Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren, die ein zur Hyphenentwicklung von Candida erforderliches Zellwandprotein codieren, Fragmente der Nucleinsäuren, die Nucleinsäuren oder Nucleinsäure-Fragmente enthaltende Vektoren, die Vektoren enthaltende Wirtszellen, die von den Nucleinsäuren codierten Zellwandproteine, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, Verfahren zur Herstellung der Zellwandproteine, Verfahren zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenstadiums von Candida, Verfahren zum Nachweis einer Candida-Infektion, Verfahren zum Identifizieren von Substanzen mit therapeutischer Wirkung gegen durch Candida verursachte Krankheiten, diagnostische und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Nucleinsäuren, Nucleinsäure-Fragmente, Vektoren, Wirtszellen, Proteine und/oder Antikörper gegen das Zellwandprotein enthalten, Kits zur in vitro-Identifizierung der Zellwandproteine sowie die Verwendung der Nucleinsäuren, Vektoren, Proteine oder Antikörper zur Diagnose und Behandlung von Candidaverursachten Krankheiten beziehungsweise zur Herstellung von diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen.

Candida albicans ist der häufigste Erreger von systemischen Mykosen beim Menschen. Normalerweise besiedelt C. albicans als Kommensale die Oberflächen des Gastrointestinal-Traktes und der Schleimhäute von Mensch und Tier. Während einer systemischen Infektion kann C. albicans jedoch eine Vielzahl wichtiger Organe eines Organismus befallen. Bei immunsupprimierten Patienten kann C. albicans häufig opportunistische Infektionen verursachen. Insbesondere bei immunsupprimierten Patienten können Candida-Infektionen einen äußerst schweren Verlauf nehmen und zu lebensbedrohenden Zuständen führen. Die Inzidenz invasiver und schwer zu behandelnder Candida-Mykosen nimmt weltweit deutlich zu. Zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entwicklung von Pilzinfektionen wie Candida-Mykosen gehören Neutropenie, aggressive Tumortherapie, Immunsuppression, AIDS, Antibiotika-Therapien, Diabetes mellitus, eine sehr lange Verweildauer intravenöser Katheder, Graftversus-Host-Krankheit und chirurgische Eingriffe.

Die exakte Diagnose pilzlicher Infektionen, insbesondere von Candida-Infektionen, ist äußerst schwierig, da die klinischen Befunde bei Pilzinfektionen überwiegend uncharakteristisch sind. Zur Diagnostik invasiver Pilzinfektionen werden bisher hauptsächlich Kulturen zur exakten Spezies-Bestimmung angelegt, wobei jedoch auf Kulturen basierende diagnostische Tests im Allgemeinen nicht ausreichend genau und sensitiv sind. Darüber hinaus ist es auch sehr schwer, eine Unterscheidung zwischen einer Kolonisierung und einer Invasion des Pilz-Pathogenes vorzunehmen. Zur Diagnose von Pilzinfektionen werden auch Proben des Patienten mikroskopisch untersucht. Vor allem bei Vorliegen von nur wenigen Hyphenfragmenten ist allerdings eine Spezies-Unterscheidung und daher auch eine genaue Spezies-Bestimmung nicht immer möglich. Zum Nachweis invasiver Pilzinfektionen, insbesondere Candida-Infektionen, werden auch serologische Verfahren eingesetzt, wobei sich jedoch hier herausgestellt hat, dass die derzeit verfügbaren Antikörper-Tests bei immunsupprimierten Patienten teilweise nur abgeschwächt reagieren, was eine Interpretation der Titer-Kinetik erschwert. In den letzten Jahren wurden darüber hinaus Verfahren zum Nachweis von Pilzspezifischer DNA mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt, die jedoch in der klinischen Anwendung eine zu geringe Sensitivität und Spezifität zeigen. Problematisch ist insbesondere, dass die derzeit eingesetzten DNA-Extraktions- und Amplifikationsverfahren kein Routine-Screening von Patienten erlauben. Sohn et al. (Sohn et al., Mol. Microbiol., 47 (2003), 89-102) beschreiben DNA Sequenzen von C. albicans, die Hyphen-Zellwandproteine codieren. Insgesamt zeigt sich, dass derzeit eine zuverlässige Diagnose von Candida-Infektionen sehr schwer ist, da die Diagnose-Verfahren nicht ausreichend sensitiv oder spezifisch sind, wobei invasive Pilz-Infektionen zumeist erst relativ spät erfasst werden können.

Die klinische Behandlung von C. albicans-Infektionen erfolgt derzeit hauptsächlich unter Verwendung von Polyen-Antibiotika, Azol-Derivaten, Alylaminen/Thiocarbamaten, Fluoropyrimidinen sowie E-chinocandinen. Die derzeit verwendeten Antimykotika tragen den medizinischen Erfordernissen jedoch nur teilweise Rechnung. Azole, beispielsweise Ketoconazol, sind hochtoxisch und weisen eine Reihe unerwünschte Nebenwirkungen auf. Auch hat sich gezeigt, dass sich in zunehmendem Maße gegen die eingesetzten Azole und Echinocandine Resistenzen entwickeln (Schuetzer-Muehlbauer et al., Mol. Microbiol., 48 (2003), 223-235). Polyen-Makrolide wie Amphothericin B und Nystatin führen aufgrund ihrer hohen Toxizität ebenfalls zu starken Nebenwirkungen.

Die Entwicklung weiterer verbesserter Diagnostika, die eine zuverlässige Zuordnung einer Erkrankung zu den durch die Gattung Candida hervorgerufenen Infektionen gestatten, und weiterer verbesserter Antimykotika zur Behandlung von Infektionen oder Krankheiten die durch Candida hervorgerufen werden, ist daher dringend erforderlich.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht daher in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die eine exakte und schnelle Diagnose der von Candida, insbesondere C. albicans hervorgerufenen Krankheiten und Infektionen ermöglichen, sowie in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die zur Entwicklung neuartiger hochwirksamer Therapeutika eingesetzt werden können, die insbesondere eine gezielte Therapie von durch Candida hervorgerufenen Infektionen ermöglichen und die nicht die im Stand der Technik bekannten Nachteile aufweisen, beispielsweise keine Nebenwirkungen im behandelten Organismus hervorrufen.

Die Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung des Gegenstands nach Anspruch 1 sowie der Gegenstände der Nebenansprüche und Unteransprüche.

Offenbart ist die Bereitstellung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleodidsequenzen,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer der in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80 % zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) oder b) zeigt, und
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung von Verwendungsmöglichkeiten von Nucleinsäuren, die hyphenspezifische Zellwandproteine von Candida codiert. Die erstmals bereitgestellten hyphenspezifischen Zellwandproteine Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p sind pH- und/oder Temperatur-regulierte Virulenzfaktoren von C. albicans. Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p sind notwendig für eine erfolgreiche Infektion des Wirtes durch Candida. Dies wurde durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung insbesondere am Beispiel von Rbr1 p in einem Maus-Modell für systemische Candidose nachgewiesen. Untersuchungen der Erfinder der Erfindung zeigen, dass Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p in Abhängigkeit vom pH-Wert in der Zelle exprimiert werden. Insbesondere für Rbr1p wurde gezeigt, dass es sich um ein GPI-verankertes Zellwandprotein handelt. Die hyphenspezifischen Zellwandproteine Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p sind als Bestandteile der Zellwand besonders gut für die Entwicklung von Antimykotika geeignet, da Zellwandproteine insbesondere für kleine Wirkstoff-Moleküle frei zugänglich sind, wobei diese keine Zellmembran überwinden müssen. Durch die Identifizierung von Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p als essentielle Faktoren für eine systemische Candida-Infektion werden neue, bislang noch nicht beschriebene Targets bereitgestellt, die sich in besonderem Maße zur Antimykotika-Entwicklung eignen.

Da die Zellwand von Candida für die Adhäsion von Candida-Zellen an Zellen des Wirtsorganismus verantwortlich ist, sind die Bestandteile der Zellwand hyphaler Zellen, also auch Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p, von besonderer Bedeutung für die Ausprägung der Pathogenität von C. albicans. Da die Proteine Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p nur in der Zellwand der virulenten Hyphenform vorkommen, lassen sich diese Zellwandproteine erfindungsgemäß auch als serodiagnostische Marker einsetzen, um beispielsweise eine invasive Candida-Mykose von einer einfachen Candida-Kolonisierung zu unterscheiden, wobei durch den Nachweis des erfindungsgemäßen Rbr1p-, Rbr2p- und/oder Rbr3p-Proteins in einer zu untersuchenden Probe das Vorliegen einer Candida-Infektion angezeigt wird.

Erfindungsgemäß lassen sich die Rbr1p-, nicht erfindungsgemäß auch Rbr2p- und Rbr3p-Proteine in vorteilhafter Weise auch zur Entwicklung diagnostischer und/oder therapeutischer Antikörper einsetzen, mit deren Hilfe eine Spezies-spezifische Diagnose oder Therapie möglich ist. Alle Bestandteile der Zellwand von Candida-Zellen spielen eine essentielle Rolle bei der Auslösung und Modulation der gegen Candida gerichteten Immunreaktionen des Wirtsorganismus. Im Allgemeinen besteht die Candida-Zellwand aus komplexen Glucose-Polymeren, beispielsweise β-1,3-Glucanen und β-1,6-Glucanen, Chitin und Mannoproteinen. Gegen diese Antigene gerichtete Antikörper weisen daher stets auch diese KohlenhydratReste nach. Da die Mannane der einzelnen Candida-Spezies allerdings hohe Ähnlichkeit aufweisen, besteht zwischen den Candida-Spezies Kreuzreaktivität, sodass eine Unterscheidung einzelner Candida-Spezies unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Glucose-Polymere gerichtet sind, häufig nicht möglich ist. Gegen die Zellwandproteine Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichtete Antikörper weisen jedoch nur Protein-spezifische Epitope nach, nicht jedoch unspezifische Mannan-Bestandteile.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Candida" Sprosspilze der Fungi imperfecti. Sprosspilze von Candida sind pleomorphe Organismen, deren Lebenszyklus durch reversible morphogentische Übergänge zwischen Sprossung und pseudohyphalen beziehungsweise hyphalen Wachstumsformen gekennzeichnet sind. Der Übergang von getrennten Hefezellen (Blastosporen) zu filamentösen Formen, das heißt Hyphen und Pseudohyphen, wird als Dimorphismus bezeichnet. Gene beziehungsweise die von diesen Genen codierten Proteine, die während des hyphalen Wachstums exprimiert werden, sind von enormer Bedeutung für die Ausprägung der Virulenzeigenschaften von Candida. Der Übergang zwischen filamentösem Wachstum und Virulenzeigenschaften kommt beispielsweise dadurch zum Ausdruck, dass C. albicans-Formen, die keine Hyphen ausbilden, in tierischem Modellsystem, beispielsweise Mus musculus, avirulent sind (Lo et al., Cell, 90 (1997), 939-949). Zu diesen fakultativ pathogenen Pilzen gehören neben C. albicans auch C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, Trichosporon-Arten oder Blastoschizomyces-Arten.

