La présente invention a pour objet la mise en évidence de séquences nucléotidiques permettant notamment de distinguer, en terme de diagnostic, une immunisation résultant d'une vaccination par le BCG d'une infection par M. tuberculosis. Les séquences en question sont spécifiques soit de M. bovis BCG/ M. bovis, soit de M. tuberculosis. La présente invention a également pour objet un procédé de détection des séquences en question, un procédé pour la détection d'anticorps générés par les produits d'expression de ces séquences ainsi que les kits pour mettre en oeuvre ces procédés. Enfin, la présente demande de brevet a pour objet de nouveaux vaccins.
Le taux important de mortalité et de morbidité causé par Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, génère la nécessité de développer de nouveaux vaccins et des traitements chimio-thérapeutiques toujours plus courts. En effet, l'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux anti-tuberculeux et le risque accru chez les patients immunodéprimés, par exemple chez les patients atteints du sida, de développer une tuberculose, rend nécessaire la mise au point de méthodes rapides, spécifiques et fiables pour le diagnostic de la tuberculose et la mise au point de nouveaux vaccins. Le vaccin BCG conventionnel dérive d'une souche de Mycobacterium bovis qui a été atténuée par des passages en série répétés sur de l'agar de bile pomme de terre-glycérinox (Calmette, 1927 ; Bloom and Fine, 1994). Cependant, malgré presque 50 ans d'utilisation mondiale, la raison de l'atténuation de M. bovis BCG est encore inconnue. Des questions persistent quant à la protection conférée par le vaccin contre la tuberculose pulmonaire, avec une efficacité comprise entre 0 et 80 % (Fine, 1994). De plus, de nombreuses sous-souches de BCG existent et offrent des niveaux variés de protection contre la tuberculose dans un modèle de souris (Lagranderie et al., 1996). L'atténuation de la souche d'origine de M. bovis peut avoir été causée par des mutations dans le génome du bacille qui ont été sélectionnées durant les passages en série de la souche, mutations qui sont restées stables dans le génome. Cependant, comme la souche de M. bovis d'origine est perdue, la comparaison directe de cette dernière avec M. bovis BCG est impossible. Malgré cela, l'identification de différences génétiques entre M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis est susceptible de révéler des localisations dont l'altération aurait pu conduire à l'atténuation de M. bovis BCG.
L'ADN de M. tuberculosis a plus de 99,9 % d'homologie avec l'ADN des autres membres du complexe tuberculeux (M. bovis, M microti, M. africanum). Bien que très apparentées, ces souches peuvent être différenciées sur la base de leur gamme d'hôte, de leur virulence pour l'Homme et de leurs caractéristiques physiologiques (Heifets and Good, 1994). Comme dans le cas de l'atténuation du BCG, la base génétique pour les différences phénotypiques entre les bacilles tuberculeux est largement inconnue. Cependant, la richesse de l'information contenue dans la séquence génomique de M. tuberculosis H37Rv donnait lieu à penser que les variations génétiques entre les souches allaient être mises à jour (Cole et al., 1998). La comparaison génomique présente un outil puissant pour de telles recherches puisque les génomes entiers peuvent être étudiés de préférence à l'étude des gènes dans leur individualité. Une précédente étude comparative de M. bovis et M. bovis BCG par hybridation génomique soustractive a montré que trois régions, désignées RD1, RD2 et RD3 étaient délétées dans M. bovis BCG comparativement à M. bovis (Mahairas et al., 1996). Cependant, le rôle, le cas échéant, de ces régions dans l'atténuation de M. bovis BCG n'a pas été clairement établi. De façon similaire, d'autres études des différences génomiques entre M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis ont montré que de nombreuses localisations polymorphiques existaient entre ces souches (Philipp et al., 1996). Bien que la nature exacte de ces polymorphismes n'ait pas été éclaircie, des analyses supplémentaires ont révélé qu'un polymorphisme était dû à la délétion de 12,7 kb dans M. bovis et BCG comparativement à M. tuberculosis (Brosch et al., 1998). A partir de là, il apparaît qu'il existe deux classes de délétion : celles qui sont absentes de BCG mais présentes dans M. bovis et M. tuberculosis et celles qui sont absentes de M. bovis et BCG mais présentes dans M. tuberculosis.
La banque de chromosome artificiel bactérien (BAC) de M. tuberculosis H37Rv déposée à la CNCM sous le n° 1-1945 le 19 novembre 1997. et décrite dans la demande
La construction d'une banque BAC de M. bovis BCG-Pasteur (I-2049) est décrite ci-après ainsi que son utilisation, en conjonction avec la banque BAC de M. tuberculosis H37Rv (I-1945), en tant qu'outil pour les comparaisons génomiques. Avec cette approche, les inventeurs ont pu identifier de nouvelles délétions et insertions entre les bacilles tuberculeux ce qui permet d'avoir un aperçu dans deux génomes de la dynamique et de la différentiation dans le complexe de M. tuberculosis.
La voie principale pour extraire l'information biologique à partir du génome est la comparaison entre les génomes. La technologie des bio-puces ou « chips d'ADN » (Chee et al., 1996 ; DeRisi et al., 1997) décrite par exemple dans les
A l'issue d'expérimentations reportées ci-après, les inventeurs ont identifié 10 localisations ou loci qui sont absents dans M. bovis BCG comparativement à M. tuberculosis. Des hybridations avec l'ADN génomique de M. bovis ont révélé que 7 de ces loci étaient également délétés dans M. bovis comparativement à M. tuberculosis. Ainsi, dans le texte ci-après, à chaque fois qu'il sera question de caractéristiques communes au génome de M. bovis BCG et à celui de M. bovis, il sera indiqué qu'il s'agit du « génome de M. bovis BCG / M. bovis ».
Il s'est ensuite avéré que 3 des délétions spécifiques apparaissant dans M. bovis BCG étaient identiques aux régions RD1, RD2 et RD3 définies par l'équipe de Stover (Mahairas et al., 1996). Ainsi, en gardant la précédente nomenclature, les inventeurs ont appelé les 7 autres délétions du génome de M. bovis BCG / M. bovis, RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RD10.
D'autres délétions se sont révélées être spécifiques du génome de M. tuberculosis étant entendu que les séquences « correspondantes » étaient présentes chez M. bovis BCG l M. bovis ; elles ont été appelées RvD1 et RvD2 (Tableaux 1 et 2).
Les délétions RD5-RD10, RvD1 et RvD2 ont permis aux inventeurs d'identifier de manière approfondie la dynamique du génome dans le bacille tuberculeux et ont donné des indications relatives aux bases génétiques de la différentiation phénotypique du complexe. L'identification de RvD1 et RvD2 en tant que délétions du génome de M. tuberculosis H37Rv montre que le processus de délétion ne fonctionne pas dans un seul sens, et la perte d'informations peut donc avoir lieu à la fois dans les souches bovines et dans les souches humaines. On constate que 8 des 10 délétions détectées sont localisées dans une région du chromosome où la terminaison de la réplication a probablement lieu.
Les inventeurs ont ensuite, au sein de chaque région délétée, mis en évidence plusieurs ORFs (ou cadres ouverts de lecture) ou gènes et ils ont tenté de déterminer la fonction putative de chacun d'eux (Tableau 1).
La présente demande décrit des séquences nucléotidiques délétées du génome de M. bovis BCG / M. bovis et présentes dans le génome de M. tuberculosis ou inversement choisies parmi les ORFs et gènes suivants : Rv2346c, Rv2347c, Rv2348c, p/cC, plcb, p/cA, Rv2352c, Rv2353c, Rv3425, Rv3426, Rv3427c, Rv3428c, Rv1964. Rv1965. mce3, Rv1967, Rv1968, Rv1969, lprM, Rv1971, Rv1972, Rv1973, Rv1974, Rv1975, Rv1976c, Rv1977, ephA, Rv3618, Rv3619c, Rv3620c, Rv3621c, Rv3622c, lpqG, cobL, Rv2073c, Rv2074, Rv2075, echA1, Rv0223c, RvD1-ORF1, RvD1-ORF2, RvD1-Rv2024c, RvD2-plcD RvD2-ORF1, RvD2-ORF2, RvD2-ORF3, RvD2-Rv1758.
Par « séquence nucléotidique » selon la présente invention, on entend aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN.
Plus particulièrement, les séquences nucléotidiques ci-dessus énumérées sont regroupées en régions nucléotidiques selon la répartition suivante :
De façon intéressante, 3 des délétions (RD5, RD6 et RD8) contiennent 6 gènes codant pour des protéines PE et PPE. Comme il a été suggéré que ces protéines ont un rôle éventuel dans la variation antigénique (Cole et al., 1998), on peut en déduire que ces loci peuvent représenter des sites d'hypervariabilité entre les souches tuberculeuses.
