La présente invention est relative à un vaccin contre la péritonite infectieuse féline (PIF ou FIP pour feline infectious peritonitis), comprenant des peptides immunogènes inclus dans la protéine S du virus de la peritonite infectieuse féline (VPIF) qui n'induisent pas de phénomène de facilitation.
La péritonite infectieuse féline est une maladie systémique, la plupart du temps mortelle, chez les chats sauvages et domestiques. L'agent responsable est un coronavirus, le virus de la péritonite infectieuse féline (VPIF ou FIPV pour Feline Infectious Peritonitis Virus), qui appartient au groupe antigénique qui comprend notamment le coronavirus entérique félin (FECV), le coronavirus canin (CCV), le coronavirus de la gastro-entérite transmissible de porc (TGEV), le coronavirus respiratoire porcin (PRCV) et le coronavirus humain (HCV) qui induit, d'une façon hôte-dépendante, un éventail de symptômes qui vont de l'entérite légère à la maladie débilitante grave, et dans certains cas, jusqu'à la mort.
Le coronavirus félin, comme d'autres coronavirus, est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d'approximativement 30 kilobases. Ce virus est enveloppé et comprend des structures péplomériques dénommées "Spike", spicules ou protéine S. L'extrémité 3' de l'ARN code notamment pour les protéines structurales suivantes :
- une protéine membranaire, également dénommée protéine de matrice (M). La protéine M est la glycoprotéine membranaire la plus abondante (25-30 kDa). Seulement 10 % de la partie N-terminale de la molécule est exposée à la surface du virion. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées.
- une protéine de nucléocapside (N). La protéine N, qui est également une glycoprotéine (45-50 kDa), est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus et elle est nécessaire pour encapsider l'ARN génomique et en particulier pour diriger son incorporation dans la capside. Cette protéine est vraisemblablement impliquée dans la réplication de l'ARN.
- une autre protéine membranaire, la protéine sM (small membrane) est également connue sous le nom de protéine E (enveloppe) (environ 10 kDa). Il s'agit d'une protéine trans-membranaire qui, comme la protéine M, joue un rôle crucial en formant une matrice intégrale pour l'architecture sphérique du virion et son bourgeonnement et
- la protéine S précitée, qui est également une protéine membranaire, qui se présente sous la forme de massues ou "Spike" ou encore spicules (S) et est également désignée sous le nom de protéine du péplomère. La protéine S est une glycoprotéine (200-220 kDa), dont une partie importante (spicules) est située à l'extérieur de l'enveloppe virale. Elle est responsable de l'attachement du virus aux récepteurs de la cellule hôte (aminopeptidase N) et de l'induction de la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire.
Le FIPV, très proche morphologiquement et antigéniquement du FECV, se distingue de ce dernier en ce qu'il a acquis la capacité à se répliquer dans les macrophages [Pedersen, 1995]. Dans la plupart des cas, les chats ayant développé des anticorps contre FCoV, développent une maladie plus grave et plus rapide, après l'épreuve virulente que les chats séronégatifs (absence d'anticorps anti-FCoV). Ce phénomène de facilitation est dû à la formation d'anticorps facilitant l'infection virale, dirigés contre la protéine S [Pedersen, 1980 ; Olsen et al., 1992] et dont l'action a un effet délétère et contraire à celle des anticorps protecteurs, en formant des complexes immuns qui sont plus infectieux, particulièrement pour les macrophages ; ce phénomène, également dénommé ADE, pour "antibody-dependant enhancement", explique probablement, au moins en partie, la faible efficacité des vaccins comprenant la protéine S de coronavirus.
Dans un tel contexte, le développement d'un vaccin sûr et efficace contre les coronavirus félins est donc très problématique.
