismus, der hohe Komplexkonstanten für beta- und gamma-Strahler wie Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Re¹⁸⁹, ^99mTc oder ¹¹¹In hat und an den die zweite Spezifität des bispezi­fischen Antikörpers mit hoher Affinität bindet. Durch diesen Schritt wird eine Anreicherung des radioaktiven Liganden, verbunden mit längerem Verbleib am Zielgewebe erreicht, was die selektive Zerstörung des Zielgewebes zur Folge hat bzw. eine Diagnostik beispielsweise von Metastasen ermöglicht.

[0006] Die Erfindung stellt nun bispezifische bzw. oligospezi­fische Rezeptoren bereit, die je nach Erfordernis mono-­oder oligovalente Bindungen zu den jeweiligen Epitopen besitzen und gentechnisch mittels geeigneter "Linker" erzeugt werden. Dabei werden die Genfragmente, die für die V_H und C_H1 Abschnitte der Antikörper a und b kodie­ren, mittels geeigneter synthetischer Oligonukleotide wie in Tab. 1 beispielhaft dargestellt, dergestalt verknüpft, daß der N-Terminus der V_H Dömane des MAK b über einen Polypeptidspacer mit dem C-Terminus der C_H1 Domäne des MAK a kovalent verbunden ist (Fig. 1). Das Genkonstrukt aus V_HaC_H1a-Polypeptidspacer-V_HbC_H1b wird zusammen mit den Genen für die leichten Ketten der Antikörper a und b in eukaryontische Zellen transfiziert (z.B. Mausmyelomzellen). Die C_H1a, C_H1b, C_ka und C_kb Domänen sind so modifiziert, daß an den Kontaktflächen der konstanten Domänen entgegengesetzte Ladungen aufein­andertreffen (C_H1a(+)C_ka(-); C_H1b(-)C_kb(+)) (+ = posi­tiv, - = negativ) bzw. sich jeweils hydrophobe oder jeweils hydrophile Kontaktflächen gegenüberstehen. Dadurch werden von den Transfektomas bevorzugt Hybridmo­leküle ausgeprägt, bei denen die korrekten Paarungen aus schweren und leichten Ketten vorliegen (Fig. 2).

[0007] Antikörper a steht hier beispielhaft für einen Antitu­mor-Antikörper, Antikörper b für einen Antikörper gegen einen niedermolekularen Liganden, vorzugsweise die Komplexone DTPA-Y90 oder EDTA-Y90.

[0008] Bi- oder oligospezifischer Rezeptor bedeutet demnach eine gentechnische Konstruktion aus V_H und C_H1 Domänen von Antikörpern verschiedener Spezifität über geeignete Linker, so daß die erforderliche Beweglichkeit zur Assoziation mit den korrespondierenden leichten Ketten gegeben und die Antigenbindung nicht behindert ist.

[0009] Valenzen oder Bindungsstellen bezeichnen die Antigen­ bindungsstellen. Ein bispezifischer monovalenter Rezep­tor hat bei zwei Spezifitäten, also je eine Antigen­bindungsstelle. Ein bispezifischer trivalenter Rezeptor besitzt folglich eine Antigenbindungsstelle für die eine Spezifität und zwei Antigenbindungsstellen für die andere.

[0010] Bispezifische Rezeptoren, die bivalent für das Tumor­antigen (MAK a) und monovalent für EDTA-Y90 (MAK b) sind, werden hergestellt, indem man das oben beschriebe­ne schwere Ketten-Genkonstrukt mittels des oben erwähn­ten Oligonukleotidlinkers mit dem Genabschnitt ver­knüpft, der für die V_H und C_H1 Domäne des MAK a kodiert (Fig. 3), so daß das C-terminale Ende der C_H1 Domäne des MAK b mit dem N-terminalen Ende der V_H Domäne des MAK a durch einen Polypeptidspacer verbunden ist. Diese Genkonstrukte werden zusammen mit den Genen für die zu den MAK a und b gehörenden leichten Ketten in eukaryon­tische Zellen transfiziert (z.B. Myelomzellen). Die C_H1 und C_k Domänen sind, wie oben beschrieben, mit komple­mentären Ladungen bzw. jeweils hydrophoben oder hydro­philen Kontaktflächen versehen. Von den Transfektomas werden bevorzugt Fusionsmoleküle ausgeprägt, die aus zwei F(ab) Fragmenten des MAK a und einem F(ab) Fragment des MAK b bestehen Fig. 4). Die Beweglichkeit der Peptidlinker ermöglicht die Ausrichtung der beiden F(ab)-Arme des MAK a zur Tumorzelle bei gleichzeitiger Ausrichtung des F(ab)-Armes des MAK b zum interzellu­lären Raum. Entsprechend können weitere Bindungsstellen identischer oder anderer Spezifität zugefügt werden. Die Reihenfolge der Spezifitäten in den Konstrukten ist dabei frei kombinierbar.

[0011] Die Erfindung betrifft folglich bispezifische oder oligospezifische, mono- oder oligovalente Rezeptoren, die sowohl Spezifität für ein auf der Zellmembran oder im Interstitium befindliches Epitop haben, zum Beispiel TAA oder TE, als auch Spezifitat für einen nieder- oder hochmolekularen Liganden besitzen, der sich ausschließ­lich im extrazellulären Raum verteilt. Eine Spezifität wird dabei vorzugsweise von den tumorspezifischen Anti­körpern gebildet, wie in der deutschen Patentanmeldung P 39 09 799.4 vorgeschlagen, während die andere Spezifität vorzugsweise gegen DTPA-Y90 oder EDTA-Y90 gerichtet ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindung mit Komplexonen am Komplexon-Rezeptor-Arm über fos-jun Interaktion (siehe Beispiel 5). Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung besteht im Einbau von katalytisch wirksamen Spezifitäten. Die Reihenfolge der Spezifitäten bzw. Bindungsvalenzen ist dabei frei wählbar, wie beispielhaft in Fig. 4 für drei Valenzen bei zwei Spezifitäten gezeigt.