Au moins 9 protéines susceptibles d'être exportées ou exposées à la surface sont codées par RD4 à RD10, ce qui indique que ces polypeptides ont peut-être un rôle important dans la reconnaissance immunitaire du bacille. Il a en effet été montré que des polypeptides sécrétés peuvent avoir un rôle de stimulateur potentiel dans le système immunitaire et ils sont susceptibles de jouer un rôle d'antigènes connus pour intervenir pendant l'étape précoce de l'infection (Elhay et al., 1998 ; Horwitz et al., 1995 ; Rosenkrands et al., 1998).
Le fait que RD5 et RD6 contiennent des gènes codant pour des protéines appartenant à la famille de ESAT-6 dont 14 sont organisées en 11 loci distincts est particulièrement significatif (F. Tekaia, S. Gordon, T. Garnier, R. Brosch, B.G. Barrell and S.T. Cole, soumis). ESAT-6 est un antigène à cellule T majeur qui semble être sécrété par le bacille tuberculeux virulent d'une manière indépendante du peptide signal (Harboe et al., 1996). Il s'accumule dans le milieu extracellulaire pendant les phases précoces de croissance et son gène est localisé dans RD1, une région qui est délétée du génome de M. bovis BCG (Mahairas et al., 1996 ; Philipp et al., 1996). 3 des 10 régions RD contiennent ainsi des gènes de la famille de ESAT-6, ce qui indique que d'autres sites de gènes ESAT-6 peuvent aussi donner lieu à des délétions ou des réarrangements.
La séquence génomique de M. tuberculosis H37Rv a par ailleurs révélé la présence de 4 gènes hautement apparentés codant pour des enzymes de phospholipase C appelées plcA, plcB, plcC et plcD (Cole et al., 1998). La phospholipase C a été reconnue comme facteur de virulence important dans un certain nombre de bactéries incluant Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes et Pseudomonas aeruginosa où elle joue un rôle intracellulaire dans la dissémination des cellules bactériennes, dans la survivance intracellulaire et dans la cytolyse (Titball, 1993). La délétion RD5 englobe 3 gènes (plcA, plcB et plcC), cette région étant absente de M. bovis, M. bovis BCG et M. microti. La mise en évidence de l'activité de la phopholipase C dans M. tuberculosis, M. microti et M. bovis mais pas dans M. bovis BCG, a été précédemment décrite (Johansen et al., 1996 ; Wheeler et Ratledge, 1992) ainsi que le rôle des enzymes codées par plcA et plcB (également connues sous la dénomination mpcA et mpcB) dans l'hydrolyse à la fois de la phosphatidylcholine et de la sphingomyéline. Les niveaux de l'activité de phospholipase C détectés dans M. bovis sont très inférieurs à ceux observés dans M. tuberculosis qui sont en concordance avec la perte de plcABC, l'activité de la sphingomyélinase étant encore détectable. Les données de séquences présentées ici montrent que la phospholipase dans sa pleine longueur est codée par le gène plcD dans M. bovis BCG-Pasteur et que son importante similarité de séquence avec les produits de plcA et plcB indique qu'elle est probablement dotée à la fois d'une activité phospholipase et d'une activité sphingomyélinase. Il est donc probable que plcD puisse être responsable de l'activité résiduelle de phospholipase C dans les souches présentant la délétion RD5, tel que M. bovis, bien qu'il soit difficile de relier cette interprétation à l'absence observée de phospholipase C en dépit de la présence de sphingomyélinase dans la souche de M. bovis BCG utilisée dans d'autres études (Johansen et al., 1996 ; Wheeler et Raledge, 1992). Les études de l'expression avec le gène plcD cloné devraient clarifier ce point.
Le gène mce a été décrit par l'équipe de Riley comme codant pour une protéine putative de M. tuberculosis de type invasine, dont l'expression dans E. coli permet l'invasion des cellules HeLa (Arruda et al., 1993). Trois autres protéines Mce ont été identifiées comme parties du projet de séquençage du génome avec leur gène occupant la même position dans quatre grands opérons très conservés comprenant au moins huit gènes (Cole et al., 1998 ; Harboe et al., 1996). Il est difficile de déduire les effets de la perte de mce3 (RD7) sur M. bovis, M. microti et M. bovis BCG du fait que les trois copies de mce restantes pourraient complémenter toute perte d'activité, à moins que les opérons ne soient exprimés différentiellement. Cependant, il est intéressant de noter que RD7 est absent de certains membres du complexe de M. tuberculosis qui ne sont pas virulents pour l'Homme suggérant que RD7 puisse jouer un rôle spécifique dans la maladie humaine.
Le génome de M. tuberculosis H37Rv code également pour six protéines (EphA-F) qui montrent une similarité avec des hydrolases époxydes tandis qu'au moins 21 hydratases énoyle CoA (EchA1-21) et de multiples aldéhydes déshydrogénases sont présentes (Cole et al., 1998). La perte de ephA (RD8), echA1 et l'aldéhyde déhydrogénase codée par Rv0223c (RD10) chez M. bovis BCG / M bovis peut donc être compensée par d'autres enzymes bien que la spécificité du substrat des enzymes de M. tuberculosis soit inconnue. Les hydrolases époxydes sont généralement considérées comme des enzymes de détoxification ; un récent rapport a encore montré qu'elles jouent un rôle dans l'activation des leucotoxines (Moghaddam et al., 1997), un acide gras toxique produit par les leucocytes qui sont impliqués dans le syndrome de détresse respiratoire chez l'adulte. Cependant, la question de savoir si les hydrolases époxydes de M. tuberculosis peuvent modifier chimiquement des chimiokines hôtes est sans réponse. Alternativement, elles peuvent jouer un rôle dans la détoxification lipidique des produits de peroxydation générés par les radicaux oxygènes à partir de macrophages activés.
RD9 est une région délétée des génomes de M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG et M. microti comparativement à M. tuberculosis. En conséquence, en opposition avec les autres régions RD, la localisation de M. africanum est proche de M. bovis, ce qui indique la présence de cette souche entre M. tuberculosis et M. bovis (Heifets et Good, 1994). De façon similaire, la région RD4 peut différencier M. microti des souches bovines (Tableau 2).
Les protéines codées par RD4 à RD10 peuvent donc présenter des antigènes intéressants, permettant la discrimination d'individus vaccinés par le BCG de patients infectés par M. tuberculosis.
La présente demande décrit également un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG et M. bovis de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes:
Ainsi la présente invention a pour objet un procédé de détection et d'identification permettant de discriminer M. bovis BCG et M. bovis de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
De préférence, les séquences nucléotidiques telles que définies aux étapes c) et d) sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
De préférence, dans le cadre de la présente invention, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple du sérum humain ou animal, du sang, une biopsie, du liquide broncho-alvéolaire ou du liquide pleural.
L'analyse des séquences recherchées peut par exemple être réalisée par une électrophorèse sur gel d'agarose. Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l'ADN de mycobactérie. Cette analyse peut également être réalisée par la technique d'hybridation moléculaire en utilisant une sonde nucléique. Cette sonde sera avantageusement marquée par un élément non radioactif (sonde froide) ou radioactif.
Avantageusement, la détection des séquences d'ADN des mycobactéries sera réalisée au moyen de séquences nucléotidiques complémentaires desdites séquences d'ADN. A titre d'exemple, il pourra s'agir de sondes nucléotidiques marquées ou non marquées ; il pourra également s'agir d'amorces en vue d'une amplification.
La technique d'amplification utilisée peut être la PCR mais également d'autres techniques alternatives comme la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brins, la technique TAS (Transcription-based Amplification System), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou la technique TMA (Transcription Mediated Amplification).
Les amorces conformes à l'invention ont une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11 SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17 et SEQ ID N° 18 avec:
Dans une variante, la demande décrit également un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG et M. bovis de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés par une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, par une électrophorèse capillaire ou encore par une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions). La spécification de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant des sondes, des plasmides contenant ces séquences ou leur produit d'amplification.
Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactif dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquences complémentaires à celles desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
Ces sondes et amplicons peuvent être marqués ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives telles que des enzymes ou des éléments fluorescents.