Or, la péritonite infectieuse féline (PIF) pose un problème important de santé vétérinaire ; en effet, les jeunes chats sont particulièrement sensibles à la PIF : 54 % de tous les cas de PIF concernent des chats ayant moins de 12 mois et 70 % concernent des chats de moins de 4 ans. Parmi ces chats infectés, les infections dues à des souches de coronavirus de type I semblent prédominantes, alors que les infections de type il comptent respectivement pour 5 % et pour 20 à 30 % des cas de FIP aux États-Unis et au Japon [Pedersen et al., 1983; Hohdatsu et al., 1992].
Les deux sérotypes sont caractérisés sur la base de la neutralisation in vitro. Les sérums des chats atteints de FCoVs de type I neutralisent d'autres FcoVs de type I, mais pas les FCoVs de type II et vice versa. On pense que les coronavirus félins de type II ont pour origine des évènements de recombinaison d'ARN pendant lesquels le gène de la protéine S du coronavirus canin a été incorporé au génome des FcoVs de type I [Herrewegh et al., 1998].
Selon les symptômes observés, deux formes de la maladie ont été décrites :
- une forme effusive ou humide, dans laquelle on observe une accumulation de liquide d'ascite, provoquée par une réponse inflammatoire intense et l'activation de la cascade du complément (augmentant la perméabilité vasculaire) [Pedersen, 1976 ; Pedersen, 1980] et
- une forme non-effusive ou sèche, qui se caractérise par peu ou pas d'accumulation de liquide d'ascite, mais dans laquelle on observe, généralement, des dépôts fibrineux granulaires sur différents organes (foie, rate, intestin, poumons). Les résultats d'analyses biochimiques et hématologiques montrent le plus souvent : une anémie, une neutrophilie, une lymphopénie, une augmentation des protéines totales du sérum et une hyperglobulinémie s'accompagnant d'une diminution du taux d'albumine.
En l'absence de traitements efficaces, différents vaccins anti-FIPV ont été proposés, qui mettent en oeuvre des stratégies vaccinales distinctes, eu égard au nombre et au type des antigènes mis en oeuvre et/ou au mode et à la forme d'expression et de présentation des antigènes.
On peut citer par exemple, les vaccins incorporant des virus inactivés entiers [Pedersen, 1983], des virus vivants atténués ou des virus hétérologues vivants (CCV, HCV-229E, TGEV), mais aussi des vaccins vectorisés basés sur les poxvirus, le virus de l'herpès félin (FHV) ou l'adénovirus, qui expriment la protéine S, M ou N ou des fragments simples de ces protéines, en combinaison ou en fusion avec d'autres protéines porteuses [Vennema et al., 1991 ;
Toutefois, de tels vaccins, lorsqu'ils mettent en oeuvre la protéine S, peuvent induire des phénomènes de facilitation par production d'anticorps facilitants, incompatibles avec l'établissement d'une protection efficace.
D'autres voies de recherche de vaccins ont donc été proposées, pour éliminer les anticorps facilitants et ainsi essayer d'induire une immunité humorale efficace.
Ce sont, pour la majorité, des vaccins recombinants sous-unitaires comportant, séparément ou en combinaison, au moins une protéine S, M ou N normale, recombinante ou modifiée ou au moins un peptide inclus dans l'une de ces protéines [
- * l'antigène peut être constitué par une protéine S modifiée au niveau des sites ou des épitopes, spécifiquement associés à l'ADE, en partie N-terminale de la protéine S, c'est-à-dire, de manière plus spécifique : le site A1 (aa 562-598), le site A2 (aa 637-662) et éventuellement le site D [Corapi, W.V. et al., 1995 ;
WO 95/07987 WO 96/06934 WO 95/07987 WO 93/23421 - * l'antigène peut être constitué par une région hautement conservée ou UCD (pour Universal Conserved Domain), constituée par la partie C-terminale de 124 acides aminés (résidus de 1077 à 1276) de la protéine S [
WO 92/08487 WO 93/23421
Le document
Gonon V et al (1999) décrit la caractérisation d'anticorps anti glyproteine 5 associés à la régression de l'infection par le VPIF.
