Die vorliegende Erfindung befasst sich mit modifizierten Polynukleotiden, die von natürlich vorkommenden und synthetischen Genen oder anderen kodierenden Sequenzen abgeleitet sind und verglichen mit der ursprünglichen Sequenz eine reduzierte oder erhöhte Anzahl von CpG Dinukleotiden in der kodierenden Region aufweisen. Diese Polynukleotide können eingesetzt werden, um die Genexpression zu erforschen, zu erhöhen oder zu verringern und im speziellen Fall, um die Produktion von Biomolekülen, die Effizienz von DNA-Impfstoffen oder Gentherapiekonstrukten sowie die Qualität von transgenen Tieren oder Pflanzen zu verbessern.

Die Bereitstellung von Biomolekülen in Form von Peptiden, Proteinen oder RNA Molekülen ist eine wichtige Komponente im biotechnologischen und pharmazeutischen Sektor. Rekombinant hergestellte oder in vivo exprimierte Proteine und RNAs werden sowohl für die Erforschung von grundlegenden Mechanismen und Zusammenhängen als auch zur Produktion von biotechnologischen Reagenzien, zur Herstellung von transgenen Tieren oder Pflanzen oder für medizinische Anwendungen in der Therapie- und Impfstoffentwicklung eingesetzt. Je nach Anwendung sollte die Expressionshöhe entsprechender Moleküle regulierbar sein.

In den meisten Fällen werden Steigerungen über die Standard produktion hinaus angestrebt. Jedes Expressionssystem oder Vektorkonstrukt hat Limitationen, welche die tatsächliche Produktionsleistung bestimmen. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Anwendungen, die geeignet sind, die Expressionshöhe von beliebigen Genen in eukaryontischen Zellen zu modulieren. Insbesondere ist das Verfahren geeignet, beliebige Gene so zu modulieren, dass die erzielbare Genexpression über dem Niveau liegt, das mit bislang bekannten Verfahren zur Steigerung der Expression erzielbar ist.

CpG Dinukleotide nehmen im Genom von Eukaryonten eine besondere Stellung ein. Sie sind nicht wie andere Dinukleotide statistisch verteilt, sondern im direkten Vergleich über weite Strecken des Genoms unterrepräsentiert. Zudem sind CpG Dinukleotide in diesen Bereichen meist methyliert.

Eine Ausnahme hierzu bilden Bereiche, die eine sehr viel höhere Dichte an CpG Dinukleotiden aufweisen und die aufgrund dieser Eigenschaften als CpG Inseln bezeichnet werden. Eine charakteristische Eigenschaft dieser CpG Inseln und eine weitere Abgrenzung zu den CpG Dinukleotiden ist die Tatsache, dass die CpG Dinukleotide in den Inseln in der Regel nicht methyliert vorliegen.

Die Unterrepräsentation von CpG Dinukleotiden wird durch eine chemische Modifikation der entsprechenden Nukleotide erklärt. Im Genom von Vertebraten liegen etwa 60-90 % der Cytosine in CpG Dinukleotiden methyliert vor und diese methylierten Cytosine werden häufig durch Deaminierung zu Thyminen modifiziert (Shen et al., 1994). Dieser Prozess führt dazu, dass die Frequenz an Cytosinen und Guanosinen unter der zu erwarteten statistischen Verteilung bei etwa 40 % liegt und der Anteil an CpG Dinukleotiden sogar nur etwa 20 % der zu erwartenden Häufigkeit aufweist (Bird, 1980; Sved et al., 1990; Takai et al., 2002).

CpG Inseln bilden zu dieser ungewöhnlichen Verteilung von CpG Dinukleotiden eine Ausnahme (Antequera et al., 1993). CpG Inseln sind meistens in der Nähe von Promotoren angesiedelt, können in die transkribierte Region hereinreichen oder sogar innerhalb von Exons liegen.

Sie sind gekennzeichnet durch eine etwa zehnfach höhere CpG Häufigkeit (ca. 60-70 % C+G Gehalt) im Vergleich zu durchschnittlichen Genregionen und vor allem dadurch, dass sie in der Regel nicht methylierte CpGs enthalten (Wise et al., 1999). Etwa 60 % aller humanen Gene, vor allem alle Haushaltsgene und ungefähr die Hälfte der gewebsspezifischen Gene, sind mit CpG Inseln assoziiert (Antequera et al., 1993; Larsen et al., 1992). CpG Inseln sind unter anderem in den Publikationen von Gardiner-Garden M. & Frommer M. (1997) J. Mol. Biol. 196, 261-282 und Takai D. & Jones P. A. (2002) PNAS 99, 3740-3745 beschrieben und definiert worden. Da im Stand der Technik unterschiedliche Definitionen existieren, wird für die Zwecke dieser Erfindung eine CpG Insel wie folgt definiert: Eine CpG Insel umfasst eine Sequenz von mindestens 500 aufeinander folgenden Basenpaaren mit einem CpG Gehalt von mindestens 55 % und einem Quotienten von (tatsächliche CpG / erwartete CpG) von mindestens 0,65, und sie ist mit einem Promoter assoziiert (überlappt ganz oder teilweise mit einem Promotor).

Diese ungleiche Verteilung und Modifikation von CpG Dinukleotiden, i) unterrepräsentiert und methyliert auf der einen Seite und ii) verdichtet und unmethyliert in Insel auf der anderen Seite, hat eine wichtige Kontrollfunktion in der Regulation der Genexpression (schematisch in Abbildung I dargestellt).