La présente invention a également pour objet un kit pour la détection et l'identification discriminante de M. bovis BCG et M. bovis de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les éléments suivants :
En effet, dans le cadre de la présente invention, en fonction du couple d'amorces utilisé, on peut obtenir des résultats très différents. Ainsi l'utilisation d'amorces internes à la délétion, telles qu'elles sont décrites dans la présente invention pour RD4, RD5 et RD8, fait qu'aucun produit d'amplification n'est détectable chez M. bovis BCG. Cependant, l'utilisation d'amorces externes à la zone de délétion ne donne pas nécessairement le même résultat, en ce qui concerne par exemple la taille du fragment amplifié, en fonction de l'importance de la zone délétée chez M. bovis BCG. Ainsi, l'utilisation du couple d'amorces SEQ ID N° 5 / SEQ ID N° 6 pour la détection de RD6 est susceptible de donner lieu à un amplicon chez M. bovis BCG d'environ 3 801 pb alors que la mise en oeuvre du couple d'amorces SEQ ID N° 11 / SEQ ID N° 12 pour la détection de RD9 donnera lieu chez M. bovis BCG à un amplicon d'environ 1 018 pb.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un couple d'amorces tel que défini ci-dessus pour l'amplification de séquences d'ADN de M. bovis BCG et, M. bovis ou M. tuberculosis.
L'intérêt de l'utilisation de plusieurs couples d'amorces sera bien évidemment de croiser les résultats obtenus avec chacun d'eux pour affiner le résultat de l'analyse. En effet, lorsqu'il est indiqué, dans le cadre de la présente invention, que certaines délétions sont spécifiques de M. bovis BCG / M. bovis, cela n'est pas tout à fait exact puisque certaines d'entre elles sont également retrouvées chez M. microti OV254, chez M. tuberculosis CSU#93 et chez M. africanum ainsi que chez certains isolats cliniques (Tableau 2). Ainsi, l'utilisation du couple d'amorces SEQ ID N° 1 / SEQ ID N° 2 spécifique de la région RD4 ne donnera pas lieu à des amplicons de taille normale avec M. bovis BCG / M. bovis dans l'échantillon biologique. En revanche si le couple d'amorces utilisé est SEQ ID N° 5 / SEQ ID N° 6 spécifique de RD6 et que des amplicons de taille normale ne sont pas retrouvés, il ne sera pas possible, à partir de ce seul résultat, de discriminer entre la présence, dans l'échantillon biologique, de M. bovis BCG / M. bovis, M. microti OV254 et M. tuberculosis CSU#93.
La discrimination sera plus radicale quand il s'agira de déterminer si la mycobactérie présente dans l'échantillon biologique à analyser est M. bovis BCG / M. bovis ou M. tuberculosis H37Rv car les couplés d'amorces SEQ ID N° 15 / SEQ ID N° 16 et SEQ ID N° 17 / SEQ ID N° 18 ne sont spécifiques que de M. tuberculosis H37Rv. Par conséquent, l'absence d'amplicon de taille normale lors de l'utilisation de l'un ou l'autre de ces couples d'amorces pourra être considérée comme significative de la présence de M. tuberculosis H37Rv dans l'échantillon biologique analysé.
La présente demande décrit également les produits d'expression de tout ou partie des séquences nucléotidiques délétées du génome de M. bovis BCG / M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou inversement telles qu'énumérées dans le Tableau 1.
Par « produit d'expression » on entend toute protéine, polypeptide ou fragment polypeptidique résultant de l'expression de tout ou partie des susdites séquences nucléotidiques et de préférence présentant au moins l'une des caractéristiques suivantes :
En effet, la présente invention a également pour objet un procédé de détection discriminante in vitro d'anticorps dirigés contre M. bovis BCG et M. bovis ou d'anticorps dirigés contre M. tuberculosis dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
De préférence les séquences nucléotidiques telles que définies à l'étape a) dudit procédé sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
La demande décrit également un procédé de détection discriminante d'une vaccination avec M. bovis BCG ou d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
Ainsi, l'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro permettant de discriminer une vaccination avec M. bovis BCG d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
De préférence, les séquences nucléotidiques telles que définies à l'étape a) dudit procédé sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
La prolifération cellulaire pourra être mesurée par exemple par incorporation de 3H-Thymidine.
La demande décrit également un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère éventuellement préalablement vacciné avec M. bovis BCG comprenant :
Ainsi, la présente demande décrit également un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par M. tuberculosis chez un mammifère éventuellement préalablement vacciné avec M. bovis BCG, comprenant :
De préférence les séquences nucléotidiques telles que définies dans la partie a) dudit kit sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
Les réactifs permettant la détection des complexes antigène - anticorps peuvent porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'anticorps utilisé n'est pas marqué.
L'invention a également pour objet des anticorps mono- ou polyclonaux, leurs fragments ou anticorps chimériques, capables de reconnaître spécifiquement un produit d'expression de tout ou partie des séquences nucléotidiques absentes des génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou présentes dans les génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et absentes du génome de M. tuberculosis telles que définies aux étapes 1) et 2) ci-après :
De préférence, lesdites séquences nucléotidiques sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
La présente invention concerne donc également un procédé pour la détection de la présence d'un antigène permettant de discriminer un antigène de M. bovis BCG et M. bovis d'un antigène de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
L'invention concerne également le kit pour la détection discriminante de la présence d'un antigène de M. bovins BCG et M. bovis par rapport à un antigène de M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les éléments suivants :
Les réactifs ci-dessus mentionnés sont bien connus de l'homme du métier qui n'aura aucune difficulté à les adapter au contexte de la présente invention.
L'invention a également pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle consiste en au moins un produit d'expression des séquences nucléotidiques absentes des génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou présentes dans les génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et absentes du génome de M. tuberculosis telles que définies aux étapes 1) et 2) ci-après :
De préférence, lesdites séquences nucléotides sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
Avantageusement, la composition immunogène conforme à l'invention entre dans la composition d'un vaccin lorsqu'elle est présentée en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement avec un ou plusieurs adjuvant(s) de l'immunité tel que l'alun ou un représentant de la famille des muramylpeptides ou encore d'adjuvant incomplet de Freund.
La présente demande décrit également un vaccin comprenant au moins un produit d'expression de tout ou partie des séquences nucléotidiques absentes des génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et présentes dans M. tuberculosis ou présentes dans les génomes de M. bovis BCG et de M. bovis et absentes du génome de M. tuberculosis telles que définies aux étapes 1) et 2) ci-après :
De préférence, lesdites séquences nucléotidiques sont regroupées en régions nucléotidiques RD5 à RD10 et RvD1 et RvD2 selon la répartition suivante :
Les connaissances standards sur l'évolution du complexe de M. tuberculosis sont basées sur l'hypothèse que M. tuberculosis est dérivé de M. bovis (Sreevatsan et al., 1997). Cependant, la distribution de RD1 à RD10 parmi le complexe tuberculeux suggère qu'une évolution linéaire de M. tuberculosis à partir de M. bovis est trop simpliste. Il apparaît en effet, de façon plus probable, que les deux bacilles sont dérivés d'une souche-mère commune, que les délétions reflètent donc l'adaptation des bacilles à leur niche particulière, c'est-à-dire que la perte de RD4 à RD10 a probablement aidé M. bovis à devenir un agent pathogène des bovins plus puissant que M. tuberculosis. Des études génomiques fonctionnelles détermineront quel rôle ces délétions jouent dans la différentiation phénotypique du complexe tuberculeux.
Enfin, les inventeurs ont mis en évidence, toujours par la comparaison du BAC de M. tuberculosis H37Rv et du BAC de M. bovis BCG deux duplications dans le génome de M. bovis BCG-Pasteur, appelées DU1 et DU2. Il s'agit de duplications de régions de plusieurs dizaines de kilobases qui semblent être absentes à la fois de la souche type de M. bovis et de M. tuberculosis H37Rv. La mise en évidence de ces deux duplications a été faite suite à une digestion des mêmes clones pour chaque BAC avec HindIII et une analyse sur gel d'électrophorèse en champ pulsé (PFGE). Ces observations ont été confirmées par hybridation de l'ADN chromosomique digéré issu de M. bovis BCG, de la souche type de M. bovis et M. tuberculosis H37Rv avec des sondes sélectionnées couvrant les régions dupliquées. Des amorces spécifiques pour les régions réarrangées ont été préparées et testées sur l'ADN génomique à partir d'isolats additionnels de M. bovis BCG et M. tuberculosis.
Il a été déterminé que DU1 et DU2 étaient présentes chez trois souches de M. bovis BCG y compris chez M. bovis BCG-Pasteur et absentes de trois autres sous-souches de M. bovis BCG.
Ces deux duplications sont également absentes de la souche type de M. bovis et de M. tuberculosis H37Rv.
