Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von omega-6-Fettsäuren (PUFA, polyunsaturated fatty acids), insbesondere γ-Linolensäure (GLA) in Ciliaten. Die Lipide/Fettsäuren können in der menschlichen/tierischen Ernährung, sowie im Pharmabereich zum Einsatz kommen.
Die Ciliaten, aus denen die Lipide/Fettsäuren gewonnen werden, sind vorzugsweise Tetrahymena spec. und besonders bevorzugt Tetrahymena thermophila.
In
Da Vertebraten keine Doppelbindungen hinter Position 9 in Fettsäuren einfügen können, sind ungesättigte Fettsäuren wie LA und ALA essentielle Nährstoffe, die von Vertebraten nicht synthetisiert werden können, und in der Ernährung hauptsächlich aus pflanzlichen Quellen stammen. LA kann von Säugern durch eine delta 6-Desaturase in GLA umgewandelt werden - eine ARA-Vorstufe - das ein essentielles Vorläufermolekül der meisten Prostaglandine ist. Die Bildung von Stearidonsäure (18:4 Δ6,9,12,15) - einem Vorläufermolekül der EPA - aus ALA wird ebenfalls mittels delta 6-Desaturase katalysiert. Die delta 6-Desaturase ist damit der erste essentielle Schritt in der Biosynthese der Eicosanoide.
Es hat sich gezeigt, daß die Aktivität der delta 6-Desaturase bei Säugern durch Faktoren wie z. B. Alkoholkonsum, Streß, Mangelernährung und Alterungsprozesse beeinträchtigt wird (Huang & Mills, 1996;
Der Befund, daß GLA vielfältige positive Einflüsse auf den menschlichen Körper ausübt, wurde inzwischen durch eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien untermauert. So wurde die positive Wirkung der GLA z. B. auf atopische Ekzeme, Rheumatische Arthritis, Atheriosklerose, diabetische Neuropathie, Migräne, Schizophrenie und Krebs durch klinische Studien nachgewiesen. In diesen Studien wurde sowohl eine statistisch als auch eine klinisch signifikante Verbesserung des Krankheitsbildes erzielt.
Aufgrund dieser positiven Eigenschaften besteht ein breites Anwendungsspektrum für GLA in der Pharma-, Kosmetik-, Tierfutter- und Lebensmittelindustrie
Die meisten PUFA aus Menschen und Tieren stammen entweder direkt aus der Ernährung oder entstehen durch die Umsetzung der durch die Ernährung zugeführten essentiellen Fettsäuren durch Desaturasen und Elongasen.
Nur wenige der kommerziell genutzten Ölsaaten produzieren GLA. GLA kommt nur im Samen verschiedener Pflanzen wie der Nachtkerze (Oenothera biennis, ca. 10% GLA, bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt), Borretsch (Borago officinalis, ca. 23%) und der Schwarzen Johannisbeere (Ribes nigrum, ca. 18%) vor. Daneben sind auch verschiedene Mikroorganismen als Quellen für GLA bekannt, wie z. B. die Pilze Mucor und Mortierella (bis zu ca. 25%), die Blaualge Spirulina (ca. 12-18%) und andere. Als besonders GLA-reiche Quelle wurden Ciliaten wie z. B. Tetrahymena (bis zu 47%;
Die fermentative Gewinnung von GLA aus verschiedenen Pilze wie z.B. Mortierella und Mucor wurde in der Literatur bereits beschrieben (
Die kommerzielle Gewinnung von GLA aus diesen natürlichen Quellen ist also mit schwerwiegenden Nachteilen und Problemstellungen behaftet, die eine Nutzung in industriellem Maßstab bisher verhindert haben. Sowohl die Qualität als auch die Quantität der aus diesen Organismen gewonnen Öle schwanken, und die Öle weisen eine sehr heterogene Zusammensetzung auf, was aufwendige und teure Reinigungsschritte nötig macht, um die GLA anzureichern. Der Anbau GLA-haltiger Pflanzen ist darüberhinaus nicht sehr wirtschaftlich (
Aus diesem Grunde bietet die fermentative Herstellung von GLA durch Mikroorganismen eine an sich vielversprechende Alternative zu anderen GLA-Quellen, die aber bisher nicht in zufriedenstellendem Maße verwirklicht werden konnte.