Unter "Differenzierungsstadien" oder "Wachstumsstadien" von Candida-Zellen werden erfindungsgemäß die im Candida-Lebenszyklus auftretenden morphogenetischen Wachstumsformen verstanden, wobei insbesondere zwischen dem Hefe-Wachstumsstadium und dem Hyphen- und Pseudohyphen-Wachstumsstadium unterschieden wird. Der Übergang vom Hefewachstum zum filamentösen Wachstum, das heißt Bildung von Hyphen oder Pseudohyphen, wird als Dimorphismus bezeichnet. Das nicht-virulente Hefe-Stadium ist durch das Auftreten sogenannter Blastosporen, bei denen es sich um gram-positive kapsellose Sprosszellen von ovaler bis rundlicher Form handelt, und die Vermehrung mittels Sprossung gekennzeichnet. Das virulente Hyphen- und Pseudohyphen-Wachstumsstadium ist durch die Bildung von echtem Myzel und/oder Pseudomyzel gekennzeichnet. Unter erfindungsgemäßer Verwendung der Nucleinsäuremoleküle, die ein während des Hyphenwachstums exprimiertes Zellwandprotein codieren, ist es also möglich, das Hyphenstadium von Candida-Zellen vom Hefestadium zu unterscheiden und daher das Hyphenstadium zu charakterisieren und/oder nachzuweisen, wobei das Hyphenstadium dadurch charakterisiert ist, dass das erfindungsgemäße Zellwandprotein Rbr1p und/oder das Zellwandprotein Rbr2p und/oder das Zellwandprotein Rbr3p vorliegt/vorliegen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleinsäuremoleküle sind also proteincodierende Nucleinsäuren, die ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein, insbesondere erfindungsgemäß das Zellwandprotein Rbr1p, das Zellwandprotein Rbr2p und/oder das Zellwandprotein Rbr3p codieren. Insbesondere handelt es sich um Nucleinsäuremoleküle, die die Sequenz des RBR1-Gens, des RBR2-Gens und/oder des RBR3-Gens von C. albicans aufweisen. Die RBR1-, RBR2- und RBR3-Gene ist sind pH- und/oder Temperatur-regulierte Gene, deren Expression durch den Repressor Nrg1p aktiviert und durch den Transkriptionsfaktor Rim101 p reprimiert wird.

Offenbart sind auch Nucleinsäuremoleküle, die ein hyphenspezifisches Zellwandprotein einer Candida-Spezies codieren, wobei die Nucleinsäuremoleküle zu den Nucleinsäuren, die das Rbr1p-, Rbr2p- oder Rbr3p-Protein von C. albicans codieren, über ihre gesamte Länge hinweg eine sehr große Homologie aufweisen, wobei die Homologie mehr als 75 %, insbesondere mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 85 %, besonders bevorzugt mehr als 90 % und am bevorzugtesten mehr als 95 % oder mehr als 98 % beträgt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter "Homologie" der Grad der Identität verstanden, der zwischen den Nucleotidsequenzen von zwei Nucleinsäuremolekülen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Protein-Molekülen besteht. Homologe Nucleinsäuren können mit der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz hybridisieren. Hybridisieren bedeutet im Rahmen der Erfindung eine Hybridisierung unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen, wie sie in Sambrook et al., "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe (1989), beschrieben sind.

Das Nucleinsäuremolekül kann sowohl ein Wildtyp-Zellwandprotein, beispielsweise Rbr1p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, Rbr2p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder Rbr3p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 6 dargestellten Aminosäuresequenz, als auch ein mutiertes Zellwandprotein oder ein Derivat davon codieren. Nucleinsäuren, die ein gegenüber Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p von C. albicans mutiertes Zellwandprotein beziehungsweise ein Derivat davon codieren, weisen eine Nucleinsäuresequenz auf, die gegenüber der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr.5 dargestellten Nucleinsäuresequenz an mindestens einer, vorzugsweise mehreren Positionen geändert, das heißt mutiert ist. "Mehrere Positionen" bedeutet, dass 2 bis maximal 150 Positionen, insbesondere 2 bis maximal 120 Positionen, vorzugsweise 2 bis maximal 90 Positionen, besonders bevorzugt 2 bis maximal 60 Positionen, und am bevorzugtesten 2 bis maximal 30 Positionen, 2 bis maximal 24 Positionen, 2 bis maximal 18 Positionen, 2 bis maximal 12 Positionen oder 2 bis maximal 6 Positionen in der Nucleinsäuresequenz mutiert sind, wobei die Homologie der geänderte Positionen enthaltenden Nucleinsäuren über deren gesamte Länge hinweg zu der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz mehr als 75 %, insbesondere mehr al 80 %, vorzugsweise mehr als 85 %, besonders bevorzugt mehr als 90 % und am bevorzugtesten mehr als 95 %, 96 %, 97 %. 98 % oder 99 % beträgt.

Die Abweichungen gegenüber der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz, das heißt die Mutationen, können beispielsweise durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Additionen, Nucleotid-Austausche und/oder Rekombination entstanden sein. Bei den Mutationen kann es sich um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen, nahe verwandten Organismen oder anderen klinischen Isolaten der gleichen Candida-Spezies oder um auf natürliche Weise entstandene Mutationen. Es kann sich aber auch um Mutationen handeln, die mit technischen Mitteln künstlich erzeugt wurden, beispielsweise durch UV-Strahlen, Röntgenstrahlen oder chemische Agenzien. Es kann sich aber auch um Sequenzänderungen handeln, die mittels gentechnischer Verfahren erzeugt wurden. Erfindungsgemäß können die Nucleinsäuremoleküle auch solche Mutationen oder Abwandlungen der erfindungsgemäßen Nucleinsäure enthalten, die durch Fusion mit einem anderen Gen oder Bereichen eines solchen Genes aus der gleichen Candida-Spezies einer anderen Candida-Spezies oder einem anderen Organismus erzeugt wurden. Beispielsweise kann es sich um Nucleinsäuremoleküle handeln, die Bereiche des erfindungsgemäß verwendeten RBR1-Gens in Kombination mit Bereichen des RBR2-Gens und/oder Bereichen des RBR3-Gens aufweisen.

Die erfindungsgemäß verwendete Nucleinsäure beziehungsweise das erfindungsgemäß verwendete Nucleinsäuremolekül kann jedoch auch eine Nucleotidsequenz aufweisen, die gegenüber der in SEQ ID Nr. 1, und nicht erfindungsgemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleotidsequenz verkürzt ist. Ein solches verkürztes Nucleinsäuremolekül kann ebenfalls ein vollständiges Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p bzw. Rbr3p oder aber nur ein Fragment davon, beispielsweise eine Protein-Domäne oder ein Epitop davon codieren. Unabhängig davon, ob das erfindungsgemäß verwendete, verkürzte Nucleinsäuremolekül ein vollständiges Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p bzw. Rbr3p oder nur ein Fragment davon codiert oder nicht, so muss sie in jedem Fall in der Lage sein, in Antisense-Orientierung die Protein-Expression der das Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p codierenden Nucleinsäure, beispielsweise einer das Wildtyp-Protein oder einer ein mutiertes Protein codierende Nucleinsäure, in deren natürlichen zellulären Umgebung oder in einem geeigneten Wirtssystem zu inhibieren. "Inhibieren" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung entweder eine vollständige Blockierung oder zumindest eine teilweise Reduzierung der Transkription und/oder Translation der zu inhibierenden Nucleinsäure.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Nucleinsäuremolekül um ein Molekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz einer der vorgenannten Nucleinsäuremoleküle komplementär ist. Eine Nucleinsäure beziehungsweise eine Nucleotidsequenz ist "komplementär" zu einer anderen Nucleinsäure beziehungsweise Nucleotidsequenz, wenn sie über ihre gesamte Länge hinweg mit dieser einen Doppelstrang bilden kann, in dem alle Nucleotide nach den Regeln von Watson und Crick durch Wasserstoff-Brückenbindung gepaart vorliegen. Beispielsweise ist ein mRNA-Molekül komplementär zu einem der DNA-Stränge eines Genes, von dem es codiert wird.

Es ist insbesondere vorgesehen, dass die Nucleinsäuremoleküle in isolierter und gereinigter Form vorliegen. Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, dass das Nucleinsäuremolekül als DNA-, RNA-, PNA-, LNA-Molekül oder als Mischform davon vorliegt. Bei "PNA" ("Peptide Nucleic Acid" oder "Polyamide Nucleic Acid")-Sequenzen handelt es sich um Moleküle, die nicht negativ geladen sind und in gleicher Weise wie DNA wirken (Nielsen et al., Science, 254 (1991), 1497-1500; Nielsen et al., Biochemiestry, 26 (1997), 5072-5077, Weiler et al., Nuc. Acids Res., 25 (1997), 2792-2799). PNA-Sequenzen umfassen ein Polyamid-Grundgerüst aus N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten und besitzen keine Glucose-Einheiten und keine Phosphat-Gruppen. Die unterschiedlichen Basen sind über Methylen-Carbonyl-Bindungen an das Grundgerüst gebunden. "LNA" (Locked Nucleic Acid)-Moleküle sind dadurch gekennzeichnet, dass die Furanose-Ring-Konformation durch einen Methylen-Linker beschränkt ist, der die 2'-O-Position mit der 4'-C-Position verbindet. LNAs werden als einzelne Nucleotide in Nucleinsäuren, beispielsweise DNA- oder RNA, eingebaut. LNA-Moleküle unterliegen ebenfalls wie PNA-Moleküle den Watson-Crick-Basenpaarungs-Regeln und hybridisieren mit komplementären DNA- und/oder RNA-Molekülen. LNA/DNA- oder LNA/RNA-Duplexmoleküle zeigen gegenüber ähnlichen Duplexmolekülen, die ausschließlich aus DNA oder RNA gebildet sind, erhöhte thermische Stabilität.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsäuremoleküle können aus einer natürlichen Quelle isoliert worden sein, vorzugsweise aus Zellen von C. albicans oder einer anderen Candida-Spezies. Die erfindungsgemäß eingesetzten Nucleinsäuremoleküle können aber auch mittels eines bekannten Verfahrens chemisch synthetisiert worden sein.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Verwendung eines Fragments eines Nucleinsäuremoleküles, dass ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein, insbesondere das Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p von C. albicans, codiert. Unter einem "Fragment" eines Nucleinsäuremoleküls wird ein Teilbereich eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls verstanden, das in der natürlichen zellulären Umgebung des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls oder in einem geeigneten Wirtssystem die Protein-Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäure, die ein Zellwandprotein codiert, inhibieren kann. "Inhibieren" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung entweder eine vollständige Blockierung oder zumindest eine teilweise Reduzierung der Transkription und/oder Translation der zu inhibierenden Nucleinsäure. Eine in Antisense-Orientierung vorliegende Nucleinsäure oder ihre mRNA ist zu der mRNA einer zu inhibierenden Nucleinsäure komplementär und verbindet sich mit dieser zu einem doppelsträngigen Nucleinsäuremolekül, das enzymatisch abgebaut wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Fragment mindestens 10 Nucleotide auf. In weiteren Ausführungsformen weist das Fragment mindestens 15, insbesondere mindestens 25, vorzugsweise mindestens 50 und besonders bevorzugt mindestens 100 Nucleotide auf. Das Fragment kann daher auch ein Oligonucleotid sein. Die Homologie des Fragmentes über seine gesamte Länge hinweg zu der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz beträgt mindestens 75 %, insbesondere mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, und am bevorzugtesten mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 %.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung eines Vektors, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül und/oder mindestens ein Nucleinsäure-Fragment unter der funktionellen Kontrolle von mindestens einem Expressions-Regulationselement enthält, dass die Transkription der Nucleinsäure in eine translatierbare RNA und/oder die Translation der RNA in ein Protein gewährleistet. Bei dem Vektor handelt es sich vorzugsweise um ein Plasmid, ein Cosmid, ein Virus, einen Bakteriophagen, einen Shuttle-Vektor oder einen anderen in der Gentechnik üblicherweise eingesetzten Vektor. Geeignete regulatorische Elemente sind beispielsweise Promotoren, Enhancer, Operatoren, Silencer, Ribosomen-Bindungsstellen und/oder Transkriptions-Terminationssignale, beispielsweise einen 3'-Transkriptionsterminator. Die regulatorischen Elemente, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen, beispielsweise dem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz, verbunden sind, können aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Nucleinsäuremoleküle selbst. Selbstverständlich können die funktionell mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen verbundenen Regulationselemente auch aus Candida, insbesondere C. albicans stammen. Erfindungsgemäß ist ebenfalls vorgesehen, dass der Vektor eine Signalsequenz zum Transport des von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codierten, exprimierten Proteins in eine Zellorganelle, ein Zellkompartiment, in den extrazellulären Raum oder aus der Zelle heraus aufweist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Antisense-Orientierung zu dem/den funktionell damit verbundenen regulatorischen Element(en) vorliegen, sodass eine Expression einer Antisense-mRNA ermöglicht wird, die in einem Zielorgan die Expression des endogenen C. albicans-RBR1-Gens, des endogenen C. albicans-RBR2-Gens beziehungsweise des endogenen C. albicans-RBR3-Gens inhibieren oder reduzieren kann. Bei Verwendung eines Fragmentes der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle muss dieses eine Länge aufweisen, die ausreicht, um eine Hybridisierung und eine Translations-Inhibition zu ermöglichen, beispielsweise eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden, insbesondere mindestens 15, mindestens 25, vorzugsweise mindestens 50 und besonders bevorzugt mindestens 100 Nucleotiden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Vektoren können noch weitere Funktionseinheiten besitzen, die beispielsweise eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder zumindest dazu beitragen. Die erfindungsgemäßen Vektoren können selbstverständlich auch Elemente wie Antibiotikaresistenz-Gene, Selektionsmarker oder Nucleinsäure-Bereiche enthalten, die Affinitätsepitope wie HA, Myc, Maltose-binding-Protein, His6 oder fluoreszierende Proteine wie Luciferase oder Gfp codieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Wirtszelle, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und einen oder mehrere der vorstehend genannten Vektoren enthält und in bevorzugter Ausführungsform in der Lage ist, das erfndungsgemäße Zellwandprotein Rbr1p, und nicht zur Erfindung gehörig Rbr2p und/oder Rbr3p zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls auch solche Zellen, die von einer Wirtszelle abstammen, die mit den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und Vektoren transformiert wurde. Offenbart sind die als Wirtszellen prokaryotische oder eukaryotische Zellen wie Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzellen, insbesondere auch menschliche Zellen. Eine Wirtszelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass das eingeführte Nucleinsäuremolekül beziehungsweise das in dem Vektor enthaltene Nucleinsäuremolekül heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist. Das heißt, dass das Nucleinsäuremolekül, das ein Zellwandprotein von Candida codiert, natürlicherweise nicht in dieser Zelle vorkommt oder aber an einem anderen Ort oder in einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom der Wirtszelle lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise vorkommende Nucleinsäure. Das eingeführte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül kann in Bezug auf die transformierte Zelle aber auch homolog sein.