[0012] Besonders bevorzugt bei den erfindungsgemäßen Konstruk­ten sind solche, die ein V-Gen der Tabellen 2, 3, 4 und/oder 5 enthalten. Antikörper mit diesen Sequenzen und ihre Eigenschaften sind in der deutschen Patentanmeldung P 39 09 799.4 beschrieben. Die "Complementarity Determining Regions" (CDR's) sind dabei nach Kabat und Wu (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office (1987)) identifizierbar. Bevorzugt sind ebenfalls Konstrukte, die Spezifitäten gegen die durch vorstehend geschilderte monoklonale Antikörper definierte Epitope enthalten.

[0013] Zusätzlich betrifft die Erfindung gentechnische Verfah­ren zur Herstellung oben beschriebener Konstrukte sowie eine Verwendung o.g. Konstrukte zur Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung und Diagnose von Zielzel­len. Dabei findet in einem 1. Schritt nach Injektion der Konstrukte eine Absättigung der betroffenen Epitope auf Zielzellen statt, in einem nachfolgenden Intervall werden unspezifisch adsorbierte oder nicht gebundene Konstrukte eliminiert. Der daran anschließende Schritt besteht in der Injektion und nachfolgender spezifischer Bindung eines sich nicht in den Zielzellen anreichernden nieder- oder hochmolekularen Liganden, der per se zytotoxisch ist oder gegebenenfalls in einem weiteren Schritt durch extrakorporale Einwirkungen zur Zytoxizi­tät "aktiviert" wird. Verfahren dieser Art sind bei­spielsweise enzymatische Aktivierung, Aktivierung durch Mikrowellenbestrahlung eines "Pro-Drugs" oder Aktivie­rung durch Laserlicht.

[0014] Die Erfindung ist ferner in den Beispielen und den Patentansprüchen enthalten.

Beispiel 1: Herstellung eines anti-DTPA-Y90 bzw. EDTA-­Y90-MAK

[0015] Als Hapten wurde Isothiocyanato-benzyl-DTPA (Formel 2) auf humanes Serumalbumin (HSA als Carrier) mit einem Derivatisierungsgrad von 19 Benzyl-DTPA Molekülen pro HSA-Molekül entsprechend der in (N.W. Brechbiel et al., Inorganic Chemistry 25, (1986) 2772-2781) beschriebenen Methodik kovalent gekoppelt. 20 µg dieses Hapten-­Carrier-Komplexes, in welchen kaltes Y komplexiert wurde, wurden s.c. an Tag 0 mit Freundschem Adjuvans, an Tag 7 und 14 mit inkomplettem Freundschem Adjuvans und an Tag 21 mit PBS in Balb/c Mäuse injiziert. An Tag 24 wurden die Milzen der Mäuse mit den höchsten anti DTPA Antikörpertitern mit der SP2/0-Ag14 Myelomzellinie (Shulman et al., Nature 276, (1978) 269) fusioniert. Entstehende Hybridome wurden in einem DTPA-spezifischen ELISA auf Produktion von hochaffinen MAk gegen DTPA und EDTA überprüft. Der ELISA bestand aus einer festen Phase, die mit einer HSA-Benzyl-DTPA-Y enthaltenden Lösung beladen wurde. Der zu testende, den MAk enthaltende Überstand wurde mit freiem Komplexon bzw. dessen Metallionkomplexen vorinkubiert und seine Bindung an die spezifische feste Phase gemessen. Hierzu wurde ein Enzymamplifikationssystem benutzt, welches an einen anti Maus-Immunglobulinantikörper gekoppelt ist. Die Details dieser Methodik sind in Anlage 1a und 1b beschrieben.

[0016] Mittels dieses Testsystems wurden MAk erhalten, welche die in Anlage 1e beschriebenen Eigenschaften besitzen.

[0017] Diese MAk binden im Gegensatz zu vielen anderen anti DTPA/EDTA MAk nicht an menschliche Normalgewebe, wie mittels der APAAP-Technik (Cordell et al., J. Histochem. Cytochem. 32: 219, 1984) auf kryopräservierten Geweben ermittelt wurde. Ein in vivo Einsatz dieser MAk im Bereich der Diagnostik und Therapie ist somit möglich.

[0018] Als Kompetitoren wurden die Komplexone DTPA, EDTA in nicht komplexierter sowie in komplexierter Form (Anlage 1c) eingesetzt. Zusätzlich wurden als Inhibitoren die strukturverwandten Verbindungen Transaconitsäure und 1,2 Diaminoethan verwendet (siehe Anlage 1e). Besonders geeignet für eine in vivo Anwendung ist der MAk BW 2050/­174 der im Gegensatz zu allen anderen MAk eine präferen­tielle Bindung an EDTA-Y zeigt (siehe Anlage 1e, niedri­ger Kompetitor Überschuß für EDTA-Y (100fach) höherer Überschuß für andere EDTA-Komplexone. Deshalb wurde das Hybrid 2050/174 stabilisiert und für die Entwicklung des EDTA-Y-Armes im bispezifischen Rezeptor verwendet.

Beispiel 2: Herstellung und Expression eines V_H1a C_H1-Linker-V_H1B C_H1 Genkonstruktes

[0019] Die hier verwendeten Techniken wurden, wenn nicht anders ange­zeigt, aus Molecular Cloning, a Laboratory Manual; Sambrook, Fritsch, Maniatis; Cold Spring Habor Laboratory, 1982 (S. 11 - 44, 51 - 127, 133 - 134, 141, 146, 150 - 167, 170, 188 - 193, 197 - 199, 248 - 255, 270 - 294,310 - 328, 364 - 401, 437 - 506) und aus Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition; Sambrook, Fritsch, Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, (S. 16.2 - 16.22, 16.30 - 16.40, 16.54 - 16.55) entnommen.

[0020] Ein humanes IgG₃ C-Gen wurde aus einer humanen Genbank in EMBL3 Phagen isoliert (A.M. Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170, 827-842 (1983) und G.H.A. Seemann et al., The EMBO Journal 5 (1986), 547-552).