Aussi, ces différentes stratégies peuvent induire une perte d'antigénicité.
Bien que les raisons exactes pour lesquelles certains des antigènes, apparemment prometteurs, donnent des efficacités relativement faibles, restent à déterminer, elles sont susceptibles d'être multifactorielles. Parmi les facteurs les plus critiques, on trouve le type de l'antigène(s) ou de l'épitope(s). Si l'on considère un épitope approprié, l'immunité cellulaire est présumée être la clé effectrice de la protection (bien qu'il y ait quelques études qui démontrent que des réponses neutralisantes d'anticorps pourraient être la clé principale de la protection in vivo). D'autre part, l'antigène devrait être suffisamment immunogène et être capable de le rester en présence d'autres antigènes, compétiteurs ou interférents, comme par exemple d'autres protéines du coronavirus qui seraient nécessaires à la protection ou des antigènes provenant d'autres vaccins ou vaccins associés.
Si la force antigénique peut être améliorée et si la concurrence antigénique peut être surmontée par diverses méthodes, compositions ou combinaisons de celles-ci, la nature protectrice d'un antigène ou d'un épitope, qui sont inhérents à la séquence en acides aminés de l'épitope, demeure invariable, d'où la nécessité du choix judicieux du ou des antigène(s).
En conséquence, aucune des pistes de vaccins précédemment proposées ne présente l'ensemble des conditions requises, à savoir :
- l'obtention d'une immunité humorale protectrice in vivo
- l'absence de production d'anticorps facilitants et,
- l'absence de phénomènes de facilitation in vivo.
La Demanderesse s'est, en conséquence, donnée pour but la production d'un vaccin qui répond mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'il n'induit pas la formation d'anticorps délétères, tout en conservant la capacité à produire une réponse immune protectrice.
La Demanderesse a sélectionné des peptides compris dans la protéine S du coronavirus de la PIF, qui, de manière surprenante, permettent effectivement d'induire une immunité protectrice, sans induire de phénomènes de facilitation.
Pour obtenir un tel vaccin, la démarche qui consiste à rechercher les sites épitopiques que l'on peut généralement déduire par des méthodes basées sur de la modélisation par ordinateur ou par extrapolation de l'antigénicité de la protéine S, à partir d'autres espèces de coronavirus ou par un mélange des deux méthodes, permettant la localisation des séquences les « plus probables », ne permet pas de déduire quels sont les peptides qui ne possèdent pas de propriétés délétères.
La Demanderesse a, en conséquence, mis au point un système qui a permis de sélectionner des peptides compris dans la protéine S particulièrement performants.
La sélection de ces peptides est ainsi liée, de manière surprenante, à la résistance et/ou à la sensibilité des chats aux infections à coronavirus d'une part et à la régression ou à la progression de la PIF d'autre part.
En particulier, la Demanderesse a montré, de manière surprenante, que les peptides sélectionnés étaient reconnus spécifiquement par les sérums de chats spontanément régresseurs (SR).
La presente invention est telle que définie par les revendications.
Les données ci-après résument les correspondances entre les différentes séquences, pour plus de clarté :
- La SEQ ID NO :6 comprend 1452 acides aminés et correspond à la séquence complète de la protéine S de coronavirus de la souche FIPV 79-1146 ;
- La SEQ ID NO:5 comprend 365 acides aminés et correspond aux positions 940-1304 de la séquence SEQ ID NO :6 ;
- Le peptide de SEQ ID NO :2 selon l'invention comprend 21 acides aminés et correspond aux positions 1-21 de la SEQ ID NO :5 ou aux positions 940-960 de la SEQ ID NO :6 ;
- Le peptide de SEQ ID NO :3 selon l'invention comprend 59 acides aminés et correspond aux positions 15-73 de la SEQ ID NO :5 ou aux positions 954-1012 de la SEQ ID NO :6;
- Le peptide de SEQ ID NO :4 de 31 acides aminés correspond aux positions 335-365 de la SEQ ID NO:5 ou aux positions 1274-1304 de SEQ ID NO:6.