Das Fettsäurespektrum vieler Mikroorganismen ist weniger heterogen als bei höheren Organismen, was bei der Reinigung Vorteile bietet. Darüber hinaus ist die fermentative Herstellung nicht von externen Faktoren wie Wetter, Nahrungsangebot etc. abhängig. Außerdem sind auf diese Weise hergestellte PUFA weitgehend frei von Kontaminationen, die z.B. auf Umweltverschmutzung zurückzuführen sind. Ein weiterer Vorteil ist die im Gegensatz zu GLA aus z.B. pflanzlichen Quellen gesicherte Verfügbarkeit der durch fermentative Prozesse gewonnenen GLA.
Aufgrund des immensen Interesses, PUFA bzw. GLA industriell zur Verfügung zu stellen, gibt es im Stand der Technik eine Fülle von Versuches, die fermentative Produktion dieser Fettsäuren zu optimieren. Beispiele hierfür sind zu finden in
Für den Mikroorganismus Mortierella konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von Kohlenwasserstoffen in das Kulturmedium zu einer Konzentrationserhöhung der von Mortierella produzierten Dihomo-γ-Linolensäure führt (
Ferner wurden bereits zur Untersuchung der Fettsäure-Biosynthese in Tetrahymena Tetrahymena pyriformis in Gegenwart von Palmitoleinsäure bzw. Stearinsäure kultiviert und die von den Mikroorganismen produzierten Lipide isoliert (
Aufgrund seines natürlicherweise bereits relativ hohen GLA-Gehalts könnte besonders Tetrahymena für eine fermentative Gewinnung von GLA geeignet sein. Tetrahymena kann im Fermenter kultiviert werden und es können hohe Zelldichten erreicht werden (
PUFA (dazu gehört GLA) liegen.in Tetrahymena überwiegend gebunden in den Phospholipiden (PL) der Zellmembranen vor. Die Zellen beinhalten 3,5 bis 4 mal mehr Phospholipid als Neutrallipid (Speicherlipide) (
Die Menge der Neutrallipide (Speicherlipide) pro Zelle kann hingegen gesteigert und in Form von Lipidtröpfchen akkumuliert werden. Dies ist für die gezielte Fütterung von Acetat beschrieben worden (
Der Anteil an GLA in den Neutrallipiden (NL) ist allerdings sehr gering (6,7 % (w/w) im NL zu 25,6 % (w/w) im Gesarntlipid (
Für Tetrahymena pyriformis wird ein Anstieg der Zellzahl bei der Zufütterung von Acetat beschrieben (von 1,2x105 auf 1,6x105 Zellen pro mL bei der Zugabe von 0,1% Acetat zu einem basalen Medium, das keine Glucose beinhaltet. Bei einem basalen Medium, das Glucose beinhaltet, ist der Anstieg nicht signifikant (1,85x105 ohne bzw. 1,9x105 Zellen pro mL mit Acetat) (
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von PUFA, bevorzugt GLA, zur Verfügung zu stellen, mit dem deutlich erhöhte GLA-Ausbeuten in industriellem Maßstab erreicht werden können. Dieses Verfahren soll technisch unkompliziert, einfach in der Handhabung, sicher und preiswert sein.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, den GLA-Gehalt im Neutrallipid zu steigern, um die GLA in einer reineren Form zu erhalten.
Gelöst werden diese sowie weitere, nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch ein Verfahren mit allen Merkmalen des Patentanspruchs 1. Zweckmäßige Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen unter Schutz gestellt.
Dadurch, daß man Ciliaten unter an sich bekannten Bedingungen im Fermenter kultiviert und GLA-Vorläufermoleküle und Acetat dem Kulturmedium zusetzt, kann nämlich in nicht vorhersehbarer Weise eine erhöhte Ausbeute an GLA erreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Ciliaten um Tetrahymena spec.,
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Ciliaten Tetrahymena rostrata (z. B. ATCC 30770)
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Ciliaten um Tetrahymena pyriformis (z. B. A TCC 30039, 30005, 30202).
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Ciliaten um Tetrahymena thermophila B1868 VII (z. B. ATCC 30384)
Bevorzugt ist es, wenn das Acetat erst 20-39 Stunden nach Kulturbeginn zugegeben wird, besonders bevorzugt, wenn es erst nach 25-35 Stunden zugegeben wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Acetat 2-stufig zuzugeben wird.