[0021] Aus diesem IgG₃ C-Gen wurden wie in der deutschen Pa­tentanmeldung P 38 25 615.0 beschrieben, Konstruktionen hergestellt, die zum einen nur noch das C_H1 Exon und ein Hinge Exon (Fig. 5) und zum anderen das C_H1 Exon und den 3′NT Bereich eines HLA B27 Gens enthalten (Fig. 6, Fragment M im Plasmid M).

[0022] Die V_Ha und V_Hb Gene wurden aus mRNA der Hybridklone a und b amplifiziert, wie von Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86, (1989), 3833-3837) beschrieben und in einen M13 Vektor kloniert (V_Ha PCR bzw. V_Hb PCR) (Fig. 7). Das V_Ha Gen wurde als HindIII BamH1 Fragment in den eukaryontischen Expressionsvektor pEV_H kloniert (Simon et al., Nucl. Acids. Res. 16, (1988), 354) (Fig. 8). Es entsteht das Plasmid PEV_H a C.

[0023] Der humane IgG C Gen Subklon mit dem C_H1 und dem einen Hinge Exon (Fig. 5) enthält zwischen C_H1 Exon und Hinge Exon eine Pst1 Schnittstelle. Die V_H Gene enthalten am 5′ Ende eine Pst1 Schnittstelle. Das Linkeroligonukleo­tid wird so entworfen, daß es am 5′ Ende mit dem Bereich der Pst1 Schnittstelle auf dem C_H1 + 1H Subfragment des IgG C Gens und am 3′ Ende mit der Pst1 Schnittstelle des VHb Gens überlappt. Das Linkeroligonukleotid wird mittels seiner Pst1 Schnittstellen in die Pst1 Schnitt­stelle eines PUC 18 Plasmids kloniert (Fig. 9). Es entsteht der Plasmidklon L.

[0024] Das Plasmid mit dem IgG₃ C Gen Subfragment mit C_H1 Exon und einem Hinge Exon wird mit Pst1 und BamH1 gespalten und mit dem als Pst1 BamH1 Fragment aus V_Hb PCR ausge­schnittenem V_Hb Genfragment ligiert (Fig. 10). Es ent­steht das Plasmid X.

[0025] Das Plasmid X wird mit Pst1 gespalten und mit dem eben­falls mit PstI aus dem Plasmid L ausgeschnittenen Linkerfragment ligiert (Fig. 11). Mit Hilfe der Nuklein­säuresequenzanalyse wird der Klon Z identifiziert, bei dem der Linker in der richtigen Orientierung zwischen C_H1 und V_Hb kloniert ist, ohne den Intron/Exonübergang zwischen Intron 3 und Linkerexon und ohne das Leseraster am Übergang zwischen Linker und V_Hb Gen zu stören.

[0026] Das Plasmid pEVa C wird mit BamH1 gespalten und mit dem mit BamH1 aus dem Plasmid M ausgeschnittenen Fragment M ligiert. Durch Restriktionsanalyse wird der Klon Y identifiziert, der das Fragment M in der richtigen Orientierung enthält (Fig. 12).

[0027] Das Plasmid Y wird partiell mit BamH1 gespalten und mit dem durch HindIII und BamH1 Spaltung aus dem Plasmid X ausgeschnittenen Fragment (C_H1-Linker-V_Hb) nach Auffül­len aller Enden ligiert. Durch Nukleotidsequenzanalyse und Restriktionskartierung wird der Plasmidklon PEVT identifiziert, der das Fusionsgen V_Ha C_H1-Linker-V_Hb C_H1 mit der richtigen Orientierung aller Exons enthält (Fig. 13).

[0028] Das Plasmid PEVT wird zusammen mit Plasmiden, die die Gene für die leichten Ketten der Antikörper a bzw. b tragen, in geeignete eukaryontische Expressionszellen transfiziert, um das Antikörper a F(ab) Antikörper b F(ab) Fusionsprotein auszuprägen.

Beispiel 3: Transfektion der leichten und schweren Ketten-Gene zweier verschiedener MAk (4 Gene)

[0029] Die Isolierung von Immunglobulingenen ist in der deut­schen Patentanmeldung P 39 09 799.4 beschrieben.

[0030] Die in Vektoren klonierten Gene wurden mittels Elektro­poration nach Linearisierung der Vektoren in X63Ag8.653 Myelomzellen transfiziert (H. Stopper et al., Biochem. Biophys. Acta 900 (1987), 38-44). Die in Selektivmedien ausgewachsenen Transfektome wurden auf Produktion von bispezifischem-monovalentem MAk in einem spezifischen RIA überprüft. Dieser RIA bestand aus Festphasen-adsor­biertem TAA, auf welchen nach Blockade der unspezi­fischen "sites" durch Casein die zu testenden Trans­fektomüberstände gegeben wurden. Nach Zugabe von mit Y⁹⁰ oder ^99mTc komplexiertem DTPA oder EDTA und Wegwaschen des Überschusses konnten diejenigen Transfektome, die bispezifischen-monovalenten anti TAA x anti EDTA MAk ausschieden, an einem erhöhten radioaktiven Signal auf der Festphase detektiert werden.

[0031] Transfektom 9 wurde stabilisiert durch "limited dilu­tion" Klonierung und in Zellkultur aufgebaut. Zellkulturüberstände wurden 10fach ankonzentriert, der MAk-Anteil wurde über Protein A chromatographiert (P.L. Ey et al., Immunochemistry 15, (1978), 429) gereinigt und der den bispezifisch-monovalenten MAk enthaltende Anteil mittels Anionenaustauscher-Chromatographie gereinigt. (J. Van Dijk et al., Int. J. Cancer 43, (1989), 344-349).

Beispiel 4: Biologische Wirksamkeit

[0032] Gereinigtes, den bispezifischen-monovalenten MAk (BW 431/26 x BW 2050/174) enthaltendes Protein wurde in 500 µg Dosen an den Tagen 0, 3, 5, 8, 10 und 12 i.v. in human Tumorxenografts (CoCa 4) tragende Nacktmäuse injiziert. An Tag 27-30 erhielten die Tiere je 50 µCi EDTA-Y90 i.v. injiziert. Eine 2. Gruppe von Tieren erhielt an den gleichen Tagen anstatt des bispezifischen MAk 500 µg des MAk BW 431/26 und, wie oben beschrieben, die EDTA-Y90-Injektionen.