En référence aux SEQ ID NO:5 et NO:6 le fragment C-terminal contenant le domaine universel (UCD) et le domaine universel UCD de 124 acides aminés, décrits dans la Demande Internationale
Les peptides selon l'invention sont sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide SEQ ID NO:2, les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés de la séquence SEQ ID NO:2, le peptide SEQ ID NO:3, les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés de la séquence SEQ ID NO:3 Excepté le peptide de séquence LEU-GLY- THR- VAL- ASP-GLU-ASP-TYR-LYS-ARG-CYS- THR- GLY-GLY-TYR- ASP, le peptide SEQ ID NO:4 et les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés de la séquence SEQ ID NO:4.
Lesdits peptides sont inclus entre les acides aminés 940 et 1304 de la protéine S, en référence à la protéine S de SEQ ID NO:6 de la souche FIPV 79-1146 et sont donc sélectionnés dans le groupe constitué par le peptide 7I correspondant aux positions 940-960 (SEQ ID NO:2) de la protéine S de SEQ ID NO:6, les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés et dont la séquence est contenue dans la SEQ ID NO:2, le peptide T12 correspondant aux positions 954-1012 (SEQ ID NO:3) de la protéine S de SEQ ID NO:6, les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés et dont la séquence est contenue dans la SEQ ID NO:3, Excepté le peptide de séquence LEU-GLY- THR- VAL- ASP-GLU-ASP-TYR-LYS-ARG-CYS- THR- GLY-GLY-TYR- ASP, le peptide 14I correspondant aux positions 1274-1304 (SEQ ID NO:4) de la protéine S de SEQ ID NO:6 et les peptides contenant de 12 à 20 acides aminés et dont la séquence est contenue dans la SEQ ID NO:4. De manière surprenante, lesdits peptides :
- n'induisent pas de phénomènes de facilitation, et
- sont aptes à induire une immunité contre des infections à coronavirus, et notamment contre la péritonite infectieuse féline chez les chats.
Aucun des peptides selon l'invention, c'est-à-dire présentant les propriétés d'induction d'anticorps neutralisants et d'absence d'induction d'anticorps facilitants n'inclut le fragment correspondant aux positions 175-298 de la SEQ ID NO :5 ou 1114-1237 de la SEQ ID NO :6, qui peut induire la production d'anticorps facilitants.
En outre, les propriétés immunologiques desdits peptides sont corrélées avec les réactions immuno-protectrices dans un groupe de chats montrant une régression spontanée de l'infection à coronavirus.
Parmi lesdits peptides, le peptide T12 (SEQ ID NO:3) est particulièrement préféré.
Les inventeurs descrivent des peptides, tels que définis ci-dessus, modifiés par des mutations artificielles, des délétions, des insertions, des variations ou des combinaisons de ces événements, à condition que les peptides ainsi modifiés n'induisent pas de phénomènes de facilitation.
L'invention inclut également les peptides tels que définis ci-dessus, sous forme de peptides de synthèse, de peptides répétés, de protéines fusionnées à l'extrémité N- ou C- terminale avec une protéine d'un autre agent pathogène félin (tels que FIV, FeLV, FHV, Calicivirus, Parvovirus, Bordetella, Chlamidia) .
La présente invention a également pour objet un vaccin pour protéger les chats contre la péritonite infectieuse féline (FIP), caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide tel que défini ci-dessus en combinaison avec des substances porteuses et/ou des adjuvants et/ou au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés ; avantageusement, ils sont choisis dans le groupe constitué par des émulsions huileuses, de la saponine, des substances minérales, des extraits bactériens, de l'hydroxyde d'alumine et le squalène.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par des liposomes unilamellaires, des liposomes multilamellaires, des micelles de saponine ou des microsphères solides de nature saccharidique ou aurifère.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vaccin, il comprend en outre d'autres peptides ou protéines virales appropriées.