Ainsi, toujours dans le cadre de la présente invention relativement à la détection discriminante de M. bovis ou M. tuberculosis, l'invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification discriminante de M. bovis BCG ou M. tuberculosis dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
La digestion par une enzyme de restriction peut en effet être réalisée soit sur l'intégralité du génome de la mycobactérie, soit sur un ou plusieurs clones de la banque réalisée à partir du génome en question.
Préférentiellement, l'enzyme de restriction utilisée dans le cadre du susdit procédé est HindIII.
En ce qui concerne l'analyse des fragments de restriction, celle-ci peut consister à compter lesdits fragments et/ou à déterminer leur longueur. En effet, comme ceci est expliqué ci-après, la digestion par HindIII de M. bovis BCG donne lieu à un fragment de plus que ceux obtenus après digestion par HindIII du génome de M. tuberculosis H37Rv. Le nombre des fragments ainsi obtenus peut également être complété par la détermination de leur longueur. Ceci peut être réalisé au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple sur un gel d'électrophorèse en champ pulsé (PFGE). Il a ainsi pu être déterminé que le fragment supplémentaire apparaissant après digestion par HindIII du génome de M. bovis BCG-Pasteur présentait une taille d'environ 29 kb.
Une autre façon d'analyser les fragments de restriction résultant de la digestion enzymatique du génome de la mycobactérie telle que ci-dessus décrite, consiste à mettre en contact lesdits fragments avec au moins une sonde appropriée, couvrant par exemple la région dupliquée, dans des conditions d'hybridation afin d'identifier ensuite le nombre et la taille des fragments qui ont hybridé. Les sondes utilisées à cette fin peuvent être marquées ou non marquées selon les techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, la sonde peut être obtenue par amplification de l'ADN génomique avec les amorces choisies dans le groupe SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33 OU SEQ ID N° 34 avec le couple :
On peut aussi analyser les fragments en effectuant une amplification des fragments obtenus avec des amorces choisies dans le groupe SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 28 avec :
Enfin, on peut également amplifier les fragments obtenus avec des amorces choisies dans le groupe SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37 et SEQ ID N° 38 spécifiques de DU1 puis les analyser par séquençage.
Les clones «X» correspondent aux clones dans pBeloBAC11 de M. bovis BCG, les clones « XE » correspondent aux clones dans pBACe3.6 de M. bovis BCG, les clones « Rv » correspondent aux clones dans pBeloBAC11 de M. tuberculosis, les clones « Y » correspondent aux clones dans le cosmide pYUB328 de M. tuberculosis et les clones « I » correspondent aux clones dans le cosmide pYUB412 de M. tuberculosis. La localisation de chaque région de délétion est montrée sur la carte. Les barres d'échelle indiquent la position sur le génome de M. tuberculosis.
Les régions délétées à partir du génome de M. tuberculosis sont délimitées par des flèches avec une séquence flanquant chaque délétion. Les ORF (cadres ouverts de lecture) sont représentés par des boîtes « dirigées » montrant le sens de la transcription comme précédemment décrit (Cole et al., 1998). Les fonctions putatives et les familles des ORF sont décrites dans le Tableau 3. Les codons stop sont indiqués par de petites barres verticales.
Des digestions du clone Rv143 du BAC avec les endonucléases EcoRI, PstI et StuI ont révélé que des fragments de 1,5 kb (EcoRI), 1,5 kb (PstI), 1,3 et 2,7 kb (StuI) ne montraient aucune liaison avec des sondes d'ADN de M. bovis ou de M. bovis BCG (les bandes manquantes sont indiquées par des flèches). La taille en kilobases (kb) est indiquée sur la gauche.
La présente demande ne se limite pas à la description ci-dessus et sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne doivent en aucune manière être considérés comme limitant la présente invention.
Des tentatives précédentes pour cloner des inserts très larges d'ADN mycobactériens (120-180 kb) dans le vecteur pBeloAC11 se sont soldées par un échec (Brosch et al., 1998). Pour établir si cette détermination de taille était due au vecteur pBeloBAC11, les inventeurs ont testé en parallèle le vecteur pBACe3.6 de BAC qui utilise le système de sélection sacB (Lawes et Maloy, 1995 ; Pelicic et al., 1996). Des ligatures réalisées avec des fragments dans des gammes de taille de 50-125 kb ont donné 5 à 10 fois moins de transformants dans pBACe3.6 que les ligatures contrôle utilisant pBeloBAC11 (clones X). La taille d'un insert dans les clones pBACe3.6 était approximativement comprise dans l'intervalle 40-100 kb, similaire à ce qui avait été observé pour pBeloBAC11. Ceci suggère qu'une taille d'environ 120 kb est bien la taille limite supérieure pour la faisabilité du clonage d'ADN mycobactérien.
100 clones sélectionnés au hasard à partir des banques de pBeloBAC11 et de pBACe3.6 ont été séquences aux extrémités pour déterminer leur position par rapport au chromosome de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998). Ceci a donné un réseau minimum de clones sur le génome mais avec un groupement préférentiel au voisinage de l'unique opéron rrn, ce qui a également été observé durant la construction de la carte du BAC de M. tuberculosis (Brosch et al., 1998). Pour combler les trous entre les clones positionnés, des amorces de PCR ont été élaborées, sur la base de la séquence du génome complet de M. tuberculosis, de façon à cribler des pools de BAC pour des clones spécifiques. En utilisant cette méthodologie, des clones couvrant plus de 98 % du génome ont été isolés et positionnés sur la séquence du génome de M. tuberculosis.
Un jeu minimum de 57 clones de BAC de M. bovis BCG a été nécessaire pour couvrir le génome (
Il s'agit de la mise en évidence, à partir de la banque de BAC de M. tuberculosis H37Rv, de 63 clones couvrant 97 % du génome (Brosch et al., 1998). L'analyse in silico de la séquence du génome de M. tuberculosis a révélé que la digestion de ces clones avec soit PvuII ou EcoRI donnait lieu à un nombre raisonnable de fragments de restriction pour chaque clone. Les fragments digérés ont migré à travers des gels d'agarose, ont donné lieu à des spots sur des membranes et ont ensuite été hybridés avec de l'ADN génomiques marqué au 32P de M. bovis BCG et M. bovis. Les fragments de restriction qui n'ont pas hybridé avec les sondes d'ADN ont été considérés comme manquant dans les génomes de M. bovis ou BCG. Comme le criblage initial n'employait que deux enzymes, il est possible que d'autres délétions soient passées inaperçues. Cependant, il est probable que toutes les délétions importantes (> 5 kb) ont été détectées par cette approche.
A partir d'une analyse de l'ensemble du génome, 10 loci ont été identifiés qui semblent être absents dans M. bovis BCG par rapport à M. tuberculosis. Des hybridations avec l'ADN génomique de M. bovis ont révélé que 7 de ces loci étaient également délétés dans M. bovis par rapport à M. tuberculosis. Une analyse plus serrée a révélé que les trois délétions spécifiques de M. bovis BCG étaient identiques aux régions RD1-RD3 définies par l'équipe de Stover (Mahairas et al., 1996). En gardant la précédente nomenclature, les 7 délétions M. bovis / BCG ont été désignées RD4, RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RD10 (
RD4 est une délétion de 12,7 kb précédemment caractérisée comme une région absente de M. bovis et M. bovis BCG des sous-souches Pasteur, Glaxo et Danemark (Brosch et al., 1998). Parmi les protéines codées par les 11 ORFs, certaines montrent des ressemblances avec des enzymes impliquées dans la synthèse des lipopolysaccharides. Pour déterminer si RD4 était délétée seulement dans les souches bovines. M. africanum, M. microti, M. tuberculosis CSU#93 et 27 isolats cliniques de M. tuberculosis ont été examinés pour la présence du locus (Tableau 2). Des réactions de PCR utilisant des amorces internes à RD4 (Tableau 3) n'ont généré que des produits dans des souches non bovines.
RD5 a une taille de 8 964 pb localisées entre les positions génomiques 2626067-2635031 (
RD6 a été cartographiée au niveau de la séquence d'insertion IS1532. un élément IS qui est manquant chez M. microti, M. bovis et M. bovis BCG (Gordon et al., 1998) (Tableau 1). La délimitation de la taille de la délétion a été compliquée par la présence de régions répétées flanquant directement l'élément IS et nécessitant l'utilisation d'amorces en dehors de la région répétée (Tableau 3). Ces amorces ont amplifiées des produits chez M. bovis et M. bovis BCG qui sont plus petits d'environ 5 kb que l'amplicon de M. tuberculosis. La marche à l'aide d'amorce a été utilisée pour localiser précisément les jonctions de délétions et a révélé une délétion de 4 928 b chez M. bovis et M. bovis BCG (position génomique de M. tuberculosis 3846807-3841879). A l'instar de l'élément IS1532, il a été déterminé que RD6 contenait deux gènes codant pour des protéines PPE (Rv3425 et Rv3426) et une partie de Rv3424c dont la fonction est inconnue (Tableau 1).
