Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers mit einer Vielzahl von MALDI-Matrix-Punkten, ein Flächengebilde erhältlich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie ein langzeitstabiles Flächengebilde.
Für die Analyse von Proben beispielsweise in der Wirkstoffchemie oder in der biologischen Forschung und Produktion hat sich vermehrt die Massenspektrometrie durchgesetzt. Für die Analyse von in den Proben befindlichen Biomolekülen wird vorzugsweise die Massenspektrometrie mit Ionisierung durch Matrix-unterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) eingesetzt.
Bei dem MALDI-Verfahren werden insbesondere Biomoleküle und/oder biologisches Material in Form eines Flüssigkeitstropfens auf einen sogenannten MALDI-Matrix Punkt dosiert, beispielsweise pipettiert, und getrocknet Die sich dabei bildenden Kristalle werden beispielsweise mit einem MALDI-TOF Massenspektrometer im linearen- oder im Reflektor-Betrieb untersucht Details zu diesem Verfahren können
Probenträger mit MALDI-Punkten sind beispielsweise aus der
Die MALDI-Matrix-Punkte werden gemäß dem Stand der Technik erzeugt, indem die Matrix-Substanz als Lösung in Form eines Flüssigkeitstropfens auf einen Probenträger aufgebracht und dort getrocknet wird. Insbesondere bei Serienversuchen, bei denen teilweise mehr als 200 MALDI-Matrix-Punkte auf den Probenträger aufgebracht werden müssen, ist dieses Verfahren trotz Automationstechniken sehr aufwendig. Darüber hinaus sind die MALDI-Matrix-Punkte in ihrer Form nicht gleichmäßig und in sich nicht homogen. Weiterhin ist die Position der Matrix-Punkte auf dem Probenträger relativ ungenau. Um ein Ineinanderlaufen zweier benachbarter Punkte zu verhindern, muß deren Abstand entsprechend groß gewählt werden.
Es stellt sich deshalb die Aufgabe ein Verfahren zur Herstellung eines Flächengebildes mit einer Vielzahl von MALDI-Matrix-Punkten zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemäß mit einem Verfahren zur Herstellung eines Flächengebildes, vorzugsweise eines Probenträgers, mit einer Vielzahl von MALDI-Matrix-Punkten, bei dem die MALDI-Matrix-Punkte durch Niederschlag der MALDI-Matrix-Substanz aus der Gasphase auf den Probenträger aufgetragen werden.
Es war für den Fachmann überaus erstaunlich und nicht zu erwarten, dass es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt, eine beliebige Anzahl von MALDI-Matrix-Punkten gleichzeitig zu erzeugen. Die MALDI-Matrix-Punkte können eine beliebige Form aufweisen. Sie sind sehr gut reproduzierbar herstellbar, sehr homogen und weisen eine Oberflächenstruktur auf, mit der sich sehr gute Massenspektren erzielen lassen.
Ein Flächengebilde im Sinne der Erfindung ist jeder beliebige Formkörper mit einer beliebig gestalteten Oberfläche. Vorzugsweise ist das Flächengebilde jedoch eine Platte mit einer ebenen Oberfläche, ganz besonders bevorzugt ein Probenträger, der jedoch vorzugsweise keine Einbuchtungen aufweist. Am meisten bevorzugt ist das erfindungsgemäße Flächengebilde eine Folie.
Ein MALDI-Matrix-Punkt im Sinne der Erfindung besteht im wesentlichen aus mindestens einer dem Fachmann geläufigen MALDI-Matrix-Substanz. Bevorzugte MALDI-Matrix-Substanzen sind 3-Hydroxypicolinsäure, α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure, 2,5-Dihydroxybenzoesäure, Sinapinsäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon Nitrobenzylalkohol, Nikotinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, 2-Aminobenzoesäure, Picolinsäure, 3-Aminobenzoesäure, 2,3,4-Trihydroxyacetophenon, 6-Aza-2-thiothymidin, Harnstoff, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Malonsäure oder deren Mischung. Ganz besonders bevorzugt ist die MALDI-Matrix-Substanz α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure.
Vorzugsweise wird als MALDI-Matrix-Substanz eine Verbindung gewählt, die auf dem Flächengebilde sublimiert und für das menschliche Auge sichtbar ist.