Daher ist es eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wenn ein erster Fütterungspuls 20-39 Stunden nach Beginn der Kultivierung und ein zweiter Fütterungspuls 40-70 Stunden gegeben wird, wobei es besonders bevorzugt wird, wenn ein erster Fütterungspuls nach 25-35 Stunden und ein zweiter Fütterungspuls nach 50-60 Stunden gegeben wird.
Eine weitere, besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem kontinuierlichen Zusetzen des Acetats über den gesamten Zeitraum der Kultivierung, wobei das Zusetzen 20 Stunden nach Beginn der Kultivierung, besonders bevorzugt 25 Stunde nach Beginn der Kultivierung begonnen wird, wobei das Acetat in einer Rate von mindestens 0,05 g/L pro Stunde zugesetzt wird.
Bevorzugt handelt es sich bei den GLA-Vorläufermolekülen um Palmitinsäure (C16:0), Stearinsäure (C 18:0), Ölsäure (C18:1) und/oder Linolsäure (C18:2) bzw. um Triglyceride, Diglyceride, Monoglyceride, Phospholipide, Ester oder Salze der entsprechenden Vorläufermoleküle.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die GLA-Vorläufermoleküle in Form von natürlichen Ölen wie Sonnenblumenöl der Kultur zugesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die GLA-Vorläufermoleküle in Form von Distelöl der Kultur zugesetzt.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die GLA-Vorläufermoleküle in Form von Olivenöl der Kultur zugesetzt.
Das Acetat wird bevorzugt in Form der Essigsäure oder als Salz der Essigsäure zugesetzt, beispielsweise als Natriumacetat.
In den Untersuchungen der vorstehend genannten Erfinder, die zu vorliegender Erfindung geführt haben, wurde überraschenderweise gefunden, daß eine Zugabe von Acetat vor der Animpfung und auch während der Kultur zu einem schlechteren Wachstum führt (Beispiel 3). Sowohl das Fettsäurespektrum als auch der GLA-Gehalt der Biomasse änderte sich nicht wesentlich, so daß es insgesamt zu einer Verschlechterung der GLA-Ausbeute kommt.
In verschiedenen, daraufhin durchgeführten Fütterungs-Experimenten, bei denen Tetrahymena entweder nur Fettsäurevorläufer, nur Triacylglyceriden der Vorläufermoleküle, nur Acetat oder eine Kombination aus Triacylglyceriden der Vorläufermolekille und Acetat gefüttert wurde, wurde überraschenderweise gefunden, daß eine kombinierte Fütterung von Tetrahymena spec. mit den genannten Vorläufermolekülen und mit Acetat eine besonders wünschenswerte Steigerung sowohl des Neutrallipid-Gehalts als auch des GLA-Gehaltes in den Neutrallipiden hervorbringt, was zu einer Erhöhung des GLA-Gehaltes in der BTM um 250% von 2,0 % (w/w) auf 5,0 % (w/w) führt. Besonders überraschend war es, daß eine zeitversetzte Zugabe von Acetat, etwa 20-40 Stunden nach Beginn der Kultivierung besonders hohe Ausbeuten an GLA hervorbringt. Zum Vergleich wurden Standardkultivierungen ohne Zugaben von Fettsäurevorläufer und Acetat durchgeführt.
Erfindungsgemäß werden also Ciliaten unter Bedingungen kultiviert, unter denen sie einen hohen PUFA-Gehalt, bevorzugt einen hohen GLA-Gehalt aufweisen.
Unter hohem PUFA-Gehalt bzw. GLA-Gehalt wird dabei für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verstanden, daß die entsprechenden Fettsäuren in Form der freien Fettsäuren, als Phospholipid, als Neutrallipid oder auch in anderen Formen, in denen Fettsäuren unter biologischen Normalbedingungen vorliegen können, in der Zelle und/oder der Kulturbrühe vorliegen.
Die Methoden, mit denen das γ-Linolensäurehaltige Lipid bzw. die γ-Linolensäure dann aus der Kultur bzw. der Kulturbrühe isoliert werden können, sind dem Fachmann dabei geläufig.