La délétion RD2 décrite dans Mahairas et al. (Mahairas et al., 1996) a été cartographiée dans le clone Rv420 de M. tuberculosis et les résultats obtenus par les inventeurs ont suggéré l'existence d'une délétion supplémentaire chez M. bovis BCG très proche de RD2. Des hybridations ont été répétées utilisant de l'ADN génomique de M. bovis en tant que sonde puisque cette souche contient des séquences RD2, simplifiant ainsi l'identification d'autres fragments délétés. Cette analyse (
RD8 englobe une région de 5 895 pb positionnée sur la séquence génomique de M. tuberculosis à 4556836-4062731. La délétion contient 6 ORFs (
La délétion de 2 030 pb englobée par RD9 couvre 2 ORFs, Rv2037c et Rv2074, qui codent vraisemblablement respectivement pour une oxydoréductase et une protéine inconnue (Tableau 1). 2 ORFs additionnels sont tronqués par RD9: Rv2075c code pour une protéine exportée putative tandis que cobL code pour une méthyltransférase précorrine impliquée dans la synthèse de la cobalamine. L'analyse PCR avec des amorces flanquantes (Tableau 3) a révélé que RD9 est également présent chez M. africanum et M. microti (Tableau 2). RD10 est une délétion de 1 903 pb qui tronque 2 ORFs, echA1 et Rv0223, qui codent une énoyl CoA hydratase et une aldéhyde déshydrogénase respectivement (Tableau 1). Des réactions de PCR ont révélé que RD10 était absent chez M. microti ainsi que chez M. bovis et BCG.
Compte tenu du fait que les génomes des bacilles tuberculeux sont hautement conservés (Sreevatsan et al., 1997), la comparaison locale directe peut être entreprise d'une façon simple et ciblée en examinant les profils d'enzyme de restriction générés à partir des clones de BAC des M. tuberculosis et M. bovis BCG qui couvrent les mêmes régions. Une cartographie comparative de la zone englobée par le clone X318 a identifié cette zone comme étant très différente des clones correspondants de M. tuberculosis. Les données relatives aux séquences terminales à partir du clone X066 ont révélé que si sa séquence terminale SP6 permettait de le positionner à environ 2 380 kb sur la matrice de M. tuberculosis, la séquence terminale T7 ne générait aucune similarité significative avec une quelconque séquence de H37Rv, indiquant qu'une extrémité de X066 était interne au segment d'ADN présent dans BCG mais absent de H37Rv. Des amorces de séquençage ont été utilisées pour marcher le long du clone X318 du BAC de BCG (
Un ORF codant pour une phopholipase, plcD, est interrompu par IS6110 dans M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998). Pour déterminer si plcD était intact dans d'autres membres du complexe tuberculeux, des amorces qui flanquaient le site d'insertion IS6110 (Tableau 3) ont été utilisées dans des réactions de PCR avec M. bovis, M. bovis BCG et M. tuberculosis H37Rv. Ceci a révélé un polymorphisme au locus plcD où les amplicons de M. bovis et de M. bovis BCG étaient d'environ 5 kb plus grands que le produit de H37Rv (
Les souches du complexe de M. tuberculosis (Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis et Mycobacterium bovis BCG) et sous-souches de M. bovis BCG (Danemark, Glaxo, Russe, Japonais, Pasteur et Moreau) ont été obtenus à partir des stocks de laboratoires (Unité de G.M.B., Institut Pasteur). Mycobacterium tuberculosis CSU#93 a été reçu de John BELISLE, Department of Microbiology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523. Des isolats cliniques non épidémiques de M. tuberculosis ont été fournis par Beate HEYM, Hopital Ambroise Paré, 9 avenue Charles de Gaulle, 92104 BOULOGNE CEDEX, FRANCE. Les vecteurs de BAC pBeloBAC11 (Kim et al., 1996) et PBACe3.6 (Genbank n° d'accession U80929) ont été donnés par H. SHIZUYA, Department of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, CA, et P. de JONG, Roswell Park Cancer Institute, Human Genetics Department, Buffalo, NY, respectivement. Les vecteurs et les recombinants dérivés ont été maintenus dans E. coli DH10B.
La préparation de l'ADN génomique dans des cubes d'agarose à partir de M. bovis BCG Pasteur a été réalisée comme indiqué précédemment (Philipp et al., 1996 ; Philipp et al., 1996) mais avec deux digestions à la protéinase K pendant 24 h chacune, plutôt qu'une digestion de 48 h. Les cubes ont été stockés dans 0,2 M EDTA à 4°C et lavés 2 fois dans 50 ml de Tris-EDTA (pH 8)/Triton X-100 (0,1 %) à 4°C pendant 1 h, ensuite lavés 2 fois dans 50 ml d'un tampon d'enzyme de restriction Triton X-100 (0,1 %) pendant 1 h à température ambiante avant utilisation.
Un vecteur d'ADN a été préparé comme précédemment indiqué (Woo et al., 1994). Des digestions partielles avec HindIII et EcoRI de l'ADN dans l'agarose, pour le clonage dans pBeloBAC11 et pBACe3.6 respectivement, et ensuite une migration en champ électrique homogène à contour serré (CHEF) ont été réalisées comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998). 5 zones, 50-75 kb, 75-100 kb, 100-125 kb, 125-150 kb et 150-170 kb ont été excisées à partir des gels d'agarose et stockées dans du TE à 4°C. Des ligatures avec les vecteurs pBeloBAC11 et pBACe3.6 et une transformation dans E. coli DH10B ont été réalisées comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998). Les transformants pBeloBAC11 ont été sélectionnés sur de l'agar LB contenant 12,5 µg/ml de chloramphénicol, 50 µg/ml de X-gal et 25 µg/ml d'IPTG, et ont été criblés avec des colonies recombinantes blanches. Les transformants pBACe3.6 ont été sélectionnés sur de l'agar LB contenant 12,5 µg/ml de chloramphénicol et 5 % de sucrose. Les clones recombinants ont été repiqués, en deux exemplaires, dans des plaques microtitre à 96 puits contenant un milieu 2xYT avec 12,5 µg/ml de chloramphénicol et ont été incubés toute la nuit à 37°C. Un volume égal de glycérol à 80% a alors été ajouté aux puits et une plaque a été conservée à -80°C en tant que plaque maîtresse. La plaque restante a été utilisée pour faire des ensembles de clones à des fins de criblage (voir ci-dessus).
Un recombinant portant un plasmide d'ADN a été préparé à partir de 40 ml de culture et a été mis en croissance sur le milieu 2xYT contenant 12,5 µg/ml de chloramphénicol comme précédemment décrit (Brosch et al., 1998). 100-200 ng d'ADN ont été digérés avec DraI (Gibco-BRL) et les produits de restriction ont été séparés sur un gel d'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) avec un appareil CHEF de LKB-Pharmacia utilisant un gel d'agarose à 1 % (poids/volume) et une impulsion de 4 secondes pendant 15 h à 6,25 V/cm. Des marqueurs PFGE de taille moyenne et inférieure (New England Biolabs) ont été utilisés en tant que taille standard. Les tailles des inserts ont été estimées après coloration au bromure d'éthidium et visualisation avec de la lumière UV.
Des réactions de séquençage ont été réalisées comme précédemment indiqué (Brosch et al., 1998). Pour des clones isolés à partir de la banque de pBeloBAC11, les amorces SP6 et T7 ont été utilisées pour séquencer les extrémités des inserts, tandis que pour les clones pBACe3.6, les amorces dérivées du vecteur ont été utilisées. Les réactions ont été chargées sur des gels de polyacrylamide à 6 % et une électrophorèse a été réalisée avec un séquenceur d'ADN automatique 373A ou 377 (Applied Biosystems) pendant 10 à 12 h. Les réactions ont donné généralement entre 300 et 600 pb de séquences lisibles.