Erfindungsgemäß werden die MALDI-Matrix-Punkte durch Niederschlag der MALDI-Matrix-Substanz aus der Gasphase erzeugt. Niederschlag aus der Gasphase im Sinne der Erfindung ist jedes Verfahren, bei dem die MALDI-Matrix-Substanz aus der Gasphase auf das Flächengebilde übertragen wird. Beispielhaft seien Kondensation oder Sublimation genannt. Vorzugsweise erfolgt die Auftragung der MALDI-Matrix-Punkte auf das Flächengebilde jedoch durch Sublimation. Sublimation im Sinne der Erfindung beinhaltet, dass die MALDI-Matrix-Substanz als Feststoff in die Gasphase überführt und/oder aus der Gasphase auf dem Flächengebilde feststoffförmig niedergeschlagen wird. Die Sublimation findet vorzugsweise im Vakuum statt. Besonders bevorzugt wird der Feststoff zur Sublimation erwärmt. Vorzugsweise werden bei dem Niederschlag aus der Gasphase, besonders bevorzugt der Sublimation, mehrere MALDI-Matrix-Substanzen besonders bevorzugt parallel oder sequentiell eingesetzt. Die MALDI-Matrix-Substanzen können zur Herstellung unterschiedlicher MALDI-Matrix-Punkte eingesetzt werden. Es ist aber auch denkbar, dass ein MALDI-Matrix-Punkt eine Substruktur, beispielsweise separat voneinander vorliegende Teilpunkte, aufweist, die jeweils aus einer unterschiedlichen MALDI-Matrix-Substanz aufgebaut sind. Eine Substruktur können aber auch beispielsweise konzentrische Kreisringe sein, die jeweils aus einer unterschiedlichen MALDI-Matrix-Substanz bestehen.
Vorzugsweise wird der Probenträger während des Niederschlags aus der Gasphase, besonders bevorzugt der Sublimation, von einem Formkörper, einer sogenannten Maske, bedeckt, die durchgehende Ausnehmungen aufweist. Nur im Bereich dieser Ausnehmungen schlägt sich die MALDI-Matrix-Substanz auf dem Flächengebilde nieder und bildet dort einen MALDI-Matrix-Punkt oder Teilpunkt. Diese Maske kann eine beliebige Anzahl von Ausnehmungen aufweisen, die eine beliebige Form haben können. Beispielsweise können die Ausnehmungen rund, rechteckig, quadratisch, dreieckig oder oval sein, um nur eine kleine Anzahl der möglichen Formen zu nennen. Die Form kann zur Unterscheidung der jeweiligen MALDI-Matrix-Substanzen auf einem Flächengebilde herangezogen werden. Das Flächengebilde kann auch ursprünglich von mehreren Masken bedeckt sein, die dann nacheinander entfernt werden, um beispielsweise auf unterschiedliche Bereiche des erfindungsgemäßen Flächengebildes unterschiedliche MALDI-Matrix-Substanzen aufzutragen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Maske weitere Ausnehmungen auf, mit denen Informationen auf das Flächengebilde übertragen werden können. Im Bereich dieser Ausnehmungen schlägt sich die MALDI-Matrix-Substanz auf dem Flächengebilde nieder, so dass die Information dort sichtbar wird. Beispiele für Informationen im Sinne der Erfindung sind die Beschriftung der Reihen und Spalten eines Rasters, Kürzel für die verwendete MALDI-Matrix-Substanz aber auch Justierpunkte, die eine exakte Justierung des Flächengebildes in dem entsprechenden Analysegerät erlauben.
Vorzugsweise haben die MALDI-Matrix-Punkte eine Fläche von 1µm2-10 mm2. Auf einer derartigen Fläche läßt sich ein Flüssigkeitstropfen absetzen und vorzugsweise so verankern, dass er sich selbst nach unten hängend nicht von dem erfindungsgemäßen Flächengebilde löst.