[0033] Eine dritte mit Tumor bestückte Gruppe erhielt anstatt des MAk und des EDTA-Y90 Injektionen von PBS (Tumor­wachstumskontrolle).
Das Tumorwachstum wurde über 6 Wochen verfolgt. Die Injektion von EDTA-Y90 führte in der Gruppe, die den bispezifischen-monovalenten MAk erhielt, zu einer signi­fikanten Tumorwachstumsinhibition, wohingegen die mit MAk BW 431/26 injizierten und mit EDTA-Y90 behandelten Tiere keine Tumorwachstumsinhibition zeigten, im Ver­gleich zu den Tieren, die nur PBS erhielten.

[0034] Diese Daten weisen auf die selektive tumortherapeutische Wirksamkeit des bispezifischen-monovalenten MAk in Kombination mit EDTA-Y90 als toxischem Prinzip hin.

[0035] Noch günstigere tumortherapeutische Effekte werden durch die oligovalenten/bispezifischen oder oligospezifischen Rezeptoren erhalten, da sie aufgrund der bivalenten Bindung an TAA länger am Tumor verweilen und somit der Ligand ebenfalls länger und in höherer Konzentrationen am Tumor zurückgehalten wird.

Beispiel 5: Optimierung der biologischen Wirksamkeit bi-­oder oligospezifischer Makromoleküle durch Aviditätser­höhung des anti-Komplexonarmes.

[0036] Ein entscheidender Faktor, der die effiziente Anheftung des hydrophilen, sich extrazellulär verteilenden Kom­plexons am anti-Komplexonarm des oligospezifischen Makromoleküls beeinflußt, ist die Avidität dieses Armes zum Komplexon. Die Aviditäten von monoklonalen Antikör­pern zu ihren entsprechenden Epitopen liegen im Bereich von 10⁵ - 10¹¹ l/mol. Da diese Bindungsstärken viel­leicht nicht ausreichen, um die für eine effiziente Radioimmuntherapie notwendige Komplexonmasse am Tumor zu lokalisieren, wurde im folgenden Beispiel die extrem starke Interaktion des fos-Leucin-Reißverschlußpeptids (fos-Peptid) mit dem jun-Leucin-Reißverschlußpeptid (jun-Peptid) genutzt (Erin K. O'Shera et al., Science, 245, 1989), um das Komplexon möglichst fest am anti Komplexonarm zu fixieren. Um diese starke fos-jun Interaktion nutzen zu können, muß vorzugsweise das fos-Peptid kovalent mit dem Komplexon (DTPA) verknüpft werden. Hierzu kann im ersten Schritt isothiocyanato­benzyl DTPA mit Hydrazin (oder einem Diaminoalkan) umgesetzt werden. Das so entstandene DTPA-Benzyl-thio­carbazid kann in einem 2. Schritt mit N-(gamma-maleimi­dobutyryloxy)succinimid oder einem Analogon zu DTPA-­Benzyl-(gamma-maleimidobutyryl) thiocarbazid umgesetzt werden. In einem 3. Schritt wird dann diese Verbindung mit dem um Glycin-Glycin-Cystein verlängerten fos-Peptid (Bild 1) über die freie SH-Gruppe des aminoterminalen Cysteins verknupft. Das so entstandene fos-Peptid-DTPA-­Konjugat wird in einem 4. Schritt mit Yttriumchlorid komplexiert. Der so entstandene fos-Peptid-DTPA-Y-Kon­jugatkomplex kann dann zur in vivo Anlagerung an den jun-peptid-Arm des bi- oder oligo-spezifischen Makromo­leküls benutzt werden. Nachfolgend ist die Synthese des oben vorskizzierten Beispiels im Detail beschrieben:

A) Herstellung des fos-EDTA-Y-Konjugat-Komplexes

Schritt 1:

Synthese von EDTA-Benzyl-thiocarbazid

[0037] Isothiccyanatobenzyl-EDTA (SCN-Bn-ETPA) (30 mg, 54 µmol) wurde 1 h lang in 10 % (v/v) wäßrigem Hydrazin gerührt. Dann wurde das Losungsmittel im Hochvakuum entfernt, der Rückstand über Phosphorpentoxid im Hochvakuum getrocknet und schließlich lyophilisiert. Das Produkt wurde mit DOWEX WX 2 (H+-Form) neutralisiert und erneut lyophili­siert (Ausbeute 28 mg).

Schritt 2:

Synthese von EDTA-Benzyl-(gamma-maleimidobutyryl)thiocar­bazid

[0038] Das in Schritt 1 hergestellte ETPA-Benzyl-thiocarbazid (20 mg; 34 µmol) und N-(gamma-Maleimidobutyryloxy)succi­nimid (8 mg, 29 µmol = 0.9 equiv.) wurden 1 h lang in wasserfreiem Dimethylformamid gerührt. Dann wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.

Schritt 3:

Kopplung des EDTA-Benzyl-(gamma-maleimidobutyryl)thiocar­bazid an aminoterminales Cystein im fos-Peptid

[0039] Eine Lösung des fos-peptids (4.8 mg, 1 µmol) (siehe Schritt 3.1) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (2 ml) wurde mit einer Suspension des gemäß Schritt 2 gewonnenen Produktgemisches (4 mg) in Dimethylformamid (400 µl) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch über eine Sephadex G15-Säule in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung Gel-fil­triert. Das proteinhaltige Eluat wurde gesammelt und bei -30° C präserviert (Ausbeute 4.2 mg).

Schritt 3.1:

Aminosäuresequenz des fos-Peptids (| |) mit N-termina­ler GGC Verlängerung.

[0040] Ac-CGGyLTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAYy Die Buchstaben stehen für folgende Aminosäuren: A = Alanin, C = Cystein, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, G = Glycin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M Methionin, N = Asparagin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, Y = Tyrosin.

