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(11) | EP 1 380 311 A1 |
| (12) | EUROPÄISCHE PATENTANMELDUNG |
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| (54) | Verfahren zum Herstellen eines Präparats zur Förderung der Regeneration von Knochenstoff |
[0001] Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der morphoinduktiven Knochentransplantate, die in vielfältigen Bereichen am menschlichen Körper anwendbar sind, insbesondere für plastische Operationen in der Neurochirurgie, in der Otorhinolaryngologie, in der Kiefer- und Gesichtschirurgie, der Traumatologie, Orthopädie und Onkologie.
[0002] Knochendefekte am menschlichen Körper sind die Folge von Geburtsfehlern, von Unfällen oder Krankheiten. Solche Defekte können nicht nur aus Fehlstellungen oder Abnutzungen bestehen, sondern auch darin, dass Knochen oder Knochenteile fehlen.
[0003] Zur Behebung solcher Defekte gibt es Prothesen oder Ersatzstücke, von denen wohl die Metall- oder Kunststoffplatten für den Ersatz fehlender Teile der Schädeldecke und künstliche Gelenke dem breiten Publikum am meisten bekannt geworden sind. Es ist indessen auch bekannt, dass der Einsatz solcher körperfremden Ersatzstücke keineswegs eine ideale Lösung zur Behebung der entsprechenden Defekte darstellt. Unter medizinischen, insbesondere auch psychologischen Gesichtspunkten wäre einer Reparatur der Defekte durch körpereigene Kräfte, soweit dieses möglich ist, der Vorzug zu geben.
[0004] Die Erfindung geht von der Überlegung aus, morphogenetische Proteine, die die Natur für die Regelung des Prozesses der reparativen Osteogenese vorgesehen hat, für die Behandlung der vorgenannten Defekte nutzbar zu machen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem aus menschlichen Knochen, die einer Knochenbank entnommen sind, ein Präparat hergestellt werden kann, mit dem nach Applikation im menschlichen Körper der induktive Mechanismus der Regeneration und die Differierung der multipatenten Zellen in Knochenzellen in Gang gesetzt werden kann.
[0005] Das erfindungsgemäße Verfahren ist im Anspruch 1 beschrieben. Bevorzugte Ausführungsformen davon sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein nach der Erfindung hergestelltes Präparat ist Gegenstand des Anspruchs 13.
[0007] Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Röhrenknochen verwendet, die einer Knochenbank entnommen werden und von 25- bis 50-jährigen Spendern stammen. In diesem Alter sind die Knochen nämlich besonders reich an morphogenetischen Proteinen. Die Knochen werden mechanisch gereinigt, denn es wird nur das reine Knochenmaterial benötigt. Muskeln, Knochenhaut und Knochenmark müssen entfernt werden.
[0008] Um die Knochen besser bearbeiten zu können, zerteilt man sie in kleinere Stücke von etwa 2 bis 4 cm Größe. Dieses hängt von dem Gerät ab, mit dem die Knochenteile später nochmals zerstückelt werden.
[0009] Die zerkleinerten Knochenteile werden abgetrocknet, vorzugsweise lediglich mit einem Tuch. Eine vollkommene Durchtrocknung mittels Luft oder Wärmeeinsatz ist nicht erforderlich. Dann werden sie 18 bis 24 Stunden tiefgefroren bei einer Temperatur zwischen -10°C und -40°C, vorzugsweise um etwa -20°C, aufbewahrt, um sie für die nachfolgende Zerteilung in kleine Stücke vorzubereiten und um eine Autolyse der Stoffe zu vermeiden. Sodann werden die Knochenteile in kleine Stücke unterteilt, deren größte Abmessungen 1 mm nicht überschreiten sollten. Bevorzugt sind Abmessungen von 0,5 mm x 0,5mm x 1 mm. Die Größe dieser Knochenstücke ist optimal für das spätere Zusammenwirken des Endprodukts mit dem Blut und anderen Stoffen des behandelten Patienten. Bei der Bearbeitung des Knochenmaterials bei diesem Schritt sollte die Temperatur unter 15°C bleiben, weil die Proteine sonst inaktiviert werden.
[0010] Die kleinen Knochenstücke werden dann in einem inerten Behälter mit einer 0,2 bis 0,5%igen Formaldehydlösung übergossen, wobei das Volumenverhältnis von Formaldehyd zu Knochen zwischen 1 : 5 und 1 : 10 liegen sollte und vorzugsweise bei 1 : 7 liegt. Die verwendete Formaldehydlösung ist vorzugsweise aus einem 35 oder 25%-igen, methanolfreien, extra reinen Formaldehyd gewonnen, das in einer 0,85 bis 0,95%-igen Natriumchloridlösung gelöst worden ist. Diese Behandlung hat den Zweck, die Proteine zu fixieren. Durch die methanolfreie Formaldehydlösung und die Natriumchloridlösung werden nämliche die Proteine fixiert, ohne inaktiviert zu werden.