La présente invention a également pour objet des molécules d'acide nucléique codant pour les différents peptides tels que définis ci-dessus.
De manière plus précise, lesdites molécules d'acide nucléique sont notamment sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:7-9 ainsi que les séquences nucléotidiques contenant de 36 à 60 nucléotides et dont la séquence est contenue dans la SEQ ID NO:8 et les séquences nucléotidiques contenant de 36 à 60 nucléotides et dont la séquence est contenue dans la SEQ ID NO:9.
La présente invention a également pour objet l'utilisation desdites molécules d'acide nucléique pour la construction de vecteurs recombinants (virus ou plasmides), utiles comme vaccins.
La présente invention a également pour objet des vecteurs recombinants, caractérisés en ce qu'ils comprennent une molécule d'acide nucléique, telle que définie ci-dessus.
De manière avantageuse, lesdits vecteurs sont, de préférence, sélectionnés dans le groupe constitué par des vecteurs viraux, tels que les poxvirus, les adénovirus, les rétrovirus, les herpès virus, des vecteurs bactériens, tels que les mycobactéries, entérobactéries ou les lactobacilles et/ou des plasmides incluant une séquence codant pour au moins l'un des peptides tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un vaccin pour protéger les chats contre la péritonite infectieuse féline (FIP), caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Les peptides immunogènes de la protéine S, tels que définis ci-dessus ou les vecteurs recombinants exprimant lesdits peptides sont particulièrement bien adaptés à la prophylaxie des maladies provoquées par les coronavirus, incluant en particulier le FIPV.
De manière avantageuse, lesdits peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique ou par recombinaison de l'ADN correspondant dans une bactérie, un virus, une lavure ou un hôte eucaryote.
Les vaccins selon l'invention sont avantageusement administrés par voie systémique (intramusculaire, sous-cutanée intra-péritonéale ou intraveineuse) et/ou par voie locale (orale, nasale, autres voies muqueuses) ou par combinaison de ces voies et induisent effectivement une réponse immune protectrice contre le coronavirus félin FIPV
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de peptides immunogènes correspondant à un fragment d'une Protéine S de coronavirus, et n'induisant pas de phénomènes de facilitation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la construction d'une banque aléatoire de peptides correspondant à un fragment de protéine S de coronavirus, à partir d'au moins un génome viral de FIPV,
- la mise en contact desdits peptides avec au moins quatre sérums différents de chats spontanément régresseurs (SR), après une infection par le FIPV, à une dilution d'au moins 1/1000ème et
- l'immuno-sélection des peptides interagissant avec lesdits sérums de chats spontanément régresseurs, mais interagissant peu ou même pas du tout avec des sérums de chats présentant des symptômes cliniques (CS) ou des sérums de chats présentant des signes subcliniques de l'infection chronique (CI) avec FIPV.