Les clones qui se superposaient à partir de la banque pBeloBAC11 de M. tuberculosis H37Rv (Brosch et al., 1998) ont été sélectionnés de telle façon que 97 % du génome de M. tuberculosis étaient représentés. L'ADN préparé à partir de ces clones a été digéré avec EcoRI (Gibco-BRL) ou PvuII (Gibco-BRL) et a été mis à migrer dans des gels d'agarose à 0,8 %, de 25 cm de longueur, à un faible voltage pendant 12 à 16 h. Après coloration et visualisation aux UV, les gels d'agarose ont été traités avec la méthode Southern standard et les ADN ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose Hybond-C Extra (Amersham). L'ADN a été fixé à la membrane par chauffage à 80°C pendant 2 h. L'ADN génomique de M. tuberculosis H37Rv, Mycobacterium bovis ATCC 19210 et M. bovis BCG Pasteur a été marqué avec [α- 32P]dCTP au moyen du kit Prime-It II (Stratagene). Les sondes ont été purifiées à travers une colonne P10 (Biorad) avant utilisation. Des hybridations ont été réalisées comme précédemment décrit (Philipp et al., 1996). Les sondes marquées purifiées ont été mises en solution dans une solution de 5xSSC (1xSSC est 0,5 M de chlorure de sodium ; 0,015 M de citrate de sodium), et 50 % (poids/volume) formamide. L'hybridation a été réalisée à 37°C, et les membranes ont été lavées pendant 15 mn à température ambiante dans du 2xSSC/0,1 % SDS et ensuite dans du 1xSSC/0,1% SDS et finalement dans du 0,1 xSSC/0,1 % SDS. Les résultats ont été interprétés à partir des autoradiogrammes. En général, il a été difficile de visualiser sur les autoradiogrammes les fragments de moins de 1 kb, surtout après utilisation répétée des membranes. Les fragments supérieurs à 1 kb ont donné des résultats plus clairs. Les clones qui sont apparus comme contenant des fragments sans contrepartie dans M. bovis BCG ont été repiqués pour des analyses ultérieures. La séquence génomique a permis l'établissement de cartes de restriction dans le but de déterminer les zones de délétion suspectées, permettant de sélectionner des enzymes donnant la meilleure résolution des régions. Des clones pouvaient ainsi être digérés avec une seconde gamme d'enzymes (généralement PstI et StuI, avec EcoRI inclus en tant que contrôle) et hybridés pour obtenir une taille plus précise de la délétion. Les amorces de séquençage qui flanquent les délétions ont ainsi été désignées et utilisées dans les réactions de séquençage avec le BAC correspondant de M. bovis BCG utilisé comme matrice.
Les amorces utilisées dans les réactions de PCR sont listées dans les Tableaux 3 et 4. Les réactions pour des produits attendus de moins de 3 kb ont été réalisées avec une polymérase Taq standard (Boehringer Mannheim). Les réactions mettaient en oeuvre 5 µl de tampon 10xPCR (100 mM de β-mercaptoéthanol, 600 mM de Tris HCl, pH 8,8), 20 mM de Mach, 170 mM de (NH4)2SO4, 5 µl de mélange nucléotidique à 20 mM, 0,2 µM de chaque amorce, 10-50 ng de matrice d'ADN, du DMSO à 10 %, 0,5 unité de polymérase Taq et de l'eau distillée stérile à 50 µl. Les cycles thermiques ont été réalisés avec un amplificateur PTC-100 (MJ Inc.) avec une étape de dénaturation initiale de 90 secondes à 95°C suivie par 35 cycles de 30 secondes à 95°C, 1 min à 55°C et 2 min à 72°C.
Les réactions de PCR susceptibles de donner lieu à des produits supérieurs à 3 kb ont été réalisées au moyen du kit de PCR GeneAmp XL (Perkin Elmer). Les réactions ont été lancées selon les instructions des fabricants, avec 0,8 mM de Mg(OAc)2; 0,2 µM de chaque amorce et 10-30 ng de matrice d'ADN par réaction. Les cycles thermiques étaient réalisés à 96°C pendant 1 mn, suivis ensuite par 15 cycles en 2 étapes à 94°C pendant 15 secondes et 70°C pendant 7 mn, suivis par 20 cycles en 2 étapes à 94°C pendant 15 secondes et 70°C pendant 8 mn plus 15 secondes par cycle.
Les données concernant les séquences ont été transférées du séquenceur automatisé ABI373A aux stations de travail Digital ou Sun et éditées au moyen du logiciel TED à partir de l'ensemble Staden. Les séquences éditées ont été comparées à la base de données des inventeurs concernant M. tuberculosis (H37Rv.dbs) pour déterminer les positions relatives des séquences terminales sur la séquence du génome de M. tuberculosis. Avec cette méthode, une cartographie des clones BAC de M. bovis BCG a été construite en utilisant la séquence de M. tuberculosis H37Rv comme matrice.
Pour faire de la comparaison génomique, des digestions in silico au moyen d'enzymes de restriction ont été réalisées avec le logiciel NIP (Nucleotide Interprétation Program) à partir de l'ensemble Staden. Le programme Display and Analysis (DIANA) du Centre Sanger, Cambridge, UK, a été utilisé pour interpréter les données de séquence.
Les séquences nucléotidiques qui flanquent chaque locus RD dans M. bovis BCG ont été déposées dans la base de données EMBL. Les numéros d'accession pour RD5, RD6, RD7, RD8, RD9 et RD10 sont respectivement AJ007300, AJ131209, AJ007301, AJ131210, Y181604 et AJ 132559. Les séquences de RvD1 et RvD2 dans M. bovis BCG ont été déposées sous les n° Y18605 et Y18606 respectivement.
DU1 a été la première région dupliquée observée quand les bandes de digestion par HindIII du clone X038 du BAC de BCG et du clone Rv13 du BAC de H37Rv ont été comparées. Les deux clones X038 et Rv13 avaient des séquences terminales identiques, s'étendant de la position HindIII∼ 4 367 kb au site HindIII∼ 0 027 kb (via 4411529 b) sur la séquence du génome de M. tuberculosis H37Rv (MTBH37RV), englobant l'origine de réplication.
L'analyse in silico des sites de restriction HindIII pour la zone donnée entre - 4 367 kb et - 0 027 kb a révélé un site HindIII à la position -4 404 kb. En conséquence, la digestion de ces clones devrait montrer deux fragments de restriction plus la bande spécifique du vecteur à environ 8 kb. C'était le cas pour le clone Rv13 de H37Rv. Au contraire, le clone X038 du BAC de BCG montrait trois bandes plus la bande spécifique du vecteur à environ 8 kb, deux d'entre elles étaient identiques au schéma de Rv13. La bande additionnelle présente une taille d'environ 29 kb. Des analyses PFGE supplémentaires utilisant DraI ont révélé que X038 est bien de 29 kb plus long que Rv13. Par un criblage PCR des pools de BAC de BCG utilisant des oligonucléotides sélectionnés, les inventeurs ont pu identifier trois clones X de plus couvrant les parties de cette région génomique dans BCG : X585, X592, X703. La séquence terminale et l'analyse PFGE ont montré que chacun de ces clones contient un insert de taille différente, correspondant aux trois bandes observées dans les résultats de digestion de X038 (
Les séquences terminales sont : X585 (∼ 4 367-4 404 kb) ; X592 (∼ 4 404-4404 kb) ; X703 (- 4 404-0 027 kb). Les séquences ont été répétées deux fois avec les mêmes résultats. Le curieux résultat selon lequel le clone X592 a des extrémités T7 et SP6 dans la même région génomique pouvait être expliqué par une duplication de cette région génomique dans BCG et a donné également l'indication sur la dimension du réarrangement. Des analyses de restriction comparatives additionnelles des clones X585, X592, X703 et X038 avec EcoRI ont révélé que X592 et X703 ont le même schéma de restriction à l'exception d'une bande de 10 kb présente dans X703 mais absente de X592. Sur la base de ces résultats, des amorces ont été préparées pour l'amplification de la région de jonction où le segment d'ADN dupliqué joint l'unique région.
L'analyse PCR avec des amorces à 16.000 et à 4398.700 pb (SEQ ID N° 19 et 21) a donné un produit d'une taille attendue à partir du clone X592 et également sur l'ADN génomique de BCG-Pasteur. Le séquençage des produits PCR obtenus directement sur l'ADN de BAC du clone X592 a révélé que la jonction était bien localisée aux bases 16,732/4398,593 comparativement à la séquence génomique de H37Rv et que ce réarrangement génomique résultait en la troncature des gènes Rv3910 et pknB. Toutefois, dans la mesure où ce réarrangement est une duplication en tandem, des copies intactes des deux gènes pouvaient être présentes dans les régions avoisinantes. L'analyse PCR avec des amorces franquantes des gènes Rv3920 et pknB a confirmé ceci quand l'ADN génomique du BCG-Pasteur et de M. tuberculosis H37Rv ont été utilisés. Une preuve additionnelle du réarrangement a été obtenue en utilisant un fragment PCR de 500 pb englobant la région oriC de H37Rv en tant que sonde marquée au 32P pour hybrider les produits de digestion de l'ADN génomique de M. tuberculosis, M. bovis et M. bovis BCG-Pasteur dans les conditions stringentes décrites précédemment (Philipp et al., 1996). Tandis que dans M. bovis et M. tuberculosis, une bande d'une taille moyenne d'environ 35 kb a été détectée, dans M. bovis BCG-Pasteur deux bandes ont hybridé l'une d'environ 35 kb et l'autre de 29 kb. En conclusion, DU1 correspond à une duplication en tandem de 29668 pb qui résulte en une mérodiploïdie pour la région sigM-pabA (Rv3911-Rv0013).