[0011] Die Behandlungsdauer in der Formaldehydlösung beträgt etwa 48 Stunden, wobei die Temperatur zwischen 2°C und 15°C gehalten wird. Dabei ist aber ein Wechsel der Formaldehydiösung nach 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden, jeweils gerechnet vom Beginn der Aufbewahrung in der Formaldehydlösung, durchzuführen, weil für die volle Fixierung der Proteine stets frische, freie Formaldehydmoleküle benötigt werden. Zwischen den einzelnen Wechsein der Formaldehydlösung wird der Behälter stündlich für jeweils etwa eine Minute gerüttelt, damit die kleinen Knochenstücke nicht zusammenbacken.
[0012] Nach Abschluss dieser Behandlung wird die Formaldehydlösung abgegossen, und es wird eine 1 bis 3%-ige, vorzugsweise 1,5%-ige, chemisch reine Salzsäure eingegossen. Mit dieser werden Phosphor- und Calciumsalze entfernt, die durch ihre Natur die Wirksamkeit der morphogenetischen Proteine blockieren.
[0013] Nach einer Einwirkzeit der Salzsäure von 24 +/- 2 Stunden wird die Salzsäure abgegossen und erneut eine 0,2 bis 0,5%-ige, vorzugsweise 0,25%-ige Formaldehydlösung eingegossen, um die Proteine fixiert zu behalten.
[0014] Nach einer Einwirkzeit von 24 +/- 2 Stunden wird die Formaldehydlösung abgegossen und erneut eine Salzsäure der vorgenannten Art eingegossen, um den Demineralisierungsprozess fortzusetzen.
[0015] Der Wechsel von Formaldehydlösung und Salzsäure wird insgesamt etwa 12 bis 14 mal wiederholt, um immer neue Proteine zu öffnen und zu fixieren. Im Prinzip wird damit ein Demineralisierungsprozess durchgeführt und optimiert. Während dieser gesamten Behandlung wird die Temperatur stets unter 15°C gehalten.
[0016] Nach dem letzten Abgießen der Salzsäure wird eine 1%-ige Natruimthiosulfatlösung eingegossen, die man wenigstens 5 min und bis zu 60 min lang einwirken lässt und dann abgießt. Hiermit soll die Wirkung der Salzsäuremoleküle neutralisiert werden.
[0017] Nach dem Abgießen der Natriumthiosulfatlösung wird eine 1,5%-ige Ammoniaklösung eingegossen, die man 5 min einwirken lässt und dann abgießt. Hiermit sollen die Moleküle der Formaldehydlösung inaktiviert werden.
[0018] Anschließend wird eine 0,01 bis 0,1%-ige Lösung von Chlorhexidin bigluconat eingegossen, die als Grundlage einen 70%-igen Ethylalkohol hat. Diese Lösung lässt man 10 min bis 2 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde, einwirken und gießt sie dann ab. Der Zweck dieser Maßnahme ist eine vollständige Sterilisation des Knochenstoffs.
[0019] Dann wird ein 70%-iger Ethylalkohol eingegossen, den man nach 4 bis 8 Stunden, vorzugsweise 6 Stunden, und nochmals nach 24 bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, jeweils vom Beginn des erstmaligen Eingießens, wechselt. Mit dieser Maßnahme werden Fette und fettgebundene Proteine entfernt und die antigene Aktivität des behandelten Produkts reduziert.
[0020] Nach 48 Stunden wird der Ethylalkohol abgegossen und an seiner Stelle eine 3,6 bis 3,7%-ige Trisaminlösung (Trisamin = Trioxymethylaminomethan) eingegossen. Diese dient der vollen Detoxikation und der Normalisierung der pH-Werte des Produkts. Die Trisaminlösung wird nach 1 Stunde Einwirkzeit abgegossen, und an ihrer Stelle wird eine 0,9%-ige Natriumchloridlösung eingegossen. Der Grund dafür ist, dass die Proteine in einer Lösung aufbewahrt werden sollen, die neutral für den Körper ist, eine sogenannte isotonische Lösung.
[0021] Diese Natriumchloridlösung wird jeweils nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 24 Stunden, jeweils gerechnet vom erstmaligen Einfüllen, gewechselt und schließlich nach einer weiteren Stunde abgegossen. Sie dient dazu, alle toxischen Produkte vollkommen zu entfernen, die durch die vorangehende Einwirkung der chemischen Stoffe auf das Produkt entstanden sind. Abweichung von den Wechselintervallen der Größenordnung von +/- 10 min sind unschädlich.
[0022] Nach dem letzten Abgießen der Natriumchloridlösung lässt man das Produkt abtropfen. Dieses ist nun fertig. Es ist eine Paste, die eine Konstitution wie feuchter Sand hat. Sie ist in gewissem Umfang fließfähig und lässt sich beispielsweise mit geeignet dicken Kanülen spritzen. Diese Paste wird portioniert und verpackt und ist tiefgekühlt aufzubewahren. Ihre höchste Wirksamkeit hat sie in den ersten sechs Monaten nach ihrer Herstellung.