[0041] Die Oligopeptidsynthese erfolgte mittels eines automati­schen Peptid-Synthesizers (Applied Biosystems Model 430A) entsprechend der Merryfield Festphasen Methode (Stewart und Young. Solid Phase Synthesis. Pierce Chemical Company. 2. Edition. Rockford III.) mit der tert-butyloxycarbonyl Schutzgruppe. Die Oligopeptide wurden von dem Phenylacetamidomethylpolystyrene-Träger abgespalten. Nach Abspaltung der Schutzgruppen (Tom et al. 1983, J. Am. Chem. Soc. 105, 6442-6455) wurden die Oligopeptide über reversed phase Chromatographie (PepRPC-Säule, Pharmacia) wie bei Rivier et al. (J. Chromatography 288, 303-328, 1984) beschrieben gereinigt.

Schritt 4:

Herstellung eines fos-Peptid-EDTA-Yttrium-Chelats mit einem nach Schritt 3 hergestellten fos-peptid-EDTA-Kon­jugates

[0042] Das gemäß Schritt 3 hergestellte fos-Peptid-EDTA-Konju­gat (4.2 mg) wurde gegen isotonische Kochsalzlösung/0.1 M Natriumcitrat, pH 7.0, in einem Dialyseschlauch mit Ausschlußgrenze, m.w. 1000 (Spectrum) dialysiert und mit 6 mg Yttriumchlorid, die in 3 ml isotonischer Kochsalzlösung/0.1 M Natriumcitrat, pH 7.0, gelöst waren, versetzt. Nach 1 h wurde gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung rückdialysiert und die Chelatlösung bei -30° C präserviert. Das im obigen Beispiel beschriebene fos-Peptid-EDTA-Yttrium-Chelat wird dann als Ligand benutzt, um mit hoher Avidität an den jun-Peptid-Arm des bi- oder oligospezifischen Makro­moleküles zu binden. Die Konstruktion eines für diese Interaktion besonders gut geeigneten bispezifischen Makromoleküles ist im folgenden Beispiel beschrieben.

B) Konstruktion des MAk-jun Fusionsmoleküles

[0043] Die hier verwendeten Techniken wurden, wenn nicht anders angezeigt, aus Maniatis et al. (Laboratory Manual EMBL (1982), Heidelberg, und Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) entnommen.

Schritt 1:

[0044] Ein humanes IgG3 C-Gen wurde aus einer humanen Genbank in EMBL 3 Phagen isoliert (A.M. Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170, 827-842, 1983 und G.H.A. Seemann et al., The EMBO Journal 5, 547-552, 1986). Aus diesem IgG3 C-Gen wurde, wie in der deutschen Patentanmeldung P 3825615.0 beschrieben, eine Konstruktion (D) herge­stellt, die nur noch das CH1 Exon und das erste Hinge Exon des IgG3 C-Gens enthält (Fig. 14).

[0045] Aus der gleichen Genbank wurde, wie ebenfalls in der deutschen Patentanmeldung P 3825615.0 beschrieben, ein humanes HLA B27k Gen isoliert. Aus diesem HLA B27w Gen wurde ein Konstrukt (E) hergestellt, das nur noch das C3 Exon und den 3′ NT Bereich des HLA B27k Gens enthält (Fig. 15).

Schritt 2:

[0046] Das C1 Exon und der 3′ NT Bereich des HLA B27k Gens wurden mit Xba1 aus dem Plasmid E herausgeschnitten, das Fragment isoliert und in die Xba1 Schnittstelle des Konstruktes D kloniert. Durch Restriktionsanalyse und Nukleinsäuresequenzanalyse wurde der Klon F identifi­ziert, der das C3 Exon und den 3′ NT Bereich des HLA B27c Gens in der korrekten 5′-3′ Orientierung 3′ vom IgG3 C-Gen Fragment enthält (Fig. 16).

Schritt 3:

[0047] Das Insert des Klons F wird unter Verwendung der Endonu­kleasen Hind III und Eco RI aus dem Plasmid ausgeschnit­ten und zwischen die Hind III und Eco RI Schnittstellen eines M13mp18 Doppelstrang (DS)-Phagen kloniert. Es wird der Phagenklon G isoliert, der das Antikörper/HLA Fusiongenfragment enthält (Fig. 17).

Schritt 4:

[0048] Vom Phagenklon G werden nach der Methode von T.A. Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Science, U.S.A., 82, 488-492, Uracileinzelstränge präpariert. Die Einzel­strangphagen wurden mit den mutagenen Oligonukleotiden 1 und 2 (Tab. 6) hybridisiert und die Lücken zwischen den Oligonukleotiden mit Klenon DNA Polymerase und T4 Ligase geschlossen. Nach Transformation in E. coli wurde durch Restriktionsanalyse und Nukleinsäuresequenzanalyse ein Phagenklon identifiziert (G), bei dem die Sst1 Restrik­tionsschnittstelle am 5′ Ende des Hinge Exons deletiert wurde. Gleichzeitig wurden am 3′ Ende des Hinge Exons eine Sst1 und eine Sph1 Restriktionsschnittstelle eingeführt (Fig. 18). Zur Deletion der Sst1 Schnitt­stelle wurde die dritte Base des 2. Codons des Hinge Exons von C in G umgewandelt und für die Einführung der Sst1 und Sph1 Schnittstellen wurden zwischen dem 15. und 16. Codon des Hinge Exons die Basen 5′GAGCTCGGGGCA3′ eingeführt (Tab. 7).

Schritt 5:

[0049] Doppelstrang DNA des Phagenklons G′ wird mit Sph1 vollständig und mit Sst1 partiell gespalten. Die syn­thetischen Oligonukleotide Jun I und Jun II (Tab. 8) werden zu einem Doppelstrang DNA Fragment zusammenge­fügt, welches an seinen Enden je eine geschnittene Sph1 und Sst1 Restriktionsschnittstelle enthält und für ein Peptid kodiert, das den Jun Leucin Zipper enthält (O'Shea et al., Science, 245, 646-648, 1989).