In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine gram-negative prokaryotische Zelle, besonders bevorzugt eine Enterobakterien-Zelle, insbesondere eine Escherichia coli-Zelle. In einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Wirtszelle auch eine eukaryotische Zelle sein, insbesondere ein Pilzzelle, zum Beispiel eine Zelle aus der Gattung Candida, erfindungsgemäß C. albicans, eine Saccharomyces-Zelle oder eine tierische Zelle, insbesondere eine Insekten- oder Säugerzelle. Besonders bevorzugte Beispiele für geeignete C. albicans-Wirtszellen sind Abkömmlinge des Stammes SC5314 (Fonzi und Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728). Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass die erfindungsgemäße Wirtszelle in Form einer Zellkultur vorliegen kann.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem wird auch durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderlichen Zellwandproteins, erfindungsgemäß des Rbr1p-Proteins, nicht erfindungsgemäß des Rbr2p-Proteins und des Rbr3p-Proteins von Candida albicans, gelöst, umfassend die Kultivierung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die eine Expression des Zellwandproteins erlauben, und die Gewinnung des exprimierten Zellwandproteins aus der Zelle oder aus dem Medium. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Kultivierung von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen in Kulturmedium sowie die Kultivierungsbedingungen, die zur Expression von Proteinen führen, bekannt. Der Fachmann kennt ebenfalls zahlreiche Verfahren zur Isolierung von exprimierten Proteinen aus einer Zelle und/oder aus dem Kulturmedium.

Offenbart ist ebenfalls ein Protein, das die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und von der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird. In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um das Rbr1p-Protein von C. albicans, wobei das Protein unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des zur Hyphenentwicklung erforderlichen Zellwandproteines hergestellt werden kann.

Offenbart ist auch ein Protein, das die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und von der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird. In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um das Rbr2p-Protein von C. albicans, wobei das Protein unter Verwendung des Verfahrens zur Herstellung des zur Hyphenentwicklung erforderlichen Zellwandproteines hergestellt werden kann.

Offenbart ist ferner ein Protein, das mindestens die in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist und von der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird. In bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem Protein um das Rbr3p-Protein von C. albicans, wobei das Protein unter Verwendung des Verfahrens zur Herstellung des zur Hyphenentwicklung erforderlichen Zellwandproteines hergestellt werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Antikörper, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Zellwandprotein, insbesondere das erfindungsgemäße Zellwandprotein Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p von C. albicans, erkennen und daran binden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Antikörper" ein Polypeptid verstanden, das im Wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder mehreren Immunglobulin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, das/die ein Antigen spezifisch bindet/binden und erkennt/erkennen. Bekannte Immunglobulin-Gene umfassen sowohl die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene für den konstanten Bereich als auch die zahlreichen Gene für den variablen Immunglobulin-Bereich. Antikörper können beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe gut charakterisierter Fragmente davon, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden, vorliegen. Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Antikörper" umfasst daher sowohl intakte Antikörper-Moleküle als auch Fragmente davon. Bei den Antikörper-Fragmenten handelt es sich insbesondere um Fragmente wie Fab, F(ab')₂ und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Die Fragmente können entweder mittels Modifikation vollständiger, ganzer Antikörper oder mittels De novo-Synthese unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt worden sein. Der Begriff "Antikörper" umfasst auch modifizierte Antikörper, beispielsweise oligomere, reduzierte, oxidierte und/oder markierte Antikörper. Bei dem Antikörper kann es sich sowohl um einen monoclonalen als auch polyclonalen Antikörper handeln. Verfahren zur Herstellung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt.

Ein gegen das Rbr1p- (erfindungsgemäß), Rbr2p- oder Rbr3p- (nicht erfindungsgemäß) Zellwandprotein gerichteter Antikörper erkennt daher spezifisch das Rbr1p-, Rbr2p- oder Rbr'3p-Protein und bindet spezifisch daran. Vorzugsweise binden die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörper-Fragmente keine anderen Antigene, beispielsweise andere an der Zellwand von Candida vorhandene Proteine. In bevorzugter Ausführungsform ist ein gegen das Zellwandprotein Rbr1p- (erfindungsgemäß), Rbr2p- oder Rbr3- (nicht erfindungsgemäß) Protein gerichteter Antikörper in der Lage, spezifisch nur das Zellwandprotein Rbr1p-Protein oder das Rbr2p-Zellwandprotein oder das Rbr3p-Zellwandprotein einer Candida-Spezies zu erkennen und daran zu binden. Das heißt, ein gegen das Rbr1 p-, Rbr2p- oder Rbr3p-Protein von C. albicans gerichteter Antikörper erkennt und bindet ausschließlich das Rbr1 p-, Rbr2p- oder Rbr3p-Protein von C. albicans, nicht jedoch das entsprechende Rbr1pProtein, das entsprechende Rbr2p-Protein beziehungsweise das entsprechender Rbr3p-Protein einer verwandten Candida-Spezies, beispielsweise das Rbr1p-Protein, Rbr2p- oder Rbr3p-Protein von C. glabrata. Umgekehrt erkennt und bindet ein gegen das Rbr1p-, Rbr2p- oder Rbr3p-Protein von C. glabrata gerichtete Antikörper nicht das entsprechende Protein von C. albicans.

Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragmente modifiziert sein, zum Beispiel mit anderen Molekülen oder anderen Teilen davon konjugiert, assoziiert oder kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein, zum Beispiel mit einer Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einem eine messbare Reaktion auslösenden Enzym, wie einer Phosphatase oder Peroxidase, Enzymsubstraten, fluoreszierenden Substanzen, chemilumineszenten Substanzen, cytotoxischen Agenzien, Spacem, Trägerstoffen oder ähnlichem. Die markierten, konjugierten oder nicht-modifizierten Antikörper können in löslicher oder immobilisierter Form, beispielsweise auf Trägermatrices oder Beads wie Nanopartikeln vorliegen.

Offenbart ist selbstverständlich auch einen Antikörper, der einen gegen das Zellwandprotein Rbr1p gerichteten Antikörper und/oder einen gegen das Zellwandprotein Rbr2p gerichteten Antikörper und/oder einen gegen das Zellwandprotein Rbr3p gerichteten Antikörper spezifisch erkennt und daran bindet.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenstadiums von Candida-Zellen oder Zellen pathogener pilzlicher Organismen, die mit Candida verwandt sind, umfassend die Inkubation der Zellen oder Zellfraktionen davon mit einem Mittel zur Identifizierung des Zellwandproteins Rbr1p (erfindungsgemäß), Rbr2p, Rbr3p (nicht efindungsgemäß), eines homologen Proteins davon und/oder eines Fragmentes davon, wobei der Nachweis des Proteins oder eines Fragmentes davon das Vorliegen des virulenten Hyphenstadiums der Zellen anzeigt.