Ein Verfahren kann es dabei sein, zur Isolierung des γ-Linolensäurehaltigen Lipids aus den Ciliaten folgende Stufen durchzuführen:
Ein weiteres Verfahren zur Isolierung der freien γ-Linolensäure oder deren Ester aus den Ciliaten könnte es sein, folgende Stufen durchzuführen:
Ein weiteres Verfahren zur Isolierung der freien γ-Linolensäure direkt aus der Fermentationsbrühe könnte folgende Stufen umfassen:
Weiterhin ist es für den Fachmann naheliegend, aus den z.B. wie oben gezeigt erhaltenen Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäureestern Strukturlipide (z.B. Triglyceride, Phospholipide) zu synthetisieren.
Es ist klar, daß dem Fachmann eine Vielzahl ähnlicher Reinigungsmethoden zur Verfügung stehen, die in einem oder mehreren dieser Stufen abgewandelt werden können, ohne daß der Umfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird. Selbst ein völlig anderes Reinigungsschema würde hieran nichts ändern, da aus dem Stand der Technik viele unterschiedliche Reinigungsschemata herleitbar sind, und eine solche selektive Aufreinigung dem Standardkönnen des Fachmanns entspricht.
Die nachfolgend erläuterten Figuren tragen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung bei.
Dem Fachmann ist angesichts der vorstehenden Ausführungen klar, das mit einer Vielzahl weiterer Tetrahymena spec., wie z.B. T. silvana (z. B. ATCC 50084), T. malaccensis (z. B. ATCC 50065), T. asiatica (z. B. ATCC 50068), T. borealis (z. B. ATCC 30203), T. canadensis (z. B. ATCC 50098), T. australis (z. B. ATCC 30349), T. vorax (z. B. ATCC 30421), T. furgasoni (z. B. ATCC 9357), T. setosa (z. B. ATCC 30782) und T. tropicalis (z. B. ATCC 30275) ähnlich gute GLA-Ausbeuten unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht werden können.
Die im folgenden aufgeführten Beispiele erläutern die Erfindung näher. Die Beispiele sollen jedoch nicht einschränkend verstanden werden. Wenn nicht anders angegeben wurde, wurden für die einzelne Versuche Tetrahymena thermophila B1868VII (z. B. ATCC 30384) verwendet.
20 mL MM-Var (siehe Tabelle 1) Medium wurden in 100 mL Erlenmeyerkolben bzw. 100 mL MM-Var Medium in 500 mL Erlenmeyerkolben mit Schikanen gefüllt, mit einem Zellstoff/Baumwoll-Stopfen verschlossen und für 20 min. bei 121 °C sterilisiert.
Gegebenfalls wurden vor dem Sterilisieren weitere Zusätze in das Medium gegeben.
Für die Vorkulturen wurden 100 mL-Kolben mit 20 mL Medium mit MM-var Medium (siehe Tabelle 1) einer Zelldichte von ca. 5x104 - 1x105 Zellen pro mL angeimpft und über 2 Tage bei 25°C, 60 rpm kultiviert. Die Zellzahl erreichte einen Wert zwischen 1x106 und 3x106 Zellen pro mL.
Die Schüttelkolbenversuche würden in 500 mL Erlenmeyer mit 100 mL Medium durchgeführt. Die Versuchskolben wurden mit einer Zelldichte von ca. 5x104-1x105 Zellen pro mL angeimpft und über 2 Tage bei 25°C, 100 rpm kultiviert.
Die Fermentationen wurden in 1-L Fermenter (700 mL Arbeitsvolumen), 5-L Fermenter (3 L Arbeitsvolumen) bzw. 13-L Fermenter (10 L Arbeitsvolumen) durchgeführt. Standardmäßig waren die Fermenter mit einer pH-Elektrode, einer pO2-Elektrode, einen Belüftungsring, einer Rührwelle mit Scheibenblattrührer, Zuleitung für Säure/Lauge, Zuleitung für Feeding, Animpfarmatur und eine Probenahme versehen.
Die Fermenter wurden mit dem Arbeitsvolumen an Medium gefüllt und in einem Sterilisator für eine halbe Stunde bei 123°C sterilisiert,
Die Fermentionsbedingungen waren wie in Tabelle 2 angegeben.
Angeimpft wurden die Fermentationen mit einer Hauptkultur aus einer Schüttelkultur (siehe oben).
