| (19) |
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(11) |
EP 1 241 267 A8 |
| (12) |
KORRIGIERTE EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG |
| (48) |
Corrigendum ausgegeben am: |
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08.01.2003 Patentblatt 2003/02 |
| (43) |
Veröffentlichungstag: |
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18.09.2002 Patentblatt 2002/38 |
| (22) |
Anmeldetag: 14.03.2002 |
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| (51) |
Internationale Patentklassifikation (IPC)7: C12Q 1/68 |
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| (84) |
Benannte Vertragsstaaten: |
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AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR |
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Benannte Erstreckungsstaaten: |
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AL LT LV MK RO SI |
| (30) |
Priorität: |
14.03.2001 EP 01106265
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| (71) |
Anmelder: Viscum AG |
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64673 Zwingenberg (DE) |
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| (72) |
Erfinder: |
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- Aygün, Hüseyin
60322 Frankfurt (DE)
- Wojczewski, Sylvia
65812 Bad Soden (DE)
- Eck, Jürgen
64646 Heppenheim (DE)
- Langer, Martin
76227 Karlsruhe (DE)
- Zinke, Holger
64673 Zwingenberg (DE)
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| (74) |
Vertreter: VOSSIUS & PARTNER |
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Siebertstrasse 4 81675 München 81675 München (DE) |
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| (54) |
Enzym-Aktivitätstest mittels fluoreszenzmarkierter Oligonukleotid-Substrate |
(57) Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Substanz mit einer enzymatischen
Aktivität, die zu einer sequenzspezifischen Depurinierung oder Depyrimidinierung einer
Nukleinsäure ohne Strangabbruch führt, oder mit einer sequenzspezifischen Endonucleaseaktivität,
in einer Probe, wobei (a) die Probe (aa) mit einem Substrat in Kontakt gebracht wird,
das (i) drei Nukleinsäuresequenzabschnitte (A, B und C) aufweist, wobei der Nukleinsäuresequenzabschnitt
B zwischen den Abschnitten A und C liegt die Nukleinsäuresequenzabschnitte A und C
Sequenzen aufweisen, die komplementär zueinander sind und somit unter physiologischen
Bedingungen miteinander hybridisieren und dadurch das Substrat eine Haarnadelstruktur
ausbildet und wobei der Nukleinsäuresequenzabschnitt B oder die Nukleinsäureabschnitte
A und C nach Hybridisierung ein Erkennungsmotif für die Aktivität enthalten; und (ii)
ein Fluorophor-Quencher-Paar aufweist, wobei das Fluorophor kovalent mit Sequenzabschnitt
A oder C verbunden ist und der Quencher kovalent mit dem anderen Sequenzabschnitt
(C oder A) verknüpft ist und wobei Fluorophor und Quencher sich bei der Hybridisierung
der DNA-Sequenzen in räumlicher Nähe zueinander befinden, so daß die vom Fluorophor
emittierte Lichtenergie vom Quencher gequencht wird; und (ab) sofern die Substanz
eine Substanz mit einer enzymatischen Aktivität ist, die zu einer sequenzspezifischen
Depurinierung oder Depyrimidinierung einer Nukleinsäure ohne Strangbruch führt, mit
einem Agens in Kontakt gebracht wird, das das Substrat spezifisch an einer Nukleotidposition
im Bereich des Nukleinsäuresequenzabschnitts B spaltet, die durch die Substanz depuriniert
oder depyrimidiniert wird; und (b) anhand der Emission der Fluorphorspezifischen Lichtenergie
ermittelt wird, ob eine Substanz mit der genannten Aktivität in der Probe vorhanden
ist. Vorzugsweise enthält die zu testende Probe ein Ribosomen-inaktivierendes Protein
(RIP), in einer besonderen Ausführungsform Mistellektin. Ferner betrifft die Erfindung
einen Test-Kit zur Ausführung des Verfahrens welcher das spezifisch mit Fluorophor
und Quencher markierte Substrat, die chemischen Spaltungsreagenzien sowie gegebenenfalls
die für die Reaktionen vorbereiteten Reaktionsgefäße enthält.