[0050] Das doppelsträngige DNA Fragment wird in die Sst1 und Sph1 Restriktionsschnittstellen des F′ Phagenklons kloniert und der Phagenklon H identifiziert, der ein Genkonstrukt enthält, bei dem im Hinge Exon die Sequenz für das Jun Zipper Peptid inseriert ist (Fig. 19).

Schritt 6:

[0051] Das Insert des dS Phagen H wurde mit den Restriktionsen­donukleasen Hind III und Eco RI ausgeschnitten, die Enden mit T4 Polymerase aufgefüllt und in einen Sma1 gespaltenen KsF Vektor (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla California 92037) kloniert. Es wurde der Plasmidklon I identifiziert, der das Antikör­per/Jun/HLA Fusionsgen in der Orientierung enthält (Fig. 20), in der es auf beiden Seiten von einer BamH1 Schnittstelle flankiert wird.

Schritt 7:

[0052] Das Antikörper/Jun/HLA Fusionsgen wurde mit BamH1 aus dem KS Klon H1 ausgeschnitten und in das Expressions­plasmid pABStop (Behringwerke AG) kloniert, welches ein spezifisches funktionelles Immunglobulin V-Gen enthält. Das spezifische V-Gen wurde, wie in der Patentanmeldung P 3909799.4 beschrieben, gewonnen. Es wurde das Expres­sionsplasmid I identifiziert, das das Antikörper/Jun/HLA Fusionsgenkonstrukt in der korrekten Orientierung hinter dem V_H Gen enthält (Fig. 21).

[0053] Die Kotransformation des Plasmids I mit einem Plasmid, der das Gen für die leichte Kette des spezifischen MAk enthält und einen Plasmid, der ein Resistenzgen trägt, führt zur Expression eines spezifischen Antikörper F(ab′)2 Fragmentes, das in der Hinge Region zwei Jun Zipper Peptide enthält, wobei das Jun Zipper Peptid so verändert ist, daß keine Homodimerbildung (Jun/Jun) mehr stattfindet.

Beispiel 6:

Optimierung der bi- oder oligospezifischen Rezeptormenge am Tumor und Minimierung derselben im Blut bzw. den Normalgeweben.

[0054] Wissenschaftliche Untersuchungen anderer haben gezeigt, daß die Penetration von soliden Tumoren mit Makromole­külen > 50 kDa langsam von statten geht und meist nur die Randregion bzw. einige wenige Areale im Tumor erreicht werden. Diese Untersuchungen basieren auf Experimenten, die eine einmalige Injektion niedriger Mengen von Makromolekülen beinhalten. Im Gegensatz hierzu haben wir gefunden, daß durch repetitive i.v.-­Injektion großer Mengen von bi- oder oligospezifischen Rezeptoren (10 x 250 µg Rezeptor/Maus für 10 Tage) eine weitgehende Durchdringung der gesamten Tumormasse in Nacktmaus-Xenografts möglich ist. Des weiteren bleiben die bi- oder oligospezifischen Rezeptoren aufgrund ihrer spezifischen Bindung an TAA für lange Zeiträume (> 20 Tage) in großen Mengen an der Tumorzellmembran und im Tumorinterstitium hängen. Diese Befunde wurden mittels der indirekten alkalischen Phosphatasetechnik an kryopräservierten Dünnschnitten von humanen Colon- und Pankreas-Tumor-Xenografts erhoben.

[0055] Während dieser Zeit (schon nach 10 Tagen) wurden die bi- oder oligospezifischen Rezeptormoleküle aus den TAA-ne­gativen Normalgeweben und dem Blut durch Abbau und Ausscheidung bereits eliminiert. Um diesen Eliminations­zeitraum zu verkürzen, wurde ein anti-idiotypischer MAk (anti Id), der nur mit dem anti TAA-Arm nicht gebundener bi- oder oligospezifischer Rezeptormoleküle reagiert, 24 Stunden nach Beendigung der 10 x Injektion von bi- oder oligospezifischen Rezeptoren i.v. injiziert (1 x50 µg anti Id). Diese einmalige Injektion bewirkte eine beschleunigte Elimination der ungebundenen bi- oder oligospezifischen Rezeptormoleküle aus dem Blut und eine schnellere Metabolisierung in Leber und Milz.

[0056] Aufgrund dieser Manipulation kann die Injektion des Komplexons (EDTA-Y90) schon 4 Tage nach Beendigung der Penetrations- und Bindungsphase des bi- oder oligospezi­fischen Rezeptors erfolgen. Aus diesen Untersuchungen leitet sich folgendes Behandlungsschema (für Nacktmäuse) ab:

a) Tag 1-10, i.v. Injektion von je 1x250 µg bi- oder oligospezifischem Rezeptor

b) Tag 11, i.v. Injektion von 1x50 µg anti Id

c) Tag 14, i.v. Injektion einer therapeutischeen Dosis von EDTA-Y90.

[0057] Aufgrund vergleichender immunszintigraphischer Daten in Nacktmäusen bzw. Tumorpatienten sollte dieses Schema auch für die Tumortherapie im Menschen geeignet sein. Allerdings bewegen sich die im Humansystem zu injizierenden Mengen in einer anderen Größenordnung. 10x 5-10 g bispez. Rezeptor, 1x1 g anti Id. Die Injektion des anti Id ist für die Therapie nicht zwingend.

Anlage 1a

Quantitative Inhibition-ELISA für MAk durch DTPA bzw. EDTA Komplexe

[0058] Material: Teilbare 96-well Polystyrol Mikrotiterplatten (U-Form) Typ B, Fa. Nunc, Nr. 4-60445

1) Pro well werden 50 µl Y Benzyl-DTPA-HSA 19-Konjugat mit einer Konz. von 1 µg Konjugat pro ml PBS, pH 7.2, pipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.