Weiterhin bevorzugt sind die MALDI-Matrix-Punkte entlang eines exakten Rasters angeordnet, das ein einfaches Ansteuern von Dosier- und/oder Analysierautomaten ermöglicht. Die MALDI-Matrix-Punkte können eine beliebige Form aufweisen. Beispiele für mögliche Formen sind rechteckig, quadratisch, dreieckig oder oval. Die Form der MALDI-Matrix-Punkte kann zu deren Unterscheidung herangezogen werden, weil die Form beispielsweise unter einem Mikroskop im Massenspektrometer bei der Analyse erkennbar ist. Beispielsweise kann eine bestimmte Form einer bestimmten MALDI-Matrix-Substanz zugeordnet werden. Weiterhin bevorzugt weist ein MALDI-Matrix-Punkt eine Substruktur auf. Diese Substruktur kann aus mehreren von einander isolierten Teilpunkten bestehen, die vorzugsweise jeweils aus einer unterschiedlichen MALDI-Matrix-Substanz bestehen. Die Substruktur kann aber auch mehrere konzentrische Kreisringe aufweisen. Insbesondere die Ausführungsform mit mehreren Teilpunkten hat den Vorteil, dass ein einziger Tropfen einer zu analysierenden Substanz, der mit dem MALDI-Matrix-Punkt in Kontakt gebracht wird, gleichzeitig mehrere Teilpunkte benetzt und somit an einem MALDI-Matrix-Punkt Untersuchungen mit mehreren verschiedenen Matrix-Substanzen durchgeführt werden können.
Vorzugsweise stellen die MALDI-Matrix-Punkte oder Teilpunkte Bereiche dar, die besser benetzbar als ihre Umgebung sind und die jeweils von einem schlechter benetzbaren, vorzugsweise ultraphoben Bereich vollständig umschlossen sind. Durch diese Ausführungsform ist es möglich, einen Flüssigkeitstropfen an einem ganz bestimmten Ort abzulegen und dort vergleichsweise fest zu verankern.
Vorzugsweise weist die kristalline Struktur der MALDI-Matrix-Punkte oder Teilpunkte eine Kristallit-größe < 1 µm auf. Diese bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat beispielsweise den Vorteil, dass die MALDI-Matrix-Punkte von der zu testenden Substanz sehr gut und gleichmäßig angelöst werden und/oder dass ein sehr gutes Signal resultiert.
Ultraphob im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der Kontaktwinkel eines Wasser- und/oder Öltropfens, der auf einer ultraphoben Oberfläche liegt, mehr als 150°, vorzugsweise mehr als 160° und am meisten bevorzugt mehr als 170° beträgt und/oder der Abrollwinkel 10° nicht überschreitet. Als Abrollwinkel wird der Neigungswinkel einer grundsätzlich planen aber strukturierten Oberfläche gegen die Horizontale verstanden, bei dem ein stehender Wasser- und/oder Öltropfen mit einem Volumen von 10 µl aufgrund der Schwerkraft bei einer Neigung der Oberfläche bewegt wird. Solche ultraphoben Oberflächen sind zum Beispiel in der
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die ultraphoben Bereiche eine Oberflächentopographie auf, bei der die Ortsfrequenz der einzelnen Fourierkomponenten und deren Amplitude a (f) ausgedrückt durch das Integral S (log(f)) = a(f).f errechnet zwischen den Integrationsgrenzen log (f1/µm-1) = -3 und log (f2/µm-1) = 3 mindestens 0,3 beträgt und die aus einem hydrophoben oder insbesondere oleophoben Material besteht oder mit einem haltbar hydrophobierten und/oder insbesondere haltbar oleophobierten Material beschichtet sind. Eine solche ultraphobe Oberfläche ist in der internationalen
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Flächengebilden, mit einer Vielzahl von MALDI-Matrix-Punkten. Dieses Flächengebilde ist deshalb ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Flächengebilde als Einmalartikel gestaltet. Für diese Ausführungsform ist insbesondere ein mehrschichtiges Flächengebilde mit einer ersten Schicht mit einer ultraphoben Oberfläche und einer Trägerschicht geeignet, wobei die erste Schicht auf der Trägerschicht reversibel aufgebracht ist und die maximale lokale Abweichung des Flächengebildes von der Planheit <100 µm, besonders bevorzugt < 20 µm auf einer Länge von 100 mm beträgt.
Dieses Flächengebilde hat den Vorteil, dass die erste Schicht mit der ultraphoben Oberfläche nach einmaliger oder mehrmaliger Verwendung von der Trägerschicht abgelöst werden kann und durch eine neue erste Schicht ersetzt werden kann, so dass ausgeschlossen ist, dass diese erste Schicht durch vorhergehende Experimente kontaminiert worden ist. Die erste Schicht mit der ultraphoben Oberfläche ist als Einmalartikel besonders günstig herzustellen. Durch die erfindungsgemäß definierte Planheit ist sichergestellt, dass das Flächengebilde in allen gängigen massenspektrometrischen und/oder optischen Analysegeräten einsetzbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Flächengebildes ist die erste Schicht auf die Trägerschicht aufgeklebt.