Un tel procédé permet l'identification des épitopes qui sont spécifiquement corrélés avec des réponses en anticorps protectrices acquises chez les chats spontanément régresseurs (SR) par rapport aux réactions immunes non-protectrices observées dans les groupes de chats présentant des symptômes cliniques (CS) ou des signes subcliniques de l'infection chronique (CI) avec FIPV [Gonon et al., 1999]. Dans un tel procédé :
- l'utilisation de quatre sérums constitue un protocole statistiquement acceptable ;
- la dilution sélectionnée permet d'atteindre à une spécificité que des dilutions inférieures ne permettraient pas d'obtenir (réactions croisées).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- les
Figures 1A et 1B : ces figures illustrent la réactivité des peptides T12 et 7I, avec les différentes catégories de sérums suivantes : SR = chats spontanément régresseurs, CS = chats avec les signes cliniques, CI = chats chroniquement infectés, SPF = chats sans pathogènes spécifiques (contrôle). Des évaluations densitométriques de l'aire sous la courbe (AUC) dans les Western blots sont données en unités arbitraires. Les données représentent des valeurs moyennes (n) du nombre d'échantillons de sérums provenant des groupes respectifs de chats ;figure 1A : réponse en anticorps par rapport à T12 ;figure 1B : réponse en anticorps par rapport à 71. - la
Figure 2 illustre les réponses en anticorps contre T12 avant l'épreuve par la souche de FIPV 79-1146. Les cinq chats vaccinés avec le vaccin T12 sont représentés avec les symboles "pleins" suivants ■, ▲, ●, +, ◆. Les cinq chats non vaccinés sont représentés avec les symboles "vides" suivants □, Δ, ○, +, ◊ .
- la
Figure 3 illustre les réponses en anticorps contre l'antigène viral (FIPV 79-1146) avant l'épreuve par FIPV79-1146. Les cinq chats vaccinés avec le vaccin T12 sont représentés avec les symboles "pleins" suivants ■, ▲, ●, +, ◆. Les cinq chats non vaccinés sont représentés avec les symboles "vides" suivants □, Δ, ○, +, ◊ . - la
Figure 4 représente les réponses en anticorps dirigés contre l'antigène viral (FIPV 79-1146), après l'épreuve par FIPV souche 79-1146. - la
Figure 5 représente une évaluation dans le temps des signes cliniques, suivant l'épreuve avec FIPV 79-1146. Les chats SPF (5 par groupe) ont été vaccinés en sous-cutanée deux fois à un intervalle de trois semaines avec le vaccin de la sous-unité T12, alors que les chats contrôles (5 par groupe) recevaient le placebo de PBS. Les deux groupes de chats ont été infectés avec FIPV 79-1146 pendant six semaines après la deuxième vaccination et les signes cliniques ont été évalués hebdomadairement.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
L'expérience a impliqué initialement 150 chats infectés par le coronavirus félin avec un historique connu ou inconnu des signes cliniques, puis a été réduite à 42 chats pendant la période expérimentale qui a duré plus d'une année, conduisant à la collecte de 133 échantillons de sérum appartenant aux catégories CS (42), CI (48), et SR (43). L'analyse par Western-blot des protéines virales M, N, et S, a montré que les trois catégories de sérums révélaient un schéma distinct de la réactivité antigénique (Tableau I).
Ces données montrent que la régression est corrélée à la réponse en anticorps anti-S ; en outre, on observe également un rapport anticorps anti-S/anticorps anti-M élevé. En revanche, la progression de la maladie ou de l'infection chronique se caractérise par un rapport anticorps anti-S/anti-M plus faible. Les données indiquent également que les réponses en anticorps contre des protéines M et également N sont généralement dominantes en comparaison avec les réponses contre la protéine S, et ont de faibles valeurs indicatives en ce qui concerne le statut de la maladie. Les données montrent également qu'il doit être techniquement possible de discerner l'épitope(s) protecteur(s) résidant dans la protéine S par Western-blot avec des antisérums de SR. Ces épitopes ne sont que très peu ou pas identifiés par des sérums de CS ou de CI.
En utilisant les antisérums obtenus à partir des chats SR, les épitopes appropriés ont été sélectionnés à l'aide d'une banque aléatoire de peptides, construite à partir du génome viral de FIPV, souche 79-1146 (transcrit et coupé par une DNase) ; les fragments obtenus sont introduits dans un système d'expression bactérien (NovaTope). Les fragments du gène S aléatoirement obtenus (50-150 paires de bases) ont été isolés par électrophorèse sur gel d'agarose et insérés dans le vecteur plasmidique (pSCREEN-1b) par la méthode de ligation des dA-dT.