L'analyse PCR utilisant des amorces à 16,000F (SEQ ID N° 19) ou 16,500F (SEQ ID N° 20) (amorces sens) et à 4398,770R (SEQ ID N° 21) (amorce reverse) sur l'ADN génomique de souches variées de BCG (Pasteur, Glaxo, Cophenhague, Russie, Prague, Japon) a révélé que des produits ont seulement été obtenus à partir de trois souches y compris M. bovis BCG-Pasteur. Les trois autres sous-souches ont toujours donné des résultats négatifs malgré la confirmation des contrôles positifs.
Comme attendu, la souche type de M. bovis et de M. tuberculosis H37Rv étaient également toujours négatives. Un résumé des données de cartographie est montré sur la
La région dnaA-dnaN est regardée de façon générale comme l'origine de réplication fonctionnelle des mycobactéries dans la mesure où après insertion dans des plasmides dont la propre origine de réplication est manquante, la capacité à se répliquer de façon autonome a été restaurée. Dans la mesure où BCG-Pasteur est diploïde pour la région dnaA-dnaN, les Inventeurs ont étudié s'il existait des différences entre les nucléotides des deux copies présentes sur les deux clones BAC X592 et X703. L'analyse de la séquence de l'ADN des BAC en utilisant des amorces de régions flanquantes et internes de la région intergénique dnaA-dnaN n'a révélé aucune différence entre les deux copies de la région minimale oriC. De plus, ces séquences étaient identiques à celles divulguées dans la littérature pour cette souche de BCG. Cette étude suggère que les deux copies de oriC devraient être fonctionnelles.
Le deuxième grand réarrangement génomique observé dans le chromosome de M. bovis BCG-Pasteur a été trouvé par l'analyse de plusieurs clones de BAC de BCG couvrant une région génomique d'environ 200 kb (3 550-3 750 kb). Leurs tailles évaluées par PFGE n'étaient pas conformes avec celles attendues à partir du génome de H37Rv et des données relatives aux séquences terminales. Les comparaisons directes ont été compliquées par la présence d'un élément IS6110 dans cette région du chromosome de M. tuberculosis H37Rv qui a conduit à une petite délétion RvD5.
Les séquences terminales du BAC X495 étaient toutes deux localisées aux alentours du site HindIII à 3 594 kb, tandis que les résultats PFGE montraient que le clone a une taille d'environ 106 kb, contenant trois fragments HindIII, d'environ 37,5 kb, environ 37 kb et environ 24 kb en plus du vecteur. La bande de 24 kb était d'environ 2 kb plus longue que le fragment correspondant HindIII de 22 kb dans Rv403. Cette observation a conduit à l'hypothèse que la région génomique aux alentours de 3 594 kb devait avoir été dupliquée, ceci donnant lieu à l'introduction d'un nouveau site HindIII là où le clone X495 prend fin. Pour montrer cela, plusieurs amorces dans la région chromosomique de 3 589 kb à 3 594 kb ont été testées pour le séquençage de l'ADN du BAC X495 et une jonction (JDU2A) a été identifiée aux bases 3690124/3590900 relativement à la séquence génomique de H37Rv. Ceci menait à une interruption du gène lpdA (Rv3303) mais les résultats de PCR ont indiqué qu'une copie intacte de ce gène est présente dans la région dupliquée.
L'analyse systématique d'autres clones dans le voisinage a permis l'identification de 2 BACs indépendants du BCG (X094 et X1026) qui portaient le même fragment chromosomal 3 594 à 3 749 kb. Bien que les données de séquences terminales suggéraient que ces clones devaient avoir une taille d'environ 155 kb, la taille estimée par des digestions par HindIII ou DraI suivies d'une séparation par PFGE était seulement d'environ 100 kb. Cette différence indiquait que les inserts de clones X094 et X1026 s'étendaient probablement des sites répétés HindIII à 3 594 kb au site authentique HindIII à la position 3 749 kb, et qu'une délétion interne avait eu lieu à l'intérieur de l'unité dupliquée.
Ceci a été confirmé par des expériences d'hybridation dans les conditions stringentes décrites précédemment sur de l'ADN génomique, digéré par HindIII, de M. tuberculosis H37Rv, M. bovis et BCG-Pasteur en utilisant de l'ADN du clone X495 radio-marqué. La taille de l'une des bandes qui s'hybridaient avec cet ADN dans les profils HindIII de M. tuberculosis H37Rv et M. bovis était d'environ 22 kb, tandis que la bande correspondante dans BCG était de 24 kb exactement ce qui était observé avec les clones BACs. De plus, les résultats d'hybridation montraient qu'une bande de 34 kb dans le profil HindIII du clone X094 s'hybridait également avec l'ADN génomique du clone X495, ce qui confirmait que les clones X094 et X1026 contenaient de l'ADN dupliqué de la région génomique couverte par X495. Des réactions de PCR et la séquence de l'ADN du clone BAC X094 ont permis l'identification d'un second point de jonction JDU2B à une position équivalente à 3 608 471/3 671 535 dans M. tuberculosis H37Rv. Ceci confirmait que DU2 résultait d'une duplication directe d'une région de 99 225 pb correspondant aux séquences entre les positions 3 590 900 et 3 690 124 dans le génome de M. tuberculosis H37Rv, et qu'une délétion interne de 63 064 pb avait ensuite eu lieu. L'unité résiduelle DU2 est ainsi longue de 36 162 pb, ce qui est cohérent avec les données de cartographie, et BCG-Pasteur est diploïde pour les gènes Rv3213c - Rv3230c, et Rv3290c - Rv3302c.
Finalement, des expériences de PCR, de cartographie par PFGE et de séquençage des séquences terminales avec le BAC X094 ont suggéré que le BCG-Pasteur contenait de l'ADN additionnel dans la région chromosomale du site HindIII 3 691 à 3 749 kb. La comparaison directe avec le clone BAC Rv403 de M. tuberculosis a permis la mise en évidence de deux sites supplémentaires HindIII dans cette région dans la mesure où les fragments HindIII de 48 kb présents dans Rv403 (correspondant au fragment de 3 691 à 3 749) étaient représentés par deux bandes de 22 et 36 kb dans BCG. Cette région du chromosome de M. tuberculosis H37Rv contient une copie de IS6110 qui n'est pas flanquée des unités répétées caractéristiques directes de 3 pb. Il est maintenant clair qu'il y avait initialement deux copies de IS6110 qui ont servi comme substrat pour un événement de recombinaison. Ceci a donné lieu à la délétion d'un segment de 4 kb du génome de M. tuberculosis H37Rv (RvD5), qui est toujours présent dans BCG. de même que dans M. bovis et les isolats cliniques de M. tuberculosis. L'analyse de la séquence de cette région a indiqué que ce fragment de 4 kb contient deux sites HindIII et qu'il y manque la séquence IS6110 qui est présente à ce site dans M. tuberculosis H37Rv. En utilisant des amorces internes pour RvD5 (Tableau 4), les Inventeurs ont obtenu des amplicons avec l'ADN génomique de toutes les souches de M. bovis BCG testées et, la souche de M. bovis, de même qu'avec l'ADN de clones X094 et X1026, mais pas avec les souches de M. tuberculosis H37Rv et H37Ra.
