La présente invention concerne un procédé d'obtention d'irone, dont les mélanges des trois isomères, α, β et γ, sont utilisés dans l'industrie alimentaire, celle des parfums et des cosmétiques, pour leur odeur de violette.
Lors de leur récolte, les rhizomes d'iris ne contiennent pratiquemment pas d'irone et c'est au cours d'un stockage prolongé que les molécules odorantes apparaissent, d'après Z. Naturforsch. 38c 179-184 (1983), vraisemblablement par dégradation oxydative de terpénoïdes.
Dans le procédé classique de préparation d'irone, cette oxydation s'effectue très lentement dans les rhizomes décortiqués, conservés dans des lieux frais et aérés, et on doit attendre plus de deux ans après la récolte pour extraire une quantité raisonnable d'irone des rhizomes par un solvant organique ou par entraînement à la vapeur.
Néanmoins, il a été montré récemment dans la demande FR-A-2 620 702 que l'oxydation chimique des précurseurs, en particulier triterpéniques, extraits des rhizomes par un solvant lipophile sans attendre leur maturation, permettait d'obtenir l'irone dans des conditions économiquement intéressantes. En effet, les rendements en irone extrait par rapport à l'unité de poids de rhizome sec sont supérieurs dans ce procédé qui, en outre, n'implique ni le décortiquage des rhizomes, nécessaire pour que la maturation à l'air s'effectue convenablement, ni leur conservation prolongée.
Le procédé selon l'invention implique aussi l'oxydation des précurseurs extraits des rhizomes dès leur récolte, mais sans que la durée écoulée soit critique et, après éventuellement leur séchage à l'air, pour éliminer une partie de l'eau et faciliter leur transport. Cette oxydation n'est plus effectuée par voie chimique, ce qui interdit l'utilisation de l'irone obtenue dans l'industrie alimentaire, mais par voie enzymatique en présence d'un système peroxydant. Ce procédé, dont la mise en oeuvre est particulièrement simple, permet d'obtenir l'irone avec des rendements d'au moins trois fois ceux du procédé classique.
Selon l'invention, on extrait les précurseurs des rhizomes d'iris frais, plus ou moins desséchés, par un solvant des molécules lipophiles, et on soumet le résidu d'extraction à l'action d'un système enzymatique peroxydant comprenant de l'eau oxygénée et une peroxydase, ou de l'oxygène et une lipoxygènase, éventuellement en présence d'un substrat de l'enzyme, par exemple l'acide dihydroxyfumarique ou l'acide ascorbique pour la peroxydase ou d'un acide carboxylique aliphatique insaturé, susceptible de donner en présence de la lipoxygènase un hydroperoxyde, comme l'acide linoléique, l'acide linolénique ou l'acide arachidonique.
La première étape d'extraction des précurseurs terpéniques des rhizomes est effectuée sur les rhizomes concassés ou même broyés, de préférence avec un solvant lipophile généralement utilisé dans l'industrie des arômes, tel qu'un solvant alcoolique, le méthanol ou l'éthanol, un solvant chloré, le chlorure de méthylène ou le dichloréthane, ou un hydrocarbure aromatique ou aliphatique, comme le benzène ou l'hexane, en général à la température de reflux du solvant; on peut éventuellement utiliser des mélanges de solvant ou faire deux extractions successives avec des solvants différents. Il est préférable d'utiliser des solvants alcooliques ou chlorés, qui sont de meilleurs solvants des composés terpéniques que les hydrocarbures, et mieux le méthanol et le chlorure de méthylène. On peut aussi, pour éliminer les composés hydrosolubles entraînés lors de cette extraction, redissoudre le résidu d'évaporation dans un solvant non miscible à l'eau, comme le chlorure de méthylène et laver la phase organique à l'eau, avant d'éliminer de nouveau le solvant organique.
La seconde étape d'oxydation enzymatique est effectuée dans des conditions classiques, dans l'eau, éventuellement en présence d'un agent tensioactif comme un ester de sorbitol et d'acide gras (Tween®) ou d'un tiers solvant améliorant la dispersibilité dans le milieu aqueux des molécules hydrophobes, sans dénaturer les enzymes, comme le dioxanne, le tétrahydrofuranne ou un alcool, à la température et au pH les plus favorables à l'activité de l'enzyme, en général entre 25°C et 35°C et à un pH alcalin.