Offenbart sind also auch Protein-Marker, nämlich die Zellwandproteine Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p von Candida, mit deren Hilfe es möglich ist, das Hyphenstadium von Candida-Zellen eindeutig und exakt zu bestimmen. Da Rbr1p, Rbr2p und Rbr3p nur in der Zellwand von hyphal wachsenden Candida-Zellen vorkommen, stellen die drei Proteine ideale Marker dar, mit deren Hilfe das hyphale Differenzierungsstadium von Candida-Zellen, beispielsweise C. albicans-Zellen, eindeutig und schnell nachgewiesen und so zwischen Hefezellen und Hyphenzellen klar unterschieden werden kann. Die Analyse und Bestimmung des hyphalen Entwicklungsstadiums von Candida unter Verwendung der erfindungsgemäßen Rbr1p-, Rbr2p- und Rbr3p-Proteine liefert somit auch wichtige Informationen zur Virulenz des Pilzes.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "immunologisches Mittel" insbesondere ein gegen das Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichtetes Antiserum, ein gegen das Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichteter Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Komplex davon verstanden. Unter einem "Antiserum" wird ein Serum verstand, das Antikörper gegen ein monospezifisches Antigen oder mehrere Antigene beziehungsweise Epitope enthält. Das Antiserum wird aus spezifisch zu diesem Zweck immunisierten Tieren oder von Menschen, die eine bestimmte Erkrankung, insbesondere eine durch Candida-Arten verursachte Erkrankung durchgemacht haben, gewonnen. Aufgrund der Heterogenität der Immunantwort enthält das gegen ein Antigen, beispielsweise das gegen Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichtete Antiserum unterschiedliche Antikörper, sogenannte polyclonale Antikörper, die von verschiedenen Plasma-Zellklonen produziert werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass der Nachweis von Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p oder eines Fragmentes davon durch das immunologische Mittel mittels eines Fluoreszenz-Verfahrens, eines Chemieluminiszenz-Verfahrens, eines immunologischen Verfahrens oder eines radiometrischen Verfahrens erfolgt. Das Verfahren zum Nachweis des Vorliegens des Zellwandproteins Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p kann gegebenenfalls in Kombination mit einem mikroskopischen Verfahren und einem Bildauswertungsverfahren erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenstadiums von Candida-Zellen ist das Zellwandprotein Rbr1p das Zellwandprotein Rbr1p von C. albicans, das von einer Nucleinsäure mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. In einer nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenstadiums von Candida-Zellen ist das Zellwandprotein Rbr2p das Zellwandprotein Rbr2p von C. albicans, das von einer Nucleinsäure mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. In noch einer weiteren nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenstadiums von Candida-Zellen ist das Zellwandprotein Rbr3p das Zellwandprotein Rbr3p von C. albicans, das von einer Nucleinsäure mit der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und die in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

In weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Zellwandprotein Rbr1 (erfindungsgemäß), Rbr2p oder Rbr3p (nicht erfindungsgemäß) das Rbr1-Protein, Rbr2p-Protein oder Rbr3p-Protein beziehungsweise ein homologes Protein dazu von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art oder einer Blastoschizomyces-Art, wobei der Nachweis des Proteins vorzugsweise unter Verwendung eines Antikörpers erfolgt, der spezifisch gegen das Rbr1p-Zellwandprotein, das Rbr2p-Zellwandprotein beziehungsweise das Rbr3p-Zellwandprotein von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondi, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, Trichosporon oder Blastoschizomyces gerichtet ist. Dadurch wird erfindungsgemäß das hyphale Differenzierungsstadium von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondi, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, Trichosporon beziehungsweise Blastoschizomyces charakterisiert und/oder nachgewiesen. Antikörper gegen das Rbr1p-Zellwandprotein, das Rbr2p-Zellwandprotein beziehungsweise das Rbr3p-Zellwandprotein aus einer der genannten Candida-Spezies können beispielsweise hergestellt werden, indem das Rbr1p-Zellwandprotein, das Rbr2p-Zellwandprotein oder das Rbr3p-Zellwandprotein aus Zellen der entsprechenden Candida-Spezies isoliert und dann unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren zur Erzeugung eines monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers eingesetzt wird. Das Rbr1p-Zellwandprotein, das Rbr2p-Zellwandprotein beziehungsweise das Rbr3p-Zellwandprotein einer Candida-Spezies kann auch unter Verwendung einer der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenzen erhalten werden, indem diese zur Isolierung einer homologen Nucleinsäure aus Zellen der entsprechenden Candida-Spezies eingesetzt wird. Nach Isolierung und Sequenzierung der homologen Nucleinsäure kann dann auf der Basis der erhaltenen Nucleinsäuresequenz die Aminosäuresequenz des von der Nucleinsäure codierten Rbr1p-Zellwandproteines, die Aminosäuresequenz des von der Nucleinsäure codierten Rbr2p-Zellwandproteines beziehungsweise die Aminosäuresequenz des von der Nucleinsäure codierten Rbr3p-Zellwandproteines abgeleitet werden. Das entsprechende Protein kann dann beispielsweise in vitro chemisch synthetisiert und zur Herstellung eines spezifisch dagegen gerichteten Antikörpers eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die zu charakterisierenden Candida-Zellen in einer Probe, vorzugsweise einer biologischen Probe vorliegen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "biologischen Probe" insbesondere ein Haut- oder Schleimhautabstrich, eine Organbiopsie, eine Gewebebiopsie, eine Körperflüssigkeit, ein Körpersekret, Stuhl oder eine Spülflüssigkeit verstanden, die durch Spülung von Hohlräumen oder Hohlorganen eines menschlichen oder tierischen Körpers gewonnen wurde. Die Probe kann sowohl einem lebenden oder toten Organismus, Organ oder Gewebe entnommen worden sein. Bei einer "Biopsie" handelt es sich um eine durch Punktion mit einer Hohlnadel, unter Anwendung eines speziellen Instrumentes wie eines Stanzinstrumentes, einer Biopsiesonde oder einer Zange oder operativ mit dem Skalpell gewonnene Gewebeprobe. Bei einer "Körperflüssigkeit" handelt es sich insbesondere um Sputum, Urin, Pleuraerguss, Liquor, Lymphe oder Blut. Erfindungsgemäß bevorzugt kann das Blut sowohl eine ungereinigte als auch eine gereinigte Blutprobe, Blutplasma oder Blutserum sein. "Sekrete" sind Absonderungen von Zellen, insbesondere Drüsen.

Eine "biologische Probe" kann erfindungsgemäß auch eine Kultur, beispielsweise eine Blutkultur, also ein Keimanzüchtung aus einer Blutprobe, oder ein Kulturmedium sein, beispielsweise ein Fermentationsmedium, in dem Candida-Zellen oder menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen kultiviert wurden. Bei einer Probe im Sinne der Erfindung kann es sich auch um eine wässrige Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension handelt, die isolierte und aufgereinigte Candida-Zellen oder Bestandteile davon enthält. Eine biologische Probe kann bereits Aufreinigungsschritten unterworfen worden sein, um Candida-Zellen zu isolieren oder anzureichern, kann aber auch ungereinigt vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei den eingesetzten, zu charakterisierenden Candida-Zellen um Zellen, die aus einer biologischen Probe isoliert und angereichert wurden und als Zellpräparat, vorzugsweise in einem geeigneten Puffersystem vorliegen. Bei den Candida-Zellen handelt es sich vorzugsweise um intakte Zellen.

Erfindungsgemäß ist ebenfalls vorgesehen, dass zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des hyphalen Differenzierungsstadiums von Candida-Zellen auch Zellfraktionen eingesetzt werden, die durch Aufschluss und Fraktionierung von Candida-Zellen erhalten werden, wobei isolierte und vorzugsweise aufgereinigte Zellfraktionen erhalten werden. Diese so erhaltenen Zellfraktionen können dann im erfindungsgemäßen Verfahren zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des Hyphenwachstumsstadiums von Candida-Zellen eingesetzt werden. Verfahren zum Zellaufschluss und zur Fraktionierung von Zellbestandteilen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Vorzugsweise umfassen die zur Charakterisierung der Differenzierungsstadien von Candida-Zellen eingesetzten Zellfraktionen mindestens eine Zellwand-Fraktion der Candida-Zellen.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem wird auch durch ein Verfahren zum Nachweis einer Candida-Infektion in einer aus einem menschlichen oder tierischen Organismus erhaltenen biologischen Probe gelöst, wobei die Gegenwart des Proteins Rbr1p (erfindungsgemäß), Rbr2p (nicht erfindungsgemäß), Rbr3p (nicht erfindungsgemäß), eines homologen Proteins davon und/oder eines Fragmentes davon in der biologischen Probe und/oder in der Zellwand von gegebenenfalls in der biologischen Probe enthaltenen Candida-Zellen oder Zellen von mit Candida verwandten pathogenen Organismen nachgewiesen wird, umfassend

• a) die Inkubation der biologischen Probe mit einem Mittel zur Identifizierung des Proteins Rbr1p, Rbr2p, Rbr3p, eines homologen Proteins davon und/oder eines Fragmentes davon und
• b) den Nachweis der Interaktion des Identifizierungsmittels mit dem Protein oder Fragment davon.

Das Verfahren zum Nachweis einer Candida-Infektion beruht also entweder auf dem direkten Nachweis des in der Probe frei vorliegenden Rbr1p- (erfindungsgemäß), Rbr2p- oder Rbr3p- (nicht erfindungsgemäß) Zellwandproteins von Candida beziehungsweise eines Teils davon oder aber auf dem Nachweis, dass das Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p in der Zellwand von Candida-Zellen, die in der Probe enthalten sind, vorhanden ist. In beiden Fällen weist der Nachweis von Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p auf das Vorkommen virulenter hyphaler Candida-Zellen und damit auf das Vorliegen einer Candida-Infektion hin. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit in vorteilhafter Weise einen schnellen und exakten Nachweis einer Candida-Infektion, insbesondere einer invasiven Candidiasis. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglich also insbesondere eine sehr frühe Diagnose der Mykose.

Der erfindungsgemäße direkte Nachweis des Candida-Zellwandproteins Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p und/oder Rbr3p in einer Probe oder in der Zellwand von in der Probe enthaltenen Candida-Zellen, insbesondere der immunologische Nachweis des Zellwandantigens mittels eines gegen das Zellwandprotein Rbr1p, das Zellwandprotein Rbr2p oder das Zellwandprotein Rbr3p gerichteten Antikörpers, hat gegenüber den derzeit bekannten Diagnose-Verfahren einen erheblich höheren diagnostischen Wert. So ermöglicht der derzeit durchgeführte kulturelle und/oder histologische Nachweis von Candida in den meisten Fällen lediglich den Nachweis einer Candida-Infektion im Spätstadium, während sich frühe Stadien insbesondere bei immunsupprimierten Patienten diesem Nachweis häufig entziehen. Auch die derzeit erfassten Antikörper-Titer gegen Candida-Antigene eignen sich bislang kaum oder überhaupt nicht zur Diagnose einer Candida-Infektion. Die Ursachen dafür sind vielfältig. So ist bekannt, dass gesunde Personen Antikörper gegen Candida-Antigene aufweisen. Andererseits entwickeln manche Patienten, insbesondere immunsupprimierte Patienten, bei einer Candida-Infektion sehr häufig keine adäquate Immunreaktion. Eine weitere Ursache besteht darin, dass häufig Serumproben entnommen werden, bevor sich Antikörper gebildet haben.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "Candida-Infektion" eine "Candida-Mykose" oder Candidose oder Candidiasis verstanden, also eine Infektion, Krankheit oder ein Krankheitszustand, der durch eine Candida-Art verursacht wird. Insbesondere handelt es sich um solche Erkrankungen, die ausschließlich von Candida-Arten verursacht werden. Der Begriff "Candida-Infektion" umfasst alle Erkrankungen, die von Candida-Arten wie C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondi, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art oder einer Blastoschizomyces-Art verursacht werden. Im Kontext mit der Erfindung werden unter dem Begriff "Candida-Infektionen" auch Krankheiten oder Krankheitszustände verstanden, die primär andere Ursachen haben und bei denen die vorstehend genannten Candida-Arten am Gesamtkrankheitsbild nur beteiligt sind beziehungsweise zusätzliche Symptome hinzufügen, zum Beispiel opportunistische Infektionen.