Des cellules compétentes de E. coli (DE3) ont été alors transformées avec le vecteur de recombinaison, ayant pour résultat des transformants de l'ordre de 108 cfu/µg d'ADN.
L'immuno-sélection des colonies, effectuée sur des membranes NC (nitrocellulose) avec 4 sérums différents de SR à une dilution de 1/1000ème a conduit à la sélection d'au moins 20 clones candidats qui ont alors été soumis au séquençage de leur ADN.
Les alignements des séquences d'insertion avec la séquence d'ADN du gène S du FIPV 79-1146 [De Groot, R.J. et al., 1987] ont permis l'identification, entre autres, de trois peptides candidats respectivement appelés 7I (SEQ ID NO :2), T12 (SEQ ID NO :3) et 14I (SEQ ID NO : 4) (Tableau II).
Les deux peptides 71 et T12 partagent une région identique de sept acides aminés. La région C-terminale de la protéine S comportant les trois peptides est fortement conservée entre les sérotypes I et II des coronavirus félins et également parmi les coronavirus canins et porcins [Wesseling, J.G. et al., 1994]. Il est donc très probable que les peptides, s'ils sont immunogènes chez le chat, soient aussi immunogènes dans les pathologies canines, porcines et humaines.
Pour confirmer l'immuno-sélection positive obtenue et afin de caractériser les épitopes protecteurs, les deux peptides appelés 7I et T12 ont été exprimés par E. coli, sous la forme de protéines de fusion formant des corps d'inclusion, et extraits à partir du lysat de cellules en utilisant l'urée 8 M ; après une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, lesdits peptides ont été transférés sur une membrane de nylon et incubés avec les différentes catégories de sérums immuns, tels que défins ci-dessus : SR, CS et CI.
Comme représenté sur la
Une fois purifié ou partiellement purifié, T12 a été utilisé comme vaccin sous-unitaire dans une épreuve virulente réalisée sur des chats. Ce vaccin présente une efficacité protectrice, qui est significative, à partir de la deuxième semaine après l'épreuve virulente, en termes de morbidité, sévérité des symptômes de PIF et particulièrement en terme de mortalité.
Le peptide T12, exprimé dans le système d'induction IPTG de E. coli, sous la forme d'une protéine recombinante de fusion (MW ∼34 kDa) contenant en C-terminal une étiquette His6, a été extrait à partir du lysat de cellules dans de l'urée 8 M et purifié sur une colonne de résine de Nickel (Qiagen). Le T12 purifié a été alors adsorbé sur hydroxyde d'aluminium (alhydrogel) et formulé dans un tampon phosphate (PBS, pH 7,2) ainsi qu'en présence de saponine (QS21), comme adjuvant.
Une dose vaccinale comporte, pour un volume de 1,0 ml, 100 µg de T12, 10% d'alhydrogel (v/v), et 20 µg de QS21, par chat.
Dans un groupe de cinq chats SPF (HARLAN USA), âgés de 8 à 9 semaines, chaque animal a reçu deux injections par voie sous-cutanée, à un intervalle de trois semaines (W0 et W3). En parallèle, cinq chats témoins (SPF) reçoivent un placebo ne contenant aucune protéine.
Six semaines (W9) après la deuxième vaccination, les deux groupes de chats ont été infectés par voie oro-nasale (moitié par oral et l'autre moitié par nasal) avec 220 TCID50 de la souche FIPV 79-1146. Les animaux ont été suivis toutes les semaines, pendant 8 semaines après l'épreuve, pour la détermination des titres en anticorps (anti-T12 et anti-FIPV) et les signes cliniques (morbidité, aspect des muqueuses, fluide péritonéal, poids, température, hématocrite, leucocytes et mortalité).
Les signes cliniques ont été mesurés selon le schéma décrit dans le Tableau III.