Für die Bestimmung der Biotrockenmasse wurden 5 mL Zellkultur für 10 min bei 3400 g und 4°C zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Zellpellet bei -80°C eingefroren. Die gefrorene Biomasse wurde lyophilisiert und das Gewicht der Biotrockenmasse bestimmt.
Die Zelldichte wurde mit dem CASY 1 Cell Counter + Analyser System, Model TTC, Schärfe System ermittelt.
Für eine Messung wurden die Zellen in einer schwachen CASY-Elektrolytlösung verdünnt (1:500) und durch eine Kapillare mit 150 µm Durchmesser gefördert. Die Zellzählung erfolgte in einem Bereich von 15-50 µm Partikelgröße.
Die unpolaren Lipidbestandteile (Neutrallipide) wurden mit n-Hexan aus der Biotrockenmasse extrahiert. Für einen Ansatz wurden ca. 500 mg Biotrockenmasse in 5 mL n-Hexan für 1 h bei 60°C gerührt, anschließend 2 min bei 2700 g zentrifugiert und der Überstand durch Filtration von Schwebstoffen gereinigt. Für die Filtration wurde eine mit Watte gefüllte Pasteur-Pipette verwendet, mit einer Füllhöhe von ca. 1 cm. Der Zellrückstand aus der ersten Extraktion wurde ein weiteres mal mit 5 mL Lösungsmittel extrahiert, die Biomasse abzentrifugiert und der Überstand filtriert. Die gereinigten, organischen Phasen der beiden Extraktionen wurden vereint, das Lösungsmittel am Rotationverdampfer vollständig verdampft und die Menge des extrahierten Lipids durch Wägung bestimmt.
Eine qualitative und quantitative Analyse extrahierter Lipide erfolgte mit Hilfe des IatroscanTM new MK-5-Analysers. Als Chromatographiematerial dienten Trennstäbe (Chromarods) mit thermoresistenten Silicagel als Oberflächenmaterial. Die Stäbe wurden in einem Exikator gelagert und vor jedem Trennvorgang zur Entfernung störender Substanzen abgebrannt. Als Meßbedingungen des FID wurden gewählt: Scanrate 30 s/scan, O2-Strom 2L/min und H2-Strom 160 mL/min.
Das zu analysierende Lipid wurde in einer Konzentration von ca. 10 g/L in Chloroform/ Methanol (2: 1) gelöst und davon 1 µL auf einen Trennstab aufgetragen. Die Trennung erfolgte über einen Zeitraum von 30 min in einem Laufmittel, dessen Zusammensetzung in Tabelle 3 angegeben ist.
Nach dem Lauf wurden die Stäbe 5 min bei 80°C getrocknet und im Iatroscan analysiert. Die Zuordnung und Quantifizierung der Lipide erfolgte durch einen Vergleich mit authentischen Standards. Als Standardlösung wurde ein Gemisch aus 4,65 g/L Tripalmitinsäure, 5,17 g/L Dipalmitinsäure und 5,64 g/L Palmitinsäure gelöst in Methanol/Chloroform (2:1) verwendet. Zur Erstellung von Kalibriergeraden wurde die Lösung in Mengen von 0,5-2,0 µL auf die Trennstäbe aufgetragen, in Lösungsmittel entwickelt und am DC-FID analysiert (Tabelle 4).
Die Bestimmung des Fettsäurespektrums erfolgte mittels Gaschromatographen (HP GC 6890) mit Flammenionisationsdetektor (Hewlett-Packard Company, Wilmington, USA). Als Säule diente eine FFAP (Free Fatty Acid Phase) Permbond (Macherey & Nagel GmbH, Düren). Die Identifizierung der Fettsäuren erfolgte durch den Vergleich mit Retentionszeiten von Fettsäuremethylester-Standards. Auf der Basis der bekannten Konzentration des Standards konnte die Konzentration der Fettsäuren in den Proben bestimmt werden.