Unter einer invasiven "Candidiatis" werden erfindungsgemäß Candida-Infektionen im Blutkreislauf und in inneren Organen verstanden. Invasive Candidiatis tritt insbesondere dann auf, wenn Zellen einer Candida-Spezies in den Blutkreislauf gelangen, dort zu einer Infektion führen und sich von da aus über den gesamten Körper verteilen. Zu den häufigsten Symptomen invasiver Candidiatis gehören Fieber und Schüttelfrost. Wenn sich die Infektion zu tiefer gelegenen Organen wie Nieren, Leber oder Augen ausbreitet, können sich zusätzliche spezifische Symptome entwickeln.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass zur Identifizierung von Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p als Zelloberflächen-Antigen von Candida-Zellen oder aber als freies, insbesondere in Körperflüssigkeiten zirkulierendes Antigen ein immunologisches Mittel eingesetzt wird, insbesondere ein gegen Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichtetes Antiserum, ein gegen Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichteter Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Komplex davon. Der erfindungsgemäß eingesetzte Antikörper kann sowohl ein monoclonaler als auch ein polyclonaler Antikörper sein, der vorzugsweise eine Markierung, insbesondere eine Farbmarkierung, eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemielumineszenz-Markierung oder ein eine messbare Reaktion auslösendes Enzym aufweist. Die Untersuchung der Interaktion des Identifizierungsmittels, vorzugsweise des Antikörpers, mit dem Rbr1p-Zellwandantigen (erfindungsgemäß), Rbr2p-Zellwandantigen oder Rbr3p-Zellwandantigen (nicht erfindungsgemäß) erfolgt mittels eines immunologischen Verfahrens, eines Fluoreszenz-Verfahrens, eines Chemielumineszenz-Verfahrens oder eines radiometrischen Verfahrens, gegebenenfalls in Kombination mit einem mikroskopischen Verfahren und/oder einem Bildauswertungsverfahren.

In bevorzugter Ausführungsform ist das nachzuweisende Protein das Zellwandprotein Rbr1p von C. albicans, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und das die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. In einer weiteren nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das nachzuweisende Protein das Zellwandprotein Rbr2p von C. albicans, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und das die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. In noch einer weiteren nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das nachzuweisende Protein das Zellwandprotein Rbr3p von Candida albicans, das von einem Nucleinsäuremolekül mit der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleinsäuresequenz codiert wird und das die in SEQ ID Nr. 6 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. Durch den Nachweis von Rbr1p (erfindungsgemäß), Rbr2p und/oder Rbr3p von C. albicans in der Probe beziehungsweise den Nachweis von C. albicans-Rbr1p (erfindungsgemäß), C. albicans-Rbr2p und/oder C. albicans-Rbr3p in der Zellwand von Candida-Zellen, die in der biologischen Probe enthalten sind, können invasive Pilzerkrankungen nachgewiesen werden, die insbesondere durch C. albicans verursacht werden, insbesondere eine durch C. albicans verursachte invasive Candidiadis. Durch den Nachweis des Rbr1p-Proteins, (erfindungsgemäß) Rbr2p-Proteins oder Rbr3p-Proteins von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae einer Trichosporon-Art oder einer Blastoschizomyces-Art können invasive Pilzerkrankungen nachgewiesen werden, die insbesondere von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art beziehungsweise einer Blastoschizomyces-Art verursacht werden, insbesondere eine durch eine der genannten Candida-Spezies verursachte invasive Candidiadis.

Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, dass der Nachweis der Candida-Infektion unter Verwendung einer biologischen Probe erfolgt, die Candida-Zellen enthalten kann, aber nicht enthalten muss. Die biologische Probe kann beispielsweise ein Haut- oder Schleimhautabstrich, eine Organbiopsie, eine Gewebebiopsie, eine Körperflüssigkeit, ein Körpersekret, Stuhl oder eine Spülflüssigkeit sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Nachweis der Candida-Infektion unter Verwendung einer Körperflüssigkeit, die im Vergleich zu anderen Proben wie einer Biopsie den Vorteil aufweisen, dass die Wahrscheinlichkeit sehr hoch ist, dass Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p frei zirkulieren. Bei der Körperflüssigkeit handelt es sich insbesondere um eine Blutprobe, die dem Körper direkt entnommen und ohne weitere Aufreinigung im efindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch unter Verwendung einer Blutkultur durchgeführt werden. Ebenfalls können erfindungsgemäß Blutprodukte wie Blutplasma oder Blutserum eingesetzt werden. Der Nachweis des frei im Blut zirkulierenden Zellwandproteins Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p beziehungsweise den Nachweis, dass im Blut enthaltene Candida-Zellen auf ihrer Zelloberfläche Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p aufweisen, kann eine invasise Candidiadis im Blut nachgewiesen werden. Dass zur Identifizierung von Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p eingesetzte Mittel ist vorzugsweise ein immunologisches Mittel, insbesondere ein gegen Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichtetes Antiserum, ein gegen Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p gerichteter Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Komplex davon. Im Falle der Verwendung eines Antikörpers kann dieser eine Markierung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Chemielumineszenz-Markierung oder einem eine messbare Reaktion auslösenden Enzym, aufweisen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Auffinden und Identifizieren von Substanzen mit therapeutischer Wirkung gegen Krankheiten, die durch Candida-Arten oder pathogene pilzliche Arten, die mit Candida verwandt sind, verursacht werden. Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass eine zu testende Substanz in einem geeigneten Medium mit mindestens einem Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Nucleinsäuremolekül, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

Beispielsweise können die Nucleinsäuremoleküle, die Fragmente dieser Nucleinsäuremoleküle, die Proteine oder die erfindungsgemäßen Antikörper auf entsprechenden Chips immobilisiert werden. Diese Chips können dann anschließend zum Nachweis einer Interaktion zwischen einer zu testenden Substanz und dem auf den Chips immobilisierten Agens in einem geeigneten Medium mit der zu testenden Substanz in Kontakt gebracht werden. Auf diese Weise können beispielsweise die Nucleinsäuremoleküle, Proteine beziehungsweise Antikörper verwendet werden, um Substanzen, beispielsweise Proteine, zu identifizieren, die in vivo an Nucleotidsequenzen, die hyphenspezifisch exprimierte Zellwandproteine wie Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p codieren beziehungsweise die Expression dieser Proteine regulieren oder an die hyphenspezifisch exprimierten Zellwandproteine selbst binden. Solche bindenden Substanzen, insbesondere Proteine, können potentiell als Medikamente gegen Candida-verursachte Krankheiten eingesetzt werden, wenn sie beispielsweise in der Lage sind, durch Bindung an regulatorische Nucleotidsequenzen die Transkription der erfindungsgemäßen hyphenspezifischen Zellwandproteine zu hemmen oder zu unterbinden oder wenn sie durch Bindung an die erfindungsgemäßen hyphenspezifisch exprimierten Zellwandproteine deren Aktivität hemmen oder unterbinden können. Wenn solche Substanzen, die an Nucleinsäuremoleküle oder Proteine binden, die Transkription der erfindungsgemäß offenbarten hyphenspezifischen Zellwandproteine induzieren oder fördern oder die Aktivität der erfindungsgemäß offenbarten hyphenspezifisch exprimierten Zellwandproteine begünstigen, können diese Substanzen potenziell als Medikamente zur Behandlung Candida-verursachter Krankheiten verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine diagnostische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein

Nucleinsäuremolekül, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens
ein Nucleinsäuremolekül, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

Die in der erfindungsgemäßen diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Nucleinsäure kann also eine Protein-codierende Nucleinsäure sein, insbesondere eine Nucleinsäure, die das Zellwandprotein Rbr1p von C. albicans, und nicht erfindungsgemäß das Zellwandprotein Rbr2p von C. albicans oder das Zellwandprotein Rbr3p von C. albicans codiert. Die in der diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Nucleinsäure kann aber auch eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die Rbr1 p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art oder einer Blastoschizomyces-Art codiert. Die Nucleinsäuren, die eines der Proteine aus einer der vorgenannten Candida-Spezies codieren, weisen zu einer C. albicans-Rbr1p, C. albicans-Rbr2p oder C. albicans-Rbr3p codierenden Nucleinsäure über ihre gesamte Länge hinweg eine sehr große Homologie auf, wobei die Homologie mehr als 75 %, insbesondere mehr als 80 %, vorzugsweise mehr als 85 %, besonders bevorzugt mehr als 90 % und am bevorzugtesten mehr als 95 % oder mehr als 98 % beträgt.

Das in der erfindungsgemäßen diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Zellwandprotein Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p kann in der Zusammensetzung beispielsweise als Komplex mit anderen Proteinen vorliegen. Bei diesen Proteinen handelt es sich vorzugsweise um solche, die ebenfalls zur Diagnose und/oder Therapie von Candida-Infektionen eingesetzt werden können.

Das in der erfindungsgemäßen diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Protein kann auch ein Fragment eines Wildtyp-Proteins oder ein Derivat eines Wildtyp-Proteins sein. Unter einem "Derivat" wird ein funktionelles Äquivalent oder ein funktioneller Abkömmling des Wildtyp-Proteins verstanden, das/der unter Beibehaltung der Grundstruktur von Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p durch Substitution von Atomen oder Molekülgruppen beziehungsweise Molekülresten erhalten wird und/oder dessen Aminosäuresequenz sich an mindestens einer Aminosäureposition vom Wildtyp-Protein unterscheidet.

Die Unterschiede zwischen dem Zellwandprotein-Derivat und dem Wildtyp-Zellwandprotein können auf natürlicherweise auftretenden oder künstlich erzeugten Mutationen, beispielsweise mittels auf dem Fachgebiet bekannter molekularbiologischer Techniken, in den die Derivate codierende Nucleinsäuren beruhen. Die Unterschiede können auch mittels chemischer Verfahren, beispielsweise bei der chemischen Synthese der Protein-Derivate, erzeugt worden sein. Bei Derivaten handelt es sich auch um Fusionsproteine, bei denen am N-Terminus und/oder C-Terminus von Rbr1p, Rbr2p oder Rbr3p funktionelle Domänen eines anderen Proteins enthalten sind. Die erfindungsgemäß verwendeten Derivate von Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p weisen zu den entsprechenden Wildtyp-Zellwandproteinen, insbesondere zu C. albicans Rbr1p mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, zu C. albicans Rbr2p mit der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder zu C. albicans Rbr3p mit der in SEQ ID Nr. 6 dargestellten Aminosäuresequenz, eine Homologie von mindestens 75 %, beispielsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 85 %, vorzugsweise mindestens 90 %, bevorzugter mindestens 95 % und am bevorzugtesten mindestens 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % auf.

Erfindungsgemäß können die in der diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Protein-Derivate gegenüber dem Wildtyp-Protein eine veränderte Aktivität, eine veränderte Stabilität, eine veränderte Spezifität, ein verändertes Temperatur-, ein verändertes pH-Wert- und/oder Konzentrationsprofil und/oder ein verändertes Effektorenmuster aufweisen. Das erfindungsgemäß verwendete Zellwandprotein-Derivat kann in anderen Konformationen vorkommen und auch andere Untereinheiten beziehungsweise prä- und/oder posttranslationale Modifikationen aufweisen.

Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass die diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen einen Antikörper enthalten können, der spezifisch das Zellwandprotein Rbr1p (erfindungsgemäß), das Zellwandprotein Rbr2p oder das Zellwandprotein Rbr3p (nicht erfindungsgemäß) von C. albicans oder von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art oder einer Blastoschizomyces-Art erkennt und daran bindet und so dessen Nachweis ermöglicht. Bei dem Antikörper kann es sich sowohl um einen monoclonalen als auch einen polyclonalen Antikörper handeln. Erfindungsgemäß kann in der diagnostischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung auch nur ein Antikörper-Fragment, beispielsweise Fab, F(ab')₂ und Fv enthalten sein.

In einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße diagnostische oder pharmazeutische Zusammensetzung einen Antikörper enthalten, der spezifisch einen Antikörper, der gegen Rbr1p von C. albicans, und nicht erfindungsgemäß gegen Rbr2p von C. albicans oder gegen Rbr3p von C. albicans gerichtet ist, erkennt und daran bindet und so den Nachweis dieses Antikörpers, beispielsweise in einer biologischen Probe wie Blut ermöglicht.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um einen Impfstoff, der mindestens ein pilzliches Zellwandprotein, insbesondere das Zellwandprotein Rbr1p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, und nicht erfindungsgemäß das Zellwandprotein Rbr2p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das Zellwandprotein Rbr3p von C. albicans mit der in SEQ ID Nr. 6 dargestellten Aminosäuresequenz, enthält und der zur aktiven Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Körpers gegen eine Candida-Infektion geeignet ist. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "aktiven Immunisierung" eine parentarale Gabe von nicht vermehrungsfähigen Antigenen verstanden, wobei das Ziel darin besteht, im menschlichen oder tierischen Körper einen Antikörper gegen das Antigen und somit gegen den Mikroorganismus, von dem das Antigen stammt, zu bilden. Bei einer aktiven Immunisierung kann es sich auch um eine lokale Gabe, insbesondere orale, nasale oder kutane Verabreichung oder Inhalation, von nichtvermehrungsfähigen mikrobiellen Antigenen handeln, wobei das Ziel darin besteht, eine lokale Infektabwehr an Schleimhäuten durch Bildung sekretorischer Antikörper und durch Erhöhung der Makrophargenaktivität aufzubauen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um einen Impfstoff, der mindestens einen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus erfindungsgemäß einem Antikörper, der Rbr1p von Candida spezifisch erkennt und daran bindet, nicht erfindungsgemäß einem Antikörper, der Rbr2p von Candida spezifisch erkennt und daran bindet enthält, und nicht erfindungsgemäß einem Antikörper, der Rbr3p von Candida spezifisch erkennt und daran bindet, enthält und der zur passiven Immunisierung eines menschlichen oder tierischen Körpers gegen eine Candida-Infektion geeignet ist. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "passiven Immunisierung" die Einspritzung von Immunglobulin-Präparaten, also spezifischen Antikörpern, oder Serum eines aktiv immunisierten Menschen beziehungsweise Tieres verstanden, wobei das Ziel darin besteht, antiinfektiöse oder antitoxische Antikörper in einen menschlichen oder tierischen Körper zur Vorbeugung oder Behandlung von Infektionskrankheiten zu übertragen.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass der Impfstoff als Lyophilisat oder als wässrige kolloidale Lösung oder Suspension vorliegt. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann zusätzlich mindestens ein Adjuvants enthalten.

Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Kit zur Identifizierung des Zellwandproteins Rbr1 von Candida-Arten oder eines mit Candida verwandten pathogenen Organismus und/oder zum Nachweis der Virulenz von Candida-Zellen oder von Zellen eines Organismus, der mit Candida verwandt ist, umfassend mindestens einen Behälter mit einem Antikörper, der Rbr1 p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p oder ein Fragment davon spezifisch erkennt und daran bindet. In bevorzugter Ausführungsform kann der Kit zur in vitro-Identifizierung von Rbr1p, und nicht erfindungsgemäß Rbr2p oder Rbr3p und/oder zum in vitro-Nachweis der Virulenz von Candida-Zellen eingesetzt werden. Der Kit kann gegebenenfalls einen zweiten Behälter mit dem isolierten und gereinigten Zellwandprotein Rbr1p, Rbr2p und/oder Rbr3p von C. albicans umfassen. Das isolierte und gereinigte Zellwandprotein Rbr1p oder Rbr2p oder Rbr3p dient vor allem als Kontrolle.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung
eines Nucleinsäuremoleküls, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung
eines Nucleinsäuremoleküls, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung
eines Nucleinsäuremoleküls, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

1. a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
2. b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
3. c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
4. d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
5. e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

• a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
• b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
• c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
• d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
• e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung
eines Nucleinsäuremoleküls, das ein zur Hyphenentwicklung eines pathogenen pilzlichen Organismus erforderliches Zellwandprotein codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

• a) einem Nucleinsäuremolekül mit einer SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz,
• b) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert,
• c) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die über ihre gesamte Länge eine Homologie von mindestens 80% zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle a) oder b) zeigt,
• d) einem Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Nucleotidsequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von a) bis c) komplementär ist, und
• e) einem Fragment eines in a) bis d) definierten Nucleinsäuremoleküls, das in einer Wirtszelle in Antisense-Orientierung zu einem Promotor die Expression eines Zellwandproteins eines pathogenen pilzlichen Organismus hemmen kann und mindestens 10 Nucleotide umfasst;

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Nucleinsäuremoleküls mit einer der in SEQ ID Nr. 1, und nicht erfindungsgemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellten Nucleotidsequenz, eines Nucleinsäuremoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit einer der in SEQ ID Nr. 2, und nicht erfindungsgemäß SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, oder eines Fragmentes eines dieser Nucleinsäuremoleküle zur Isolierung einer homologen Nucleinsäure, die das Rbr1p-Protein, und nicht erfindungsgemäß das Rbr2p-Protein oder das Rbr3p-Protein von C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. glabrata, C. dubliniensis, C. lusitaniae, einer Trichosporon-Art, einer Blastoschizomyces-Art oder eines anderen pilzlichen pathogenen Organismus codiert.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis des virulenten Hyphenstadiums von Candida-Zellen.

Die Erfindung wird durch das folgende Sequenzprotokoll, die folgenden Figuren und folgenden Beispiele näher erläutert.

Das Sequenzprotokoll ist Teil der Beschreibung und enthält die in den SEQ ID Nr. 1 bis 6 dargestellten Sequenzen.

SEQ ID Nr. 1 zeigt eine 336 Nucleotide umfassende Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr1p von Candida albicans codiert.

SEQ ID Nr. 2.zeigt die 111 Aminosäurereste umfassende Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr1p von Candida albicans.

SEQ ID Nr. 3 zeigt eine 507 Nucleotide umfassende Nucleinsäuresequenz, die die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr2p von Candida albicans codiert.

SEQ ID Nr. 4 zeigt die 168 Aminosäurereste umfassende Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr2p von Candida albicans.

SEQ ID Nr. 5 zeigt eine 1682 Nucleotide umfassend Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr3p von Candida albicans codiert, wobei ein Teil der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.

SEQ ID Nr. 6 zeigt einen 560 Aminosäurereste umfassenden Teilbereich der Aminosäuresequenz des Zellwandproteins Rbr3p von Candida albicans.

Die Figuren zeigen:

• Figur 1 zeigt, dass der Transkriptionsfaktor Rim101p Zellwandgene von C. albicans aktiviert oder reprimiert. 1a) Aktivierung hyphaler Gene durch RIM101. 1b) Repression von RBR1, RBR2 und RBR3, durch RIM101. RNA für die Northern-Blot-Analyse wurde aus dem Wildtypstamm SC1453, dem Stamm RIM101-1426 und Δrim101-Mutantenstamm, die jeweils 6 Stunden in YPD-Medium mit 100 mM HEPES-Puffer bei 30°C gezüchtet worden waren, gewonnen. Im Falle von SC1453 und des Mutantenstammes Δrim101 (dunkle Balken) wurde ein pH-Wert von 7,4 eingestellt. Bei SC1453 und RIM101-1426 (heller Balken) wurde ein pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die quantitative Bestimmung der mRNA-Konzentrationen erfolgte durch Normalisierung der Hybridisierungssignale gegen das ACT1-Signal von SC5314 bei einem pH-Wert von 7,4.
• Figur 2 zeigt den vom pH-Wert abhängigen Filamentations-Defekt von Δrbr1-Mutanten auf M-199 Weichagar. Die Stämme wurden in SC-ura-Medium 24 Stunden vorkultiviert und durch eine kurze Zentrifugation pelletiert. 5 µl konzentrierte Zellsuspension wurden auf die Agar-Oberfläche aufgetragen. Die Platten wurden 72 h bei 30°C inkubiert.
• Figur 3 zeigt, dass die RBR1-Expression durch NRG1 aktiviert wird. Die Transkript-Mengen von RBR1 in Wildtyp-, Δefg1-, Δnrg1- und Δtup1-Mutantenstämmen wurden mittels Northern-Blotting bestimmt. RNA, die aus Stämmen gewonnen wurde, die in α-MEM-Medium 4h bei einem pH-Wert von 4,5 (Laufspuren 1-4) oder einem pH-Wert von 7,4 (Laufspuren 5-8) bei nicht-induzierenden Temperaturen von 25°C oder bei Hyphen-induzierenden Temperaturen von 37°C kultiviert worden waren. rRNA*: Ethidiumbromid-gefärbte Kontrolle.
• Figur 4 (a) zeigt, dass die Expression von RBR1 und NRG1 von RIM101 und von der Temperatur abhängig ist.Die Stämme SC1453, RIM101-1426 und Δrim101 wurden 6 h in α-MEM-Medium, 100 mM-HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 4,5 und einem pH-Wert von7,4 bei 25°C und 37°C kultiviert, um RNA zur Northern-Blot-Analyse zu isolieren. rRNA*: Ethidiumbromid-gefärbte Kontrolle.
• Figur 5 zeigt die Ergebnisse, die mit unterschiedlichen Candida-Stämmen in einem Maus-Modell für systemische Candidose erhalten wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass Rbr1p für die Virulenz von Candida und für eine erfolgreiche Infektion des Wirtes durch Candida notwendig ist.

Die verwendeten C. albicans-Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die DNA-Microarray-Experimente wurden mit drei unterschiedlichen Stämmen durchgeführt:

1. a) dem Wildtyp-Stamm (SC5314),
2. b) dem homozygoten Deletionsstamm Δrim101 (CAF3- x ura3::imm434/ura3.:imm434 rim101::hisG/rim101::hisG::URA3) (El Barkani et al., Mol. Cell Biol., 20 (2000), 4635-4647) und
3. c) dem Stamm RIM101-1426 (CAF3-16-2 ura3::imm434 /ura3::imm434 RIM101/RIM101-(pBSK+ -RIM101-1426-URA3)_n>2) der das dominante aktive Protein Rim101-1426p überexprimiert (El Barkani et al., 2000).

Die RBR1-Deletions-Mutanten wurden durch schrittweise homologe Rekombination von CA14 unter Verwendung einer URA3-Flipper-Cassette (Morschhauser et al., Mol. Microbiol., 32 (1999), 547-556) konstruiert. Ein inneres und ein äußeres Paar von Sequenzen, die die codierende Sequenz von RBR1 flankieren, wurden mittels PCR amplifiziert. Das äußere Paar der flankierenden Bereiche (FR1 und FR2) wurde zur Deletion des ersten Allels verwendet. Die inneren flankierenden Bereiche (FR3 und FR4) wurden zur Deletion des zweiten RBR1-Allels verwendet. Die folgenden Primerpaare wurden zur Amplifikation der äußeren und inneren flankierenden Bereiche mittels PCR in einer Peltier Thermal Cycler 200-Vorrichtung (MJ Research) mit 30 Zyklen bei 55°C verwendet:

1. 1) FR1.for: 5'-AAGGGCCCCACAAAATAAAAGCAGCAGGAA und
   FR1.rev: 5'-CCGCTCGAGTTCCAACTTTAATCCCGCAC (Produktlänge 457 bp);
2. 2) FR2.for: 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTGCCACCAGTCAAATTCAA und
   FR2.rev: 5'-CGAGCTCCCGAAATGCCACCATAGTTT (Produktlänge 527 bp);
3. 3) FR3.for: 5'-AAGGGCCCGTGCGGGATTAAAGTTGGAA und
   FR3.rev: 5'-CCGCTCGAGTTGTTGTTGTAAGCGAAGCC (Produktlänge 563 bp);
4. 4) FR4.for: 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGAATGAGAATGAGGGGGAC und
   FR4.rev: 5'-CGAGCTCTTGAATTTGACTGGTGGCAA (Produktlänge 565 bp).