[0023] Zur Anwendung wird diese Knochenpaste in die Bruchstelle oder Defektstelle der Knochen durch einen chirurgischen Schnitt oder mit einer Spezialspritze mit dicker Kanüle eingeführt. Der Vorteil der Behandlung mit der in erfindungsgemäßer Weise hergestellten Paste besteht darin, dass in der Matrix des Knochenstoffs alle angeborenen Proteine erhalten sind, nämlich die morphogenetischen, die für den Beginn und die Regelung des Regenerationsprozesses der reparativen Osteogenesis zuständig sind, sowie die nichtmorphogenetischen, die die Knochenregeneration unterstützen. Gleichzeitig werden die antigenen Eigenschaften reduziert, die toxischen Reagenzien neutralisiert und beseitigt.
a) Röhrenknochen von 25- bis 50-jährigen Spendern werden von Muskeln, Knochenhaut und Knochenmark befreit, in 2 bis 4 cm große Teile zerteilt und abgetrocknet;
b) die Knochenteile werden auf eine Temperatur von -10°C bis -40°C tiefgekühlt und in diesem Zustand 18 bis 24 Stunden aufbewahrt;
c) die tiefgefrorenen Knochenteile werden in kleine Stücke im Größenbereich (0,1 bis 1) mm x (0,1 bis 1) mm x (0,1 bis 1) mm zerteilt, wobei die Bearbeitungstemperatur unter 15°C gehalten wird;
d) die kleinen Knochenstücke werden in einem inerten Behälter mit einer 0,2 bis 0,5 %-igen Formaldehydlösung mit einem Volumenverhältnis Formaldehydlösung zu Knochen von 1 : (5-10) übergossen, wobei die Formaldehydlösung aus 35 oder 25 %-igem, methanolfreiem, extrareinem Formaldehyd gewonnen ist, das in einer 0,85 bis 0,95 %-igen Natriumchloridlösung gelöst wurde;
e) die Knochenstücke werden in der Formaldehydlösung für 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 2°C und 15°C aufbewahrt, wobei die Formaldehydlösung nach 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden, jeweils gerechnet vom Beginn der Aufbewahrung an, gewechselt wird und zwischen den Wechseln der Behälter in Intervallen von jeweils 1 Stunde etwa 1 Minute lang geschüttelt wird;
f) nach Abschluß der Behandlung im Schritt e) wird die Formaldehydlösung abgegossen und eine 1 bis 3 %-ige, chemisch reine Salzsäure eingegossen;
g) nach einer Einwirkzeit der Salzsäure von 24 +/- 2 Stunden wird die Salzsäure abgegossen und erneut eine 0,2 bis 0,5 %-ige Formaldehydlösung eingegossen;
h) nach einer Einwirkzeit der Formaldehydlösung von 24 +/- 2 Stunden wird die Formaldehydlösung abgegossen und wieder eine 1 bis 3 %-ige Salzsäure eingegossen;
i) die Schritte g) und h) werden insgesamt 12 bis 14 mal wiederholt, wobei die Temperatur im Behälter stets unter 15°C gehalten wird;
j) nach dem letzten Abgießen der Salzsäure wird eine 1 %-ige Natriumthiosulfuricumlösung eingegossen, 5 bis 60 Minuten einwirken lassen und dann abgegossen;
k) anschließend wird eine 1,5 %-ige Ammoniakwasserlösung eingegossen, 5 Minuten einwirken lassen und dann abgegossen;
l) sodann wird eine 0,01 bis 0,1 %-ige Lösung von Chlorhexidinbigluconat eingegossen, die als Grundlage einen 70%-igen Ethylalkohol hat, 10 Minuten bis 2 Stunden einwirken lassen und dann abgegossen;
m) dann wird ein 70%-iger Ethylalkohol eingegossen, der nach 4 bis 8 Stunden und nochmals nach 24 bis 48 Stunden, jeweils gerechnet vom Beginn des erstmaligen Eingießens des Ethylalkohols, gewechselt wird;
n) spätestens nach 48 Stunden vom ersten Eingießen wird der Ethylalkohol abgegossen und eine 3,6 bis 3,7%-ige Trisamin (Trioxymethylaminomethan) -Lösung eingegossen;
o) die Trisaminlösung wird nach 1 Stunde Einwirkzeit abgegossen und an ihrer Stelle eine 0,9 %-ige Natriumchloridlösung eingegossen;
p) die Natriumchloridlösung wird nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 24, jeweils gerechnet vom erstmaligen Einfüllen, gewechselt, wobei Zeitabweichungen bei den ersten 6 Wechseln von jeweils +/- 10 Minuten und beim letzten Wechseln von jeweils +/-1 Stunde zulässig sind;
q) nach einer Einwirkzeit von etwa 1 Stunde nach dem letzten Wechsel der Natriumchloridlösung wird diese abgegossen und das entstandene Produkt wird abtropfen lassen.