Weiterhin bevorzugt besteht zwischen der ersten Schicht und der Trägerschicht ein elektrischer Kontakt. Diese Ausführungsform ist insbesondere bei massenspektroskopischen Analysen von Vorteil.
Das erfindungsgemäße Flächengebilde ist mannigfaltig einsetzbar, vorzugsweise eignet es sich jedoch bei massenspektroskopischen und/oder optischen Analysen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispiel 1 und
- Figur 1
- zeigt den Querschnitt eines erfindungsgemäßen mehrschichtigen Flächengebildes.
- Figur 2
- zeigt die Oberfläche eines erfindungsgemäßen Flächengebildes.
- Figur 3
- zeigt eine Maske zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Flächengebildes.
- Figur 4
- zeigt einen MALDI-Matrix-Punkt erhältlich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
- Figur 5
- zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen Flächengebildes bei der Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und MALDI-Untersuchungen.
Ein Probenträger wurde wie folgt hergestellt:
- Ein walzpoliertes AI-Blech (99,9%) mit einer Fläche von 26x76mm2 und einer Dicke von 0,15 mm wurde bei Raumtemperatur mit Chloroform (p.a.) anschließend 20s in wässriger NaOH (5g/l) bei 50°C entfettet.
Danach wurde 20s in H3PO4 (100g/l) vorgebeizt, 30s in destilliertem Wasser gespült und 90s in einer Mischung von HCl/H3BO3 (je 4g/l) bei 35°C und 120mA/cm2 bei 35V Wechselspannung elektrochemisch gebeizt.
Nach 30s Spülung in Wasser und 30s alkalischer Spülung in wässiger NaOH (5g/l) wurde erneut 30s in destilliertem Wasser gespült und anschließend 90s in H2SO4 (200g/l) bei 25°C mit 30mA/cm2 bei 50V Gleichspannung anodisch oxidiert.
Danach wurde 30s in destilliertem Wasser, dann 60s bei 40°C in NaHCO3 (20 g/l), dann wieder 30s in destilliertem Wasser gespült und 1 Stunde bei 80°C im Trockenschrank getrocknet.
Das so behandelte Blech wurde mit einer etwa 50nm dicken Goldschicht durch Kathodenzerstäubung im Hochvakuum beschichtet. Schließlich wurde die Probe 24 Stunden durch Tauchen in eine Lösung des Thiols CF3-(CF2)7-(CH2)2-SH in Benzotrifluorid (p.a., 1g/l) bei Raumtemperatur in einem geschlossenem Gefäß mit einer Monolage beschichtet, anschließend mit Benzotrifluorid (p.a.) gespült und getrocknet.
Die Oberfläche weist für Wasser einen statischen Randwinkel von 178° auf. Bei einer Neigung der Oberfläche um < 2° rollt ein Wassertropfen des Volumens 10µl ab.
Auf den Probenträger wurden Matrix-Punkte wie folgt sublimiert:
- In einer Hochvakumverdampfungsanlage (Edwards E306) werden 0,5 g α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in einen heizbaren Quarztiegel mit einer nach oben gerichteten Öffnung von 10 mm Durchmesser gefüllt. Im Abstand von 150 mm wird ein Probenträger montiert, der mit einer Maske gemäß
Figur 3 bedeckt ist. Nach Abpumpen auf einen Basisdruck < 10-5 mbar wird der Quarztiegel mit Hilfe von außen liegenden Wicklungen aus Wolframdraht beheizt.
Die Temperatur des Feststoffs wird in der Pulverschüttung mit einem Thermoelement auf 180°C geregelt. Die Schichtdicke des abgeschiedenen Films aus α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wird mit Hilfe eines Schwingquarz-Schichtdickenmessgerätes bestimmt, das zuvor mit einer absoluten Schichtdickenbestimmung (z.B. Rasterkraftmikroskop) geeicht wird. Die Sublimation wird bei einer Schichtdicke von 1 µm abgebrochen.