Die Primersequenzen enthielten unikale Schnittstellen (in den Sequenzen unterstrichen), um eine direkte Ligierung der flankierenden Bereiche in das Plasmid pSFU1 (Morschhauser et al., 1999) zu ermöglichen. FR1 und FR3 wurden in den Vektor nach Spaltung mit den Restriktasen ApaI und XhoI zu ligieren. FR2 und FR4 wurden nach Spaltung mit NotI und SacI insertiert, wobei die Plasmide pSFUR1-2 für das Konstrukt mit der äußeren Deletion und pSFUR1-4 für das Konstrukt mit der inneren Deletion erhalten wurden. Zur Reversion der homozygoten Δrbr1-Stämme wurden die codierende Sequenz und der Promotorbereich von RBR1 in den integrativen C. albicans-Expressionsvektor pCaExp (Care et al., Mol. Microbiol., 34 (1999), 792-798) cloniert, wobei die Primer:

• 2736f-1_FR1_for: AAGGGCCCCACAAAATAAAAGCAGCAGGAA und
• RBR1_RVT_rev: CCGCTCGAGCCGAAATGCCACCATAGTTT

Der Vektor enthielt das URA3-Gen unter der Kontrolle des nativen Promotors und wurde zur Integration in den RP10-Locus entworfen.

Drei unabhängige Δrbr1-Mutantenstämme wurden mit pCaExp beziehungsweise pCaExp-RBR1 transformiert. Transformanten, die URA3 exprimierten, wurden auf synthetischem vollständigem Medium ohne Uridin (SC-uri) selektiert. Einzelkolonien wurden abgenommen und 6 h in SC-uri-Medium bei 30°C kultiviert und anschließend wurde die Rekombination des RBR1-Locus mittels Southern-Blot-Analyse bestätigt. Zur Bestimmung der mRNA-Konzentration mittels Northern-Blot-Experimenten wurden die Stämme bei 30°C in α-MEM-Medium (pH-Wert 4,5) kultiviert.

Alle verwendeten Medien enthielten Endkonzentrationen von 100 mM HEPES-Puffer und 0,1 mM Uridin. Die gewünschten pH-Werte wurden entweder mit 1 M NaOH (pH 7,4) oder 1 M HCl (pH 4,5) vor Sterilfiltration eingestellt. Für DNA-Microarray-Experimente wurden Zellen aus Kulturen, die über Nacht bei 30°C in YPD-Medium inkubiert worden waren, pelletiert, dekandiert und im restlichen Medium resuspendiert. Vorgewärmte Medien mit einem gleichen pH-Wert wurden mit der Zellsuspension bis zu einer optischen Dichte OD₆₀₀ = 0,05 beimpft. Die Δrim101-Mutante und der Wildtyp-Kontrollstamm wurden bei einem pH-Wert von 4,5 kultiviert. Um einen Vergleich mit der RIM101-1426-Mutante und dem Wildtyp-Stamm zu ermöglichen, wurden beide Stämme auch bei einem pH-Wert von 7,4 kultiviert. Zur Vermeidung unerwünschter Effekte aufgrund signifikanter Veränderungen des pH-Wertes wurde der pH-Wert am Ende jedes Experimentes bestimmt. Die Veränderungen des pH-Wertes betrugen nicht mehr als 0,2 pH-Einheiten. Wenn Northern-Blot-Experimente zur Bestätigung der DNA-Microarray-Daten durchgeführt wurden, wurden die Stämme unter identischen Bedingungen kultiviert.

Northern-Blot-Experimente und phänotypische Untersuchungen wurden in YPD-Medium, α-MEM-Medium (GIBCO), enthaltend 2 % Glucose, oder Gewebekulturmedium M-199 (GIBCO) mit 0,1 mM Uridin und 101 mM HEPES durchgeführt. Die Stämme wurden bei 25°C, 29°C, 30°C oder 37°C bei sauren und neutralen pH-Werten kultiviert. Festmedien enthielten entweder 2 % Agar oder 0,3 % Agar für Weichagar-Platten, wobei eine 4 %ige erhitzte Agarlösung den vorher erwärmten Medien zugegeben wurde.

Der zellwandspezifische DNA-Microarray wurde von Sohn et al. (Mol. Microbiol., 47 (2003), 89-102) beschrieben. Der Array enthält 117 verschiedene Sonden für bekannte Gene und bislang noch nicht charakterisierte offene Leserahmen von C. albicans. 65 dieser Gene sind Homologe von Zellwandprotein-codieren Genen von S. cerevisiae. Der Array erfasst ferner Gene, die Proteine codieren, von denen bereits bekannt ist, dass diese in der Zellwand von C. albicans lokalisiert sind. Zur Kontrolle wurden Sonden für Actin (ACT1 (X16377)) einbezogen.

Die Sonden wurden mittels PCR aus genomischer DNA von C. albicans in einem Volumen von 100 µl auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mittels einer Peltier Thermal Cycler 200-Vorrichtung (MJ Research) amplifiziert. Die PCR wurde in PCR-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 600 mM KCl, 15 mM Mg₂Cl), enthaltend 1 M Betain (Sigma), 0,3 µm Cresolrot (Sigma) durchgeführt. Eine Einheit Taq-Polymerase, 20 ng Template und jeweils 0,25 µm jedes Primers und 0,2 mM jedes dNTPs wurden hinzugegeben und anschließend wurden 30 PCR-Zyklen durchgeführt, wobei die Denaturierung bei 94°C, die Anlagerungsreaktion bei 50°C und die Verlängerungsreaktion bei 72°C über jeweils 1 Minute durchgeführt wurden. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese in 1 %igen Agarose-Gelen analysiert. Bevor die Sonden auf Polylysin-beschichtete Glas-Objektträger aufgetragen wurden, wurde die Flüssigkeit die Nacht über bei 8°C verdampft, sodass eine Endkonzentration von Betain von 1,5 bis 2 M erhalten wurde.

Zur Herstellung der DNA-Microarrays wurden Glasobjektträger (J. Melvin Freed Brand, Sigma) 2 h in 2,5 M NaOH in 60 % EtOH auf einer Schüttelvorrichtung gewaschen. Die Objektträger wurden fünfmal in frischem ddH₂O gespült und durch einstündige Inkubation in 0,01 % Polylysin (Sigma) in 0,1 x PBS mit Polylysin beschichtet. Danach wurden die Objektträger kurz in ddH₂O gewaschen und mittels Zentrifugation getrocknet, wobei anschließend eine 30-minütige Behandlung bei 50°C erfolgte. Die PCR-Sonden wurden auf die beschichteten Objektträger mittels einer GMS417-Microarray-Vorrichtung aufgedruckt (Genetic Microsystems). Zur Nachbehandlung wurden die Arrays 5-10 min über 2 x SSC rehydriert und 2 s auf einem Umkehr-Hitzeblock bei 80°C getrocknet. Die DNA wurde mittels UV-Licht mit 65 mJ in einer Stratalinker-Vorrichtung (Stratagene) vernetzt. Die Objektträger wurden 20 min in Blockierungslösung (170 mM Bernsteinsäureanhydrid, 70 mM Natriumborat, pH 8,0, in 1-Methyl-2-pyrrolidinon) inkubiert und danach 2 min in kochendem ddH₂O gewaschen. Nach einem kurzen Spülen in 95 % EtOH wurden die Objektträger mittels Zentrifugation getrocknet.

Nach einer 6-stündigen Zell-Kultivierung wurde die optische Dichte bestimmt und die Zellen wurden mittels einer kurzen Zentrifugation bei 1700 x g geerntet. Erhaltene Zellpellets wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und der pH-Wert des Überstandes wurde bestimmt. Gesamt-RNA wurde mittels eines Verfahrens unter Verwendung von saurem Phenol isoliert: Ein Volumen saures Phenol (Roth) und ein Volumen TES (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS) wurden den gefrorenen Zellpellets zugegeben und anschließend erfolgte eine 45-minütige Inkubation bei 65°C unter gelegentlicher Vortex-Behandlung. Anschließend wurden eine weitere Phenol-Extraktion über 10 min bei 65°C und schließlich eine Chloroform-Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt. Danach wurde die RNA mit 0,3 M NaAc in 70 % EtOH präzipitiert. Bei RNA, die zur cDNA-Synthese eingesetzt wurde, wurde routinemäßig eine Präzipitation in 2 M LiCl durchgeführt.

Fluoreszenz-markierte cDNA zur Microarray-Hybridisierung wurde durch reverse Transkription von 30 µg RNA mit Superscript II (Invitrogen) erhalten. Danach erfolgte eine Markierung unter Verwendung eines Standard-Markierungsprotokolls, wobei entweder cy3-dUTP oder cy5-dUT5 (Amersham) eingesetzt wurden. Markierte cDNA wurde mit einer Kontroll-cDNA, die mit einer anderen Markierung versehen war, gemischt, mit TE-Puffer, pH-Wert 7,4, gewaschen, aufgereinigt und auf ein Endvolumen von 12 bis 15 µl in 4 x SSC und 0,2 % SDS unter Verwendung von Microcon YM-30-Filtern (Millipore) eingestellt. Eine Hybridisierung auf dem Array wurde unter einem Deckgläschen bei 63°C die Nacht über in einem Wasserbad durchgeführt. Nach Hybridisierung wurden die Deckgläschen und die ungebundene cDNA durch schrittweises Waschen mit 1 x SSC/0,03 % SDC, 0,2 x SSC und 0,05 x SSC entfernt. Die Chips wurden mittels Zentrifugation getrocknet und sofort gescannt.

Die DNA-Microarrays wurden mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung eines GMS 418-Array-Scanners (Genetic Microsystems) gescannt. Zur Photo-Excitation wurden die folgenden Wellenlängen eingesetzt: 532 nm für Cy3-markierte cDNA und 635 nm für Cy5-markierte cDNA. Fluoreszenz-Spot-Signale von 16 bit-TIFF-Bilder in den Cy3- und Cy5-Kanälen wurden überlagert und unter Verwendung der ImaGene-Software Version 3,0 (Bio Discovery, Los Angeles, USA) quantifiziert. Die Spots wurden als Mittelwert aller Pixel-Werte im Spot-Bereich quantifiziert. Der Hintergrund wurde für jeden Spot separat als Mittelwert aller Pixel-Werte im Hintergrundsbereich quantifiziert. Die Hintergrundswerte wurden von den entsprechenden Spot-Werten subtrahiert, wobei Netto-Signal-Werte erhalten wurden. Die Netto-Signal-Werte unter "1" wurden als "1" bewertet. Sonden mit Netto-Signal-Werten unter "1000" für beide Kanäle wurden bei der Berechnung unter den entsprechenden Bedingungen nicht berücksichtigt. Eine unterschiedliche Transkription wurde als Verhältnis der Signalwerte beider Kanäle angegeben. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte von zwei Werten aus mindestens drei verschiedenen Experimenten. Die DNA-Mikroarray-Daten wurden größtenteils mittels Northern-Blot-Analyse unter identischen Bedingungen bestätigt (vergleiche Stämme und Wachstumsbedingungen).