Des expérimentations avec de multiples jeux d'amorces (3689.500F (SEQ ID N° 22) ou 3689.900F (SEQ ID N° 24) (sens) 3591.000R (SEQ ID N° 23), 3591.500R (SEQ ID N° 25) ou 3592.000R (reverse)) pour amplifier la région de jonction au niveau de la base 3690124/3590900 (décrit ci-dessus) dans différentes souches de M. bovis BCG ont révélé que des amplicons pouvaient être obtenus seulement à partir de M. bovis BCG-Pasteur et à partir de deux autres sous-souches de BCG, tandis que les autres sous-souches de BCG ne donnaient pas d'amplicon. La confirmation des résultats pourra être faite sur des spots HindIII hybridés avec l'ADN marqué issu de la région 3689500F-3690.000R qui devrait donner lieu à des bandes avec des souches de BCG réarrangées, l'une d'entre elles présente une taille d'environ 24 kb, environ 2 kb de plus que la bande correspondante dans les digestions génomiques de M. bovis et de M. tuberculosis. La seconde bande d'environ 35 kb devrait seulement être présente dans les souches réarrangées et pas dans M. tuberculosis H37Rv ou la souche type de M. bovis (
Le criblage de clones de 2000 X et XE (Gordon et al., 1999) pour des BACs contenant à la fois les jonctions JDU2A et JDU2B, c'est-à-dire qui couvrent la région complète réarrangée a permis l'identification de trois BACs (X1070, XE377 et XE256) qui ont produit des amplicons avec les deux jeux d'amorces. Les inserts ont été estimés être respectivement d'une taille de 95. 86 et 97 kb. par PFGE. Sur la base de ces résultats de PCR, des données correspondant aux séquences terminales et de la présence de trois fragments chromosomaux HindIII de 37, 36 et 24 kb, les Inventeurs ont conclu que le clone X1070 chevauche le clone X495. Pourtant, il contenait un fragment chromosomal HindIII de 36 kb qui n'était présent ni dans le clone X495 ni dans le clone X094 et, avec les données de séquences terminales, ceci suggérerait la présence d'une troisième copie du site HindIII à 3 594 kb dans la région réarrangée. On a obtenu de nouvelles preuves de ceci quand les clones XE256 et XE377 isolés d'une banque EcoRI dans pBACe3.6, ont été analysés. En fonction des données des séquences terminales, XE256 s'étend du site EcoRI à 3 597 kb au site EcoRI à 3 713 kb, et XE377 du site EcoRI à 3 679 kb au site EcoRI à 3 715 kb. Le fait que ces clones donnaient de façon répétée des amplicons pour les deux régions de jonction citées JDU2A et JDU2B n'était pas en accord avec leur taille et leurs séquences terminales. Pourtant, ces données étaient cohérentes avec le fait que la région de 36 162 pb de DU2 était présente non seulement comme une mais plutôt en tant que deux copies en tandem. L'hybridation (selon la méthode de Philipp et al., 1996) des fragments d'ADN digéré par HindIII des clones XE256, X1070 et XE377 avec une sonde de 0,5 kb de la région génomique 3 675 kb a confirmé les résultats de PCR. Un fragment de 24 kb du clone X1070 s'hybridait, équivalent de celui du clone X495, et un fragment unique de 36 kb qui correspond à une copie additionnelle de DU2 était aussi présent. Deux fragments de 33 et 34 kb du clone XE256 s'hybridaient à la sonde. Le fragment de 33 kb correspond à une région qui s'étend du site HindIII présent dans le vecteur adjacent au site EcoRI de clonage au site HindIII le plus proche dans l'insert mycobactérien, tandis que le fragment de 34 kb est identique à celui également présent dans le clone X094. Le fragment de 33 kb chevauchait en partie le clone X1070 tandis que le fragment de 34 kb HindIII était identique à celui présent dans les clones X094 et XE377.
Ces données indiquaient que deux copies en tandem de DU2 existent dans le génome de BCG-Pasteur. Ceci a été confirmé par les hybridations des produits de digestion par HindIII de l'ADN génomique de BCG-Pasteur, M. tuberculosis H37Rv et M. bovis puisque tous s'hybridaient avec la sonde 3 675. Comme attendu, seulement une bande de 22 kb a été observée avec M. tuberculosis et M. bovis tandis que trois bandes de 24, 34 et 36 kb ont été détectées, par hybridation, dans le génome de BCG-Pasteur. Toutefois, le signal d'hybridation pour le fragment à 36 kb était très faible. Le fait que les bandes de 24 et 36 kb présentes dans le clone de BAC X1070 s'hybrident avec la sonde 3 675 avec la même intensité, alors que celles dans l'ADN génomique de BCG-Pasteur ne le font pas, suggère que seulement une sous-population de la culture de BCG-Pasteur contient la seconde copie de DU2. Ainsi, la différence observée dans l'intensité d'hybridation peut refléter que la seconde copie de DU2 n'a été acquise que récemment et indique que des variants qui contiennent une ou deux copie(s) de DU2 existent probablement dans la même culture de M. bovis BCG-Pasteur.
On a obtenu des résultats similaires avec des fragments d'ADN génomique digérés par XbaI de M. tuberculosis, M. bovis et BCG-Pasteur qui s'hybridaient avec la sonde 3 675. Dans la digestion de M. tuberculosis H37Rv, la sonde 3 675 s'hybridait avec un fragment de 183 kb (position génomique 3 646 kb à 3 829 kb). Le fragment correspondant de M. bovis était d'à peu près 178 kb, cette différence de taille étant due à l'absence de plusieurs éléments d'insertion qui ne sont présents que dans le fragment génomique de 183 kb de M. tuberculosis H37Rv. Le produit de digestion par XbaI de BCG-Pasteur contenait deux fragments de 215 et 250 kb qui s'hybridaient avec la sonde 3 675. Ces deux fragments correspondaient au fragment de 178 kb observé dans le génome de M. bovis augmenté par 36 ou 72 kb en raison de la présence d'une ou de deux copie(s) de DU2. Il est intéressant de noter que le signal d'hybridation pour le fragment de 250 kb était moins intense que le signal obtenu pour le fragment de 215 kb, ce qui confirme les observations précédentes avec les produits de digestion par HindIII.
Ces observations indiquent que cette région du génome de BCG est encore dynamique et qu'une sous-population de cellules est triploïde pour les gènes Rv3213c-Rv3230c, et Rv3290c-Rv3302c. Ces données de comparaison entre la séquence du génome de M. tuberculosis H37Rv et de BCG-Pasteur indiquent que BCG-Pasteur devrait être triploïde pour au moins 58 gènes, et qu'à un point de leur évolution, leur ancêtre commun contenait des copies dupliquées de 60 gènes supplémentaires qui ont été perdues lorsque la délétion interne à DU2 a eu lieu. De plus, la présence de DU1 et de DU2 et, en particulier la mise en évidence du fait que DU2 soit présente sous la forme de deux copies dans une sous-population de BCG-Pasteur, suggère que le processus de duplication en tandem dans BCG est encore dynamique.
L'invention fournit donc des données qui peuvent permettre de comparer les différentes souches de BCG entre elles. Par ailleurs, l'invention montre l'intérêt d'utiliser les stratégies de cartographie par les BACs en tant que complément du séquençage du génome et permet la mise en évidence des éventuels inconvénients des projets qui ne sont basés que sur le séquençage de clones par la technique « de coup de fusil ». Ainsi, sans cette librairie de BACs, il est très probable que ces réarrangements génomiques complexes présents dans les souches de M. bovis BCG n'auraient pas été détectés. C'est donc un avantage de la présente invention que de fournir des données qui permettent la caractérisation et éventuellement les classifications immunogéniques et protectrices, des différentes souches de BCG aujourd'hui utilisées en clinique et pour des applications vaccinales, ainsi que de fournir des éléments qui permettent l'identification spécifique de M. tuberculosis par rapport à M. bovis et M. bovis BCG, ou des éléments qui permettent l'identification spécifique de M. bovis BCG par rapport à M. bovis. La présente invention fournit ainsi des éléments importants pour l'étude et l'épidémiologie de la tuberculose, ainsi que pour les prochaines études de réarrangements génomiques dans les différentes bactéries. La technique développée dans la présente invention est exemplifiée par les résultats de la présente invention et peut être appliquée à d'autres génomes bactériens et/ou de parasites.
Ainsi, le fait que M. bovis BCG-Pasteur et deux autres sous-souches de M. bovis BCG ont un jeu complètement dupliqué de gènes responsables de procédés majeurs tels que, entre autres, la division cellulaire et la traduction du signal, comprenant deux origines de réplication, est l'un des aspects surprenant révélé aux inventeurs par cette approche des comparaisons génomiques.
Puisque le matériel biologique est sujet à changements, et étant donné que les essais de vaccination BCG ont donné des résultats très variables de protection (0-80 %), il pourrait être important d'évaluer si cette variation dans l'efficacité de protection peut être attribuée en partie au choix de la sous-souche BCG utilisée.
Il convient donc de mener des investigations complémentaires afin de déterminer s'il existe une corrélation entre les particularités génomiques et les variations phénotypiques parmi les différentes sous-souches de BCG.
Les banques de BAC ont été déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Dr Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France selon les dispositions du Traité de Budapest.
Cette liste de références citées par le demandeur vise uniquement à aider le lecteur et ne fait pas partie du document de brevet européen. Même si le plus grand soin a été accordé à sa conception, des erreurs ou des omissions ne peuvent être exclues et l'OEB décline toute responsabilité à cet égard.