On trouve des lipoxygènases dans de nombreux végétaux : l'aubergine, la tomate, la pomme de terre ou le soja; celle généralement utilisée qui est commerciale est la lipoxygènase de soja. Les peroxydases sont aussi présentes dans de nombreux végétaux, mais la plus courante est celle de radis noir; on peut aussi citer les manganèses peroxydases et les chloroperoxydases, isolables de différents micro-organismes ou la lactoperoxydase du lait.
On sait que l'irone formée est susceptible d'être dégradée par oxydation et la durée de la réaction ne sera pas prolongée au-delà du temps nécessaire à sa formation. Le spécialiste sera à même de déterminer, par des essais préalables, les concentrations des réactifs dans le milieu et la durée de la réaction les plus favorables; l'évolution de la réaction peut être suivie en chromatographie en phase gazeuse.
L'irone sera isolée par entraînement à la vapeur ou par extraction dans un solvant non miscible à l'eau.
Dans ce qui suit, on décrit des exemples de mise en oeuvre de l'invention.
2,5 kg de rhizomes d'iris Pallida d'Italie, séchés mais contenant encore 60% d'eau, sont nettoyés et mis dans un récipient en inox de 60 l comprenant un bloc rotatif central à lames avec 24 l d'éthanol à 96%; le mélange est maintenu 20 h à la température de reflux du solvant, puis ramené à température ambiante et filtré; le filtrat est concentré sous vide à siccité; les solides séparés sont remis dans le récipient avec 12 l de chlorure de méthylène et le mélange est maintenu pendant 20 h à la température de reflux du solvant, puis filtré à température ambiante, le filtrat est concentré sous vide à siccité et le résidu, réuni au précédent, est redissous dans 2 l de chlorure de méthylène. La phase organique est lavée deux fois à l'eau et évaporée à siccité pour donner 1 kg d'extrait sec, qui sera soumis à la peroxydation enzymatique.
10 g d'extrait sont mis en suspension dans 90 ml d'une solution aqueuse tamponnée avec du borate de sodium (0,01 M, pH 9,2); on ajoute 10 ml de dioxanne et 0,17 g de lipoxygènase de soja à 6 unités par mg, commercialisée par Fluka. Le mélange est maintenu, sous forte agitation, en atmosphère d'oxygène à 30°C pendant 24 h; on effectue alors un entraînement à la vapeur du milieu réactionnel, par environ 1 l d'eau; l'irone entraînée est dosée par chromatographie en phase gazeuse. On obtient ainsi 0,77 g d'irone par kg de poids sec de rhizome de départ.
Lorsque la réaction est prolongée durant 48 h, on obtient 1,8 g d'irone par kg de poids sec de rhizome; l'oxydation chimique donne sensiblement le même résultat.
On applique le même mode opératoire qu'à l'exemple 1, mais on introduit, lors de la 2ème étape dans le milieu réactionnel, de l'acide linolèique à la concentration 10⁻³M.
On obtient alors, après 24 h, 1,8 g d'irone et, si la réaction est prolongée jusqu'à 48 h, 2,2 g d'irone par kg de poids sec de rhizome de départ.
10 g d'extrait en solution dans 20 ml de dioxanne sont introduits dans 100 ml de tampon phosphate (pH 8, 10 mM) avec 40 mg de peroxydase de raifort, et 0,3 »mole d'eau oxygénée. La peroxydase a une activité enzymatique de 100 unités/mg, une unité correspondant à 1 »mole de gaïacol transformé par min et par mg d'enzyme. Après 60 h, l'irone formée est entraînée à la vapeur. On isole ainsi 680 mg d'irone par kg de poids sec de rhizome; sans enzyme, il ne se forme que 50 mg/kg d'irone.
On applique le même mode opératoire qu'à l'exemple 3, mais on introduit aussi dans le milieu 4,38 mg d'acide ascorbique. Il se forme alors en 24 h 400 mg/kg d'irone et en 60 h 450 mg/kg.