15 µg Gesamt-RNA wurden mittels Elektrophorese auf denaturierenden Gelen (1 % Agarose, 0,02 M MOPS, 8 mM NaAc, 1 mM EDTA und 2,2 M Formaldehyd) getrennt. RNA wurde auf Hybond-N (Amersham)-Nylon-Membranen unter Verwendung von 20 x SSC entsprechend Standard-Protokollen (Sambrook, 1989) aufgetragen und an die feuchten Blots zweimal mit 120 mJ in einer Stratalinker-Vorrichtung (Stratagene) UV-vernetzt. Die Blots wurden entweder 1 h bei 65°C vorhybridisiert oder bei -80°C eingefroren, bevor sie weiterverarbeitet wurden. Die PCR-amplifizierten Sonden wurden aufgereinigt und anschließend unter Verwendung von [α-³²P]dCTP und Zufallsprimern (Stratagene) mittels einer Klenow-Reaktion markiert. Die Hybridisierung mit Einzelsonden erfolgte über einen Zeitraum von mindestens 6 h. Anschließend erfolgten drei Waschschritte in 1 % SSC, 0,1 % SDS. Die Blots wurden unter Verwendung eines Phosphor-Screen (Molecular Dynamics) über einen Zeitraum von 24 bis 72 h entwickelt. Die Screens wurden unter Verwendung einer Phosphor-Imager-Vorrichtung (Molecular Dynamics) gescannt. Einzelbanden wurden unter Verwendung von ImageQuant 5,2 (Molecular Dynamics) quantitativ erfasst. Die Signale wurden entweder nach Normalisierung bezüglich Actin-mRNA-Mengen oder anhand von Ethidiumbromid-gefärbten 18s- und 28s-rRNA-Banden quantifiziert.

Chromosomale DNA von C. albicans wurde isoliert wie beschrieben (Millon et al., J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 1115-1118), mit EcoRI beziehungsweise PstI gespalten und auf 0,8 % Agarose-Gelen getrennt. Das Auftragen auf Nylon-Membranen in 20 x SSC und die Hybridisierung mit einer genspezifischen Sonde, die nach dem Zufallsprinzip mit [α-³²P] dCTP markiert worden war, erfolgte gemäß Standardprotokollen (Sambrook, 1989), Die Membranen wurden unter Verwendung eines Phosphor-Screens (Molecular Dynamics) 12h entwickelt. Anschließend wurden sie gescannt und wie für die Northern-Hybridisierung beschrieben, visualisiert.

Die Zellwand von C. albicans schützt den Pilz vor seiner Umwelt und ist von zentraler Bedeutung für die Wirt-Pathogen-Wechselwirkung. Es ist bekannt, dass der pH-abhängige Transkripitonsfaktor RIM101 zwei Glycosidasen reguliert, die an der Zellwand-Biosynthese von C. albicans beteiligt sind (Muhlschlegel und Fonzi, Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 5960-5967). Zur Identifizierung weiterer von RIM101 regulierter Zellwand-Gene wurde eine Transkriptionsanalyse unter Verwendung eines zellwandspezifischen DNA-Microarrays durchgeführt. Die Chip-Experimente wurden unter Verwendung eines Δrim101-Mutantenstammes und des Stammes RIM101-1426, der das C-terminal verkürzte, dominante aktive Protein Rim101-1426p überexprimiert, durchgeführt. Die Mutantenstämme wurden mit Wildtyp-Zellen in YPD-Medium bei einer Temperatur von 30°C und einem pH-Wert von 7,4 beziehungsweise 4,5 verglichen. Zur Erfassung der durch die pH-Veränderungen hervorgerufenen Gen-Regulationsereignisse wurden alle Stämme unter Bedingungen gezüchtet, die die Ausbildung einer Blastosporen-Morphologie favorisieren. Keiner der Stämme zeigte daher filamentöses Wachstum, wenn die Zellen zur RNA-Isolierung nach sechsstündiger Kultivierung geerntet wurden.

Die erhaltenen Daten zeigen, dass mehrere bislang nicht charakterisierte offene Laserraster durch Rim101p reprimiert werden, wozu RBR1 (orf6.6747), RBR2 (orf6.6744) und RBR3 (orf6.1159) gehören. Zur Bestätigung der Microarray-Daten und zur Quantifizierung der Transkription dieser Gene wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1b gezeigt. RBR1, RBR2 und RBR3 wurden Säure-exprimiert, wobei bei einem neutralen pH-Wert keine signifikante Expression im Wildtyp nachgewiesen wurde. Die RBR-Gene wurden durch dominant aktives RIM101-1426 bei einem sauren pH-Wert reprimiert und unter allen Bedingungen in Δrim101-Mutantenstämmen stark hochreguliert (siehe Figuren 1b und Figur 4). Gemäß einer in silico-Untersuchung weisen alle drei RIM101-reprimierten Gene eine etwa 20 Aminosäure umfassende N-terminale Signalsequenz zum Transport in das endoplasmatische Retikulum und eine C-terminale hydrophobe Transmembran-Domäne auf. Alle RBR-Proteinsequenzen umfassen ebenfalls eine hydrophobe N-terminale Domäne. Die Transmembran-Domänen sind charakteristisch für GPI-verankerte Zellwandproteine. Den Transmembran-Domänen schließt sich eine stromaufwärts gelegene Sequenz mit einer Omega-Stelle an, die die Spaltstelle zur Anlagerung des GPI-Ankers definiert ebenso wie weitere Determinanten, die die Lokalisierung entweder in der Zellwand oder in der Plasmamembran definieren (Caro et al., Yeast, 13 (1997), 1477-1489; De Groot et al., Yeast, 20 (2003), 781-796; Frieman und Cormack, Mol. Microbiol., 50 (2003), 883-896). Die Proteine Rbr1p (111 Aminosäuren) und Rbr2p (168 Aminosäuren) besitzen potentielle Spaltstellen an den Positionen 81 beziehungsweise 143. Das Protein Rbr3p (560 Aminosäuren) zeigt eine potentielle Spaltstelle an Position 540. Darüber hinaus zeigt die Proteinsequenz mit Ausnahme der C- und N-terminalen hydrophoben Sequenzen mehrere Stellen mit einem hohen O-beta-Glycosylierungs-Potential, das typisch für pilzliche Zellwandproteine ist (http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang).

Eine Recherche von pro- und eukaryotischen Genom-Datenbanken am National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) zeigte, dass die erfindungsgemäßen RBR-Gene keine signifikante Homologie zu Genen von S. cerevisiae oder anderen Organismen zeigen. Es zeigte sich, dass Rbr1p etwa 40 % identisch mit Hyr1p von C. albicans, einem GPI-verankerten, nicht-essentiellen Zellwandprotein ist, das sehr häufig in Hyphen vorkommt (Bailey et al., J. Bacteriol., 178 (1996), 5353-5360).

Da RBR1 gegenüber den anderen RIM101-reprimierten Genen die stärkste Expression zeigte, wurde dieses Gen näher charakterisiert. Das offene Laserraster (orf6.6747), das Rbr1p codiert, hat eine Länge von 336 bp und codiert ein GPI-verankertes Protein von nur 111 Aminosäuren. Zur funktionellen Charakterisierung des Zellwandproteins Rbr1p in C. albicans wurden drei unabhängige Δrbr1-Mutantenstämme mittels Transformation und homologer Rekombination von CA14 unter Verwendung der URA3-Flipper-Kassette (Morschhauser et al., 1999) konstruiert. Die Stämme wurden routinemäßig zuerst auf SC-uri-Medium selektiert und in einem zweiten Schritt nach Induktion der FLP-Rekombinase auf ura3^--Kolonien. Homozygote Δrbr1-Mutanten wurden entweder nur mit dem URA3-Gen oder mit URA3 und RBR1 unter der Kontrolle von dessen nativem Promotor revertiert. Heterozygote und homozygote Δrbr1-Mutanten zeigten keine Wachstumsdefekte unter den verwendeten Medienbedingungen. Southern- und Northern-Blot-Analysen bestätigten den Genotyp und die RBR1-Transkription. Da RBR1 hauptsächlich bei einem niedrigen pH-Wert exprimiert wird (vergleiche Figur 1 b) sind unter diesen Bedingungen mögliche Veränderungen im Wachstum und bei der Resistenz gegen Zellwandstress sowie Filamentationsdefekte zu erwarten. Daher wurde das Wachstum und die Filament-Induktion der Δrbr1-Mutanten in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, Calcofluor-white und 0,3 M MaCl auf unterschiedlichen Festmedien bei 25°C, 30°C und 37°C untersucht. Auf Medien mit 2 % Agar wurde kein distinkter Phänotyp beobachtet, wobei jedoch die Δrbr1-Stämme auf Weichagar mit 0,3 % Agar einen Filamentations-Defekt zeigten. Bei einer dreitägigen Inkubation auf M-199-Weichagar mit einem pH-Wert von 4,5 zeigte Δrbr1 kein filamentöses Wachstum (vergleiche Figur 2), während beim Wildtyp und der RBR1-Revertante nach 24 Stunden bei 30°C eine Filamentation induziert wurde. Unter den gleichen Bedingungen und beibei einem pH-Wert von 7,4 induzierte der Δrbr1-Stamm keine Filamente nach 24 Stunden (Daten nicht gezeigt). Dieser Defekt in der Filament-Induktion deutet darauf hin, dass RBR1 insbesondere in der Zellwand von C. albicans in einer sauren Umgebung benötigt wird. Dies stimmt mit dem Expressionsprofil von RBR1 überein (vergleiche Figur 1b). Nach 5 Tagen auf einem sauren M-199-Weichagar bei 30°C begannen die Δrbr1-Mutantenstämme auch Hyphen zu bilden, was möglicherweise auf einen damit nicht im Zusammenhang stehende Nährstoffmangel zurückzuführen ist. Wenn der Test in flüssigen Medien durchgeführt wurde, wurde zwischen dem Wildtyp und der Δrbr1-Mutante kein Unterschied im Wachstum oder der Filamentierungsrate festgestellt (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass für den beobachteten Phänotyp oberflächenvermittelten Effekte verantwortlich sein könnten.

Da Rbr1p am Dimorphismus-Switch beteiligt zu sein scheint, sollte die Frage geklärt werden, ob neben Rim101p auch andere Transkriptionsregulatoren der Morphogenese in C. albicans an der RBR1-Regulation beteiligt sind. Daher wurde die Expression von RBR1 in den Mutantenstämmen Δefg1, Δnrg1 und Δtup1 bei einem pH-Wert von 4,5 bei 25°C und einem pH-Wert von 7,4 bei 37°C in Hyphen-induzierenden Medien untersucht (Figur 3). Dabei stellte sich heraus, dass die Expression von RBR1 in der Mutante Δnrg1 bei einem pH-Wert von 4,5 stark reduziert war, während in den Mutanten Δefg1 und Δtup1 dem Wildtyp entsprechende Transkript-Mengen nachgewiesen wurden. Bei einem neutralen pH-Wert wurde keine signifikante RBR1-Expression festgestellt, weder im Wildtyp noch in einer der getesteten Deletionsmutanten. Diese Daten deuten darauf hin, dass Nrg1p direkt oder indirekt die RBR1-Transkription aktiviert, während Efg1p und Tup1p unter den getesteten Bedingungen nicht an der RBR1-Regulation beteiligt waren.

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