(post-mortem)
** Pertes d'équilibre : état psychomoteur de l'animal ; une perte d'équilibre indique une atteinte cérébrale.
*** Lésions hépatiques : présence de granulomes sur les lobes.
- * Réponse anti-T12 : tous les animaux vaccinés ont développé une réponse élevée en anticorps anti-T12, atteignant le maximum (titre en Elisa > 100 000) à approximativement 3 semaines (W6) après la seconde vaccination et restant relativement stable tout au long de la période d'observation (jusqu'au jour de l'épreuve). En revanche, il n'est pas possible de détecter des anticorps anti-T12 (
Figure 2 ) chez les chats témoins. Par analyse en Western-Blot, les sérums des chats vaccinés ont montré qu'ils reconnaissaient la protéine virale S. - * Réponse anti-virus : les chats vaccinés avec le peptide T12 ont développé des réponses anti-FIPV avec des titres en anticorps (par ELISA) allant de 100 à 200 à W6, augmentant légèrement à W9, tandis qu'aucun des chats du groupe témoin n'a montré de réponses détectables (
Figure 3 ).
- * Réponse anti-virus : Quatre des cinq chats vaccinés ont répondu à l'épreuve par une élévation rapide du titre en anticorps anti-FIPV, atteignant 5 000 à 11 000 à 2 semaines (W11) post-infection. Deux des quatre chats répondants ont continué à développer des titres plus élevés à W12 et à W13 (d'environ 80 000) ; tandis qu'un chat est resté stable avec le titre de 5000 et l'autre a succombé à W12. L'animal n'ayant pas répondu, a montré des titres en anticorps qui diminuaient.
Quatre des cinq chats du groupe témoin ont également répondu à l'épreuve avec des réponses fortes en anticorps une à deux semaines plus tard que les chats vaccinés, les titres atteignant des niveaux de 80 000 à W12 et/ou à W13. Le chat non répondant s'est avéré transitoirement séropositif au point W11 avec un titre en anticorps de environ 100 (
Les animaux ont été surveillés chaque jour : les signes cliniques et des points ont été attribués pour chaque observation, sur l'échelle de 0 pour des valeurs normales à 3 pour des valeurs anormales et selon la sévérité (voir Tableau III). Comme le montre le Tableau IV, quatre des cinq chats vaccinés (ou 80 %) n'ont pas ou faiblement présenté de signes cliniques, tandis qu'un des chats développait les signes cliniques typiques de la PIF.
Contrairement au groupe vacciné, trois des cinq animaux du groupe témoin ont présenté les signes cliniques caractéristiques de la PIF menant jusqu'à la mort ; un animal a montré des symptômes relativement plus faible, tandis que le dernier (animal transitoirement séropositif à la deuxième semaine) n'a montré aucun signe clinique.
Ces données montrent que le vaccin sous-unitaire T12 est capable de conférer une protection aux chats infectés avec un coronavirus virulent (pas d'apparition d'anticorps facilitants).
Par l'évaluation de la mortalité, le vaccin a montré une efficacité de 80% de survie, comparée à 40% dans le groupe témoin. Parmi les survies, certains animaux vaccinés étaient complètement ou presque totalement exempts de symptômes, tandis qu'un des deux chats témoins survivants a développé des symptômes faibles.
De plus, le suivi au cours du temps des signes cliniques suggère que la protection induite par le vaccin commence à apparaître à partir de la deuxième semaine (W11) post-infection (
** Addition des scores observés pour le comportement, l'aspect des muqueuses, la présence de liquide péritonéal, la perte d'équilibre et les lésions hépatiques.
De manière générale, les valeurs des scores sont comprises entre 0 et 3 ; pour certains critères, on note simplement la présence (1) ou l'absence (0) du critère. Dans le tableau IV, les scores totaux sont une addition des scores qui ont été relevés chaque semaine, après l'épreuve. Un total de 7 correspond à la somme : W9=0, W10=1, W11=2, W12=2, W13=2, W14=0, (car le chat est mort).
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