2) Der Überstand wird abgesaugt und 3x mit 0.05 M Tris-­Citrat- Puffer, pH 7.4, (Waschlsg. 1) gewaschen; (1x waschen = 250 µl Waschlösung pro well einfüllen, 2 min stehen lassen, absaugen)

3) Wenn die Mikrotiterplatte nicht direkt benötigt wird, wird sie über Nacht auf Zellstoff bei RT stehenge­lassen (Öffnung nach unten). Danach wird die Platte in Folien mit Trockenpatronen eingeschweißt (Fa. Gaplast, Postfach 529, 8100 Garmisch-Partenkirchen). Unter diesen Bedingungen sind die Platten bei +4° C mindestens 8 Wochen haltbar.

4) 250 µl Blocklösung werden pro well aufgetragen und 30 min bei 37° C inkubiert.

5) Während des Blockierens erfolgt die Vorinkubation des verdünnten Hybridomüberstandes mit dem Kompetitor (siehe Anlage 2).

6) Von den zu testenden, entsprechend vorverdünnten und vorinkubierten Hybridomaüberständen werden pro well 50 µl aufgetragen und 30 min bei RT inkubiert.

7) Anschließend wird 3x mit Waschlösung 2 gewaschen.

8) Anschließend werden 50 µl 1:500 in Blocklösung ver­dünnter, mit alkalischer Phosphatase markierter Ziege anti Maus IgG₁-Antikörper pro well aufgetragen und 30 min bei RT inkubiert.

9) Danach wird 3x mit Waschlösung für Enzygnost gewa­schen.

10) Anschließend werden 50 µl 0,1 mM NADP zugegeben.

11) Danach wird 30 min bei RT inkubiert.

12) Während der Inkubation mit NADP wird das Verstärkersystem wie folgt angesetzt:
pro Platte werden zu 2 Teilen INT und 1 Teil PBS, pH 7.2, zugegeben, des weiteren 1 Teil Diaphorase, des weiteren wird 1 Teil ADH zupipettiert.

13) 50 µl dieses Verstärkersystems werden pro well zugegeben.

14) Bei deutlichem Farbumschlag von durchsichtig nach rot wird die Reaktion mit 100 µl einer 0,1 N H₂SO₄-Lösung pro well abgestoppt.

15) Die Extinktionen werden bei 492 nm im TITERTEK^R MULTISCAN vermessen. Als Blankwert werden 50 µl NADP mit 50 µl Verstärkerlösung und 100 µl 0,1 N H₂SO₄ eingesetzt.

[0059] NADP - Fa. Sigma Best.Nr. N-0505
INT - Fa. Sigma Best.Nr. I-8377
ADH - Fa. Sigma Best.Nr. A-3263
DIAPHORASE - Fa. Sigma Best.Nr. D-2381
Waschlösung 2 - Fa. Behring, Best.Nr. OSEW96,
enthält Tween/PBS

Blocklösung:

[0060] PBS, pH 7.2, wird durch Zugabe von Casein und 30minüti­ges Einrühren 3%ig an Casein gemacht und auf pH 7.4 eingestellt. Danach werden Partikel 10′ bei 4000 U/min abzentrifugiert.

[0061] Verdünnter mit alkalischer Phosphatase markierter Ziege anti Maus IgG₁-Antikörper (Fa. Southern Biotechnology Associates, Cat.Nr. 1080-04)
Herstellung von 0.1 mM NADP:
7.65 mg NADP lösen in 100 ml 20 mM Tris, 0.1 mM MgSO₄, pH 9.5; die Lösung kann bei -20° C mehrere Monate gelagert werden.
Herstellung von INT (P-IODO NITROTETRAZOLIUM Violet):
2.5 mg/ml 30%igem Ethanol im Ultraschallbad lösen; immer frisch ansetzen.
Herstellung von Diaphorase:
1 mg Diaphorase/ml PBS, pH 7.2, wird portioniert bei -20° C gelagert.
Herstellung von Alkoholdehydrogenase:
0.5 mg ADH/ml PBS, pH 7.2, werden portioniert bei -20° C gelagert.

Anlage 1b

Vorinkubation des Hybridomüberstandes mit dem Kompetitor

[0062] Die Maus IgG Konzentrationsbestimmung in Hybridomüber­ständen kann mittels kommerziell erhältlicher quantita­tiver ELISA Testsysteme bestimmt werden und ist Stand der Technik.

[0063] Anhand der Konzentrationsbestimmung im ELISA werden die Hybridomüberstände auf 1.25 µg/ml in PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ verdünnt.
Umrechnung von Gramm in Mol:
150 000 g - 1 Mol MAk
1.25 x 10⁻⁶ g- xMol
1.25 µg = x = 8.33 10⁻¹² Mol

[0064] Um ein Verhältnis 1+1 von MAk und Inhibitor zu haben, wurden zu 50 µ1 Hybridomüberstand mit einer Konzentration von 8.33 x 10⁻¹² Mol/ml 10 µl Inhibitor mit einer um den Faktor 5 erhöhten Konzentration von 8.33 x 10⁻¹² Mol/200 µl gegebenen.

[0065] Der Hybridomüberstand wird mit 100 000fachem, 50 000­fachem, 10 000fachem, 5 000 fachem, 1 000 fachem und 100fachem Kompetitorüberschuß für 30′ bei RT inkubiert. Hiervon werden 50 µ1 in den ELISA (siehe Anlage 1a, Punkt 6) pipettiert.

Anlage 1c

Erzeugung der DTPA- bzw. EDTA-Komplexe

[0066] Die Komplex-Konstante von DTPA bzw. EDTA zu den in Tabelle I dargestellten Metallionen ist extrem hoch, so daß bei äquimolarer Mischung von DTPA bzw. EDTA mit diesen Metallionen eine komplette Sättigung zu erwarten ist. Die entsprechenden Metallionen wurden deswegen in einem 3fachen molaren Überschuß mit den DTPA bzw. EDTA inkubiert. Als Beispiel wurden 170 µl einer 10 mM Cadmiumsulfatlösung in bidest (siehe Anlage 1d) mit 30 µl einer 0.028 molaren DTPA-Stammlösung in bidest für 5′ bei RT inkubiert. Zumischung von 10 µl dieser Kompetitorlösung zu dem Hybridomüberstand führt zu einem 100000fachen Überschuß an Kompetitor über den im Hybridomüberstand enthaltenen MAk. Niedrigere Kompetitor zu MAk Verhältnisse wurden dadurch erzielt, daß die Kompetitorlösung entsprechend dem gewünschten molaren Überschuß (siehe Anlage 1b) in der jeweiligen Salzio­nenlösung verdünnt wurde.