Die erhaltenen MALDI-Matrix-Punkte sind beispielhaft in
- MALDI Massenspektrum der einfach protonierten Peptide (1-7): Humanes Angiotensin I und II, Substanz P-methylester, Neurotensin (Aminosäuren 1-11), Neurotensin, ACTH (Aminosäuren 1-17) und ACTH (Aminosäuren 18 - 39), aufgenommen von einem präpariertem MALDI-Matrix-Punkt mit einem Durchmesser von 800 µm. Die Peptide wurden für die massenspkektrometrische Analyse wie folgt präpariert: 0.5µl einer wäßrigen Lösung, die jeweils 5 fmol der Peptide 1-6, 1 fmol des Peptids 7 sowie ein Volumenprozent Trifluoressigsäure und 1 mM des nichtionischen Detergenz n-Octyl-β-D-glukopyranosid enthielt, wurden auf den MALDI-Matrix-Punkt aufpipettiert. Nach dem das Lösungsmittels vollständig abgedampft war, wurde die so präparierte Probe einmal gewaschen. Hierzu wurde der gesamte Probenträger für 2 Sekunden in eine 0.1 %ige Trifluoressigsäure eingetauscht und unmittelbar danach, für die Abtrennung verbleibender Flüssigkeitsreste, für 10 Sekunden in einen Stickstoffgasstrom (2,5 bar) gehalten. Das Massenspektrum positiver Molekülionen wurde in einem MALDI Flugzeitmassenspektrometer der Firma Bruker Daltonik, Bremen (Scout-MTP Autoflex) im Reflektorbetriebsmodus und mit zeitlich verzögerter Ionenextraktion (Verzögerungszeit: 70 Nanosekunden) und 20 kV Beschleunigungsspannung aufgenommen. Zur Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses wurden 100 Einzelschussspektren aufsummiert.
Das Ergebnis ist in der folgenden Graphik dargestellt.
Im folgenden werden die
Die Beschriftung und die Zentrierkreuze werden wie die MALDI-Matrix-Punkte auf das Flächengebilde sublimiert, indem eine Maske über das Flächengebilde gelegt wird, die entsprechende Ausnehmungen aufweist. Der Fachmann erkennt, dass die Reihen 1 - 4 des Rasters nacheinander hergestellt wurden.
Die sehr vorteilhafte Verwendung der erfindungsgemäßen Probenträger bei der Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und MALDI Untersuchung (LC-MALDI Kopplung) zeigt die
Häufig werden Substanzgemische vor einer MALDI Untersuchung zunächst chromatographisch getrennt. Beispiel sind Gemische von Peptiden, die durch einen enzymatischen (z.B. Trypsin) Peptidabbau erzeugt wurden. Nach der chromatographischen Trennung werden die Fraktionen des Eluates dann auf die MALDI-Matrix-Punkte 6 des Probenträgers 1 aufgebracht.
In dem vorliegenden Beispiel werden dazu MALDI-Matrix-Punkte 6 verwendet, die sehr eng aneinander liegen, jedoch noch von einem ultraphoben Bereich vollständig umschlossen sind. Vorzugsweise betragen die Abstände (gemessen von Mittelpunkt zu Mittelpunkt) der MALDI-Matrix-Punkte das 1,5 fache von deren Durchmesser.
Durch Verwendung von MALDI-Matrix-Punkten, die durch Sublimation über Masken erzeugten wurden, ist deren Ort und deren Größe sehr genau definiert. Auf diese Weise kann erreicht werden, dass die Flüssigkeit aus der Auftrittsöffnung 11 der LC Säule 10 zum Aufbringen auf die MALDI-Matrix-Punkte kontinuierlich auslaufen kann. Ein gesondertes Sammeln der Fraktionen in Gefäßen mit anschließendem Aufpipettieren auf die Matrix-Punkte oder ein diskontinuierliches Erzeugen von Fraktionen durch Verweilen der Austrittsöffnung über einem MALDI-Matrix-Punkt und anschließendes schnelles Weiterbewegen zum nächsten MALDI-Matrix-Punkt entfällt.
Der Probenträger 1 wird in einer konstanten Geschwindigkeit unter der Austrittsöffnung 11 hinweg bewegt. Jeder MALDI-Matrix-Punkt fängt nun ein konstantes Volumen der Flüssigkeit ein, die aus der Austrittsöffnung abgegeben wird. Gestartet wird der Prozess am Punkt A und verläuft mäanderförmig über alle Punkte hinweg zum Punkt E. Die MALDI-Matrix-Punkte enthalten anschließend das gesamte Eluat der Chromatographie auf den MALDI-Matrix-Punkten A bis E in Fraktionen, die dem konstanten Volumen entsprechen, das jeder MALDI-Matrix-Punkt aufnimmt. Durch Änderung der Geschwindigkeit mit der der Träger 1 unter der Auftrittsöffnung 11 verschoben wird, kann dieses Volumen geändert werden.