30-70 mg der lyophillisierten Biotrockenmasse (siehe Bestimmung der Biomasse) wurden eingewogen und mit 1 mL 20%iger methanolischer HCl und 1 mL methanolischer Standard-Lösung (1 mg/mL) versetzt. Zur Freisetzung der Fettsäuren und deren Umesterung in Fettsäuremethylester wurden die Proben im geschlossenen Reagenzglas zwei Stunden bei 60°C im Wasserbad gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Zum Neutralisieren der Probe wurde anschließend 1 mL wässrige, gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und vorsichtig gemischt. Durch Zugabe von n-Hexan wurden die Fettsäuremethylester extrahiert. Anschließende wurde der Ansatz kräftig durchmischt und durch Zentrifugation für 2 min. bei 4300 rpm eine Phasentrennung erreicht. Etwa 2/3 der oberen, organischen Phase wurden entnommen und 1 µl der Probe wurde auf die GC-Säule gespritz und analysiert (s. auch Tabelle 5).
Zu zwei 500 mL Kolben (100 mL MM-Var Medium wurde 1 mL/L Distelöl vor der Sterilisation zugesetzt. Als Referenz dienten zwei 500 mL Kolben (100 mL MM-Var Medium. Das Distelöl hatte die in Tabelle 6 angegebene Zusammensetzung. Die Fettsäuren lagen in Form der Triglyceride vor.
Die Ergebnisse sind in
Zu zwei 500 mL Kolben (100 mL MM-Var Medium wurde 1 mL/L Olivenöl vor der Sterilisation zugesetzt. Als Referenz dienten zwei 500 mL Kolben (100 mLMM-Var Medium. Das Olivenöl hatte die in Tabelle 6 (oben) angegebene Zusammensetzung. Die Fettsäuren lagen in Form der Triglyceride vor.
Die Ergebnisse sind in
Die Fermentationen wurden in 1-L Fermenter mit 700 mL MM-Var Medium durchgeführt. Eine Fermentation diente als Referenz, zu den anderen beiden wurden 0,5 bzw. 1,0 g/L Natriumacetat (NaAc) dem Kulturmedium vor dem Sterilisieren zugegeben.
Natriumacetat wirkte sich bei den Kultivierungen negativ auf das Zellwachstum von Tetrahymena thermophila B1868VII aus (
Auch die Synthese von Neutrallipiden wurde durch die Zugabe von Natriumacetat nur gering verändert (s. Tabelle 7).
Nach einer Kultivierungszeit von 46 h war noch kein signifikanter Unterschied zur Standard-Fermentation zu erkennen. Erst nach 70 h wurde ein Anstieg beobachtet: Die Zugabe von NaAc ins MM-Var Grundmedium führte zu einer Steigerung des NL-Gehalts von 11% auf 17 % (w/w). Der GLA-Gehalt im Neutrallipid zeigte nur geringe Unterschiede zur Standardfermentation.
Die volumetrische GLA-Produktbildung verschlechterte sich überraschenderweise durch die Zugabe von NaAc (
Die Fermentationen wurden im 1-L Fermenter mit 700 mL MM-Var Medium durchgeführt. Eine Fermentation diente als Referenz, zu den anderen wurden 0.2, 0.5 bzw. 1.0 g/L Natriumacetat (NaAc) in Form einer sterilisierten (20 min, 121°C), 10%-igen Lösung zu der 29. Fermentationsstunde zugegeben. Bei den Fermentionen, zu denen zur 29. Stunde 0.2 und 0.5 g/L NaAc zugefüttert wurden, wurde dieselbe Menge zu der 54. Fermentationsstunde erneut zugegeben.
Natriumacetat wirkte sich bei den Kultivierungen negativ auf das Zellwachstum von Tetrahymena thermophila B1868VII aus (
Auch die Synthese von Neutrallipiden wurde durch die Zugabe von Natriumacetat nur gering verändert (s. Tabelle 8).
Nach einer Kultivierungszeit von 46 h auf Acetat-Medium war kein Unterschied zur Standard-Fermentation zu erkennen. Auch nach 70 h wurde kein signifikanter Anstieg beobachtet.
Die volumetrische GLA-Produktbildung verschlechterte sich durch die Zugabe von Acetat (
Die Fermentationen wurden in 1-L Fermenter mit 700 mL MM-Var Medium durchgeführt. Eine Fermentation diente als Referenz, zu einer wurden 0.5 g/L NaAc und 1 mL/L Distelöl vor dem Sterilisieren zugesetzt und zu einem wurden 0.5 g/L NaAc und 1 mL/L Distelöl gegen Ende der exponentiellen Phase (zur 28. Stunde) zugesetzt.
In
In
Ähnlich gute Ergebnisse konnten auch durch Verwendung von Olivenöl erzielt werden.
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