Anlage 1d

Quelle und relevante physicochemische Parameter der eingesetzten Metallionen

[0067] Von folgenden Metallionen wurden 10m molare Lösungen in bidest hergestellt:

Manganchlorid (?)	MG 161,88
Fa. Merck	Nr. 5934	Ionenradius Mn: 80 pm
Cadmiumsulfate	MG 256,5
Riedel de Haen	Nr. 31145	Ionenradius Cd: 97 pm
Zinkchlorid	MG 136,28
Fa. Merck	Nr. 8816	Ionenradius Zn: 74 pm
Kupfersulfat	Mg 159,61
Fa. Riedel de Haen	Nr. 31294	Ionenradius Cu: 96 pm
Yttriumchlorid	MG 303,36
Fa. Aldrich	Nr. 20,491-9	Ionenradius Y: 92 pm
Blei(II)-nitrat	MG 331,20
Fa. Riedel de Haen	Nr. 31137	Ionenradius Pb: 120 pm

Anlage 1e

Quantitativer Inhibitionstest von MAk durch DTPA bzw. EDTA

[0068] molarer Überschuß an Kompetitor der zu 50 % Inhibition der Bindung an das Festphasenantigen führt.

MAK-Nr.	DTPA-Y	DTPA	DTPA-Mn	DTPA-Cd	DTPA-Zn	DTPA-Cu
2050/174	10⁴	10³	10²	10²	5x10³	5x10³
2050/531	5x10⁴	10³	10²	10²	5x10³	5x10³
2050/532	5x10⁴	10³	10²	10²	5x10³	5x10³
2050/534	5x10⁴	10³	10²	10²	5x10³	5x¹⁰³
2050/535	10⁴	10²	10²	10²	10³	10³

MAK-Nr.	DTPA-Pb	1.2.Diaminoethan	Transaconitsäure	EDTA-Y	EDTA	EDTA-Mn
2050/174	10³	keine Inhibition bis 10⁵	keine Inhibition bis 10⁵	10²	10³	10³
2050/531	5x10³	"	"	10³	10³	10³
2050/532	5x10³	"	"	10²	10³	10³
2050/534	5x10³	"	"	10²	10³	10²
2050/535	10³	"	"	10²	10²	10²

MAK-Nr.	EDTA-Cd	EDTA-Zn	EDTA-Cu	EDTA-Pb
2050/174	10³	10³	10³	5x10³
2050/531	10³	10³	10²	10⁵
2050/532	10³	10³	5x10³	10⁵
2050/534	10²	10³	10³	5x10³
2050/535	10²	10²	10²	10²

Tab. 6

Mutagene Oligonukleotide:

[0069] 

1) 5′CTTACCTGGG.CATGCCCCGA.GCTCCCGTGG.GCATGT3′

2) 5′AGTGGGGTTT.TCAGCTCTGCAGAG3′

Ansprüche

1. Bispezifische oder oligospezifische mono- oder oligo­valente Rezeptoren, gentechnisch erhältlich durch Fusion von für V_H und C_H1 Regionen der Antikörper zweier oder mehrerer verschiedener Spezifitäten kodierende DNA mittels geeigneter Linker und an­schließende Expression zusammen mit den dazugehörenden Genabschnitten für die leichten Ketten in Expressions­systemen.

2. Rezeptoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität gegen animale oder humane tumor­assoziierte Antigene gerichtet ist.

3. Rezeptoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität katalytische oder enzymatische Aktivität besitzt.

4. Rezeptoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität gegen animale oder humane tumor­assoziierte Antigene gerichtet ist und eine andere Spezifität gegen ein Komplexon gerichtet ist.

5. Rezeptoren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexonbindung am Rezeptor-Komplexon-Arm über fos-jun Interaktion erfolgt.

6. Rezeptoren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität von den mono­klonalen Antikörpern mit den variablen Regionen gemäß Tab. 2, 3, 4 oder 5 stammt.

7. Rezeptoren nach Anspruch 1, 2, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Spezifitäten drei Bin­dungsstellen vorhanden sind.

8. Rezeptoren, nach Anspruch 1, 2, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei Spezifitäten 4 Bindungs­stellen vorhanden sind.

9. Rezeptoren nach Anspruch 1, 2, 4, 5, oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei drei Spezifitäten eine gegen Tumore gerichtet ist und die beiden anderen in unter­schiedlicher Weise gegen DTPA oder EDTA gerichtet sind.

10. Verfahren zur Herstellung von Rezeptoren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für die schweren Ketten-Antikörperteile kodierenden DNA-Fragmente mittels Linker verbunden und in einem Expressionssystem zusammen mit den Genen für die leichten Ketten exprimiert werden.

11. Rezeptoren nach Anspruch 1 bis 9 als Arzneimittel.

Ansprüche

Patentansprüche für folgende(n) Vertragsstaat(en): ES und GR

1. Verfahren zur gentechnischen Herstellung eines bispezi­fischen oder oligospezifischen mono- oder oligo­valenten Rezeptors, dadurch gekennzeichnet, daß die für die schweren Ketten-Antikörperteile kodierenden DNA-Fragmente mittels Linker verbunden und in einem Expressionssystem zusammen mit den Genen für die leichten Ketten exprimiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität gegen animale oder humane tumor­assoziierte Antigene gerichtet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität katalytische oder enzymatische Aktivi­tät besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität gegen animale oder humane tumor­assoziierte Antigene gerichtet ist und eine andere Spezifität gegen ein Komplexon gerichtet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplexonbindung am Rezeptor-Komplexon-Arm über fos-jun Interaktion erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Spezifität von den mono­klonalen Antikörpern mit den variablen Regionen gemäß Tab. 2, 3, 4 oder 5 stammt.

Zeichnung