CpG Dinukleotide sind an der Regulation der Genexpression in frühen Entwicklungsstadien, im Zusammenhang mit der Zelldifferenzierung, dem genetischen Imprinting und anderen Vorgängen beteiligt. In Eukaryonten haben eine Vielzahl von Studien belegt, dass die Methylierung von 5'CpG3' Dinukleotiden (mCpG) einen reprimierenden Effekt auf die Genexpression in Vertebraten und Blütenpflanzen hat (Hsieh, 1994; Kudo, 1998; Jones et al., 1998; Deng et al., 2001; Hisano et al., 2003; Li et al., 2004) (Abb. IA).

Auch in der Tumorforschung gibt es zahlreiche Daten, die belegen, dass i) die Abschaltung der Expression bestimmter Gene, oft Suppressorgene, durch eine Hypermethylierung von CpGs verursacht wird (Li et al., 2004; Kang et al., 2004; Ivanova et al., 2004; Wu et al., 2003) aber auch, dass ii) die unkontrollierte Expression anderer Gene mit einer Hypomethylierung assoziiert ist (Akiyama et al., 2003; Yoshida et al., 2003).

Der Prozess der Genabschaltung durch Methylierung wird durch eine Kaskade von Ereignissen erklärt, die schließlich zu einer Veränderung der Chromatinstruktur führt, die einen transkriptions-schwachen Zustand schafft. Die Methylierung von 5'-CpG-3' Dinukleotiden innerhalb von Genen generiert eine potentielle Bindestelle für Proteinkomplexe (primär aus der Familie der MeCP (methyl-CpG-binding proteins) und MBD (methyl-CpG binding domain protein) Proteine), welche methylierte DNA Sequenzen binden und gleichzeitig mit Histon-Deacetylasen (MBD-HDAC) und transkriptionellen Repressorproteinen assoziieren (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Hendrich et al., 1998). Diese Komplexe ziehen in der Regel eine Umstrukturierung des Chromatins nach sich, die zu einer Abschaltung der Transkriptionsaktivität führen (Wade et al., 1999). Die Methylierung in Promotorregionen kann auch direkt zu einer Abschaltung der Genexpression führen, indem die Bindung von essentiellen Transkriptionsfaktoren durch die eingeführten Methylgruppen verhindert wird (Deng et al., 2001).

Die oben beschriebene Deregulation der Expression in Tumorzellen wird im Allgemeinen mit einer Änderung des Methylierungszustandes in den oben beschriebenen CpG Inseln in Zusammenhang gebracht. In normalen Zellen sind aktiv exprimierte Gene meist mit CpG Inseln assoziiert, die nicht oder gering methyliert sind (Abb. IB). Die Methylierung der CpG Dinukleotide in diesen Inseln führt zu einer Abschaltung der Expression dieser Gene (oft Tumor-Supressorgene oder Zellzyklus-Regulatorgene) (Abb. IC) und in der Folge zu einer unkontrollierten Vermehrung dieser Zellen. Im umgekehrten Fall können Gene, die durch eine Methylierung der CpG Dinukleotide in CpG Inseln inaktiv sind, durch eine Demethylierung aktiviert werden.

Die beschriebene Demethylierung in CpG Inseln führt durch eine Änderung der Chromatinstruktur in einen transkriptions-aktiven Zustand, analog der Genabschaltung im Falle einer Methylierung. Zusätzlich zu strukturellen Änderungen kann eine Aktivierung der Expression durch Aktivatorproteine erfolgen. Ein solches zelluläres Aktivatorprotein ist das humane CpG bindende Protein (hCGBP). HCGBP bindet spezifisch an nicht methylierte CpG Dinukleotide im Bereich von Promotoren, wo es als Transaktivator zu einer Erhöhung der Transkription führt (Voo et al., 2000).

Bisher ist die Erkenntnis, dass eine Methylierung der CpG Sequenzen innerhalb eines Gens die Transkription herabreguliert, dazu verwendet worden, die Expression eines Gens, das entweder überexprimiert wird oder dessen Expression unerwünscht ist, durch Methylierung zu verhindern (Choi et al., 2004; Yao et al., 2003) (vgl. Abb. IA).

Eine weitere Anwendung dieser Erkenntnisse ist die gezielte Eliminierung solcher CpG Dinukleotide zur Verbesserung der Genexpression (Chevalier-Mariette et al., 2003). Durch eine Eliminierung wird ebenfalls eine Methylierung und damit verbunden eine Veränderung der Chromatinstruktur hin zu einem transkriptions-inaktiven Zustand verhindert (Abb. ID). In dieser Veröffentlichung wird die Expression eines Transgens mit verschiedenen CpG Dinukleotid-Gehalten in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, der sich innerhalb einer CpG-Insel befindet, in Keimbahn-Zellen und den daraus entstandenen Embryonen von transgenen Mäusen untersucht. In diesem speziellen Fall wurde durch die Eliminierung von CpG Dinukleotiden eine transkriptionelle Abschaltung eines Reportergens verhindert (Abb. ID Transgen ohne CpG), wie sie anderenfalls durch eine de novo Methylierung von vorhandenen CpG Dinukleotiden während der Embryonalentwicklung zu erwarten ist (Abb. ID, Transgen CpG hoch). Die genauere Untersuchung des Mechanismus in der Veröffentlichung von Chevalier-Mariette zeigte, dass die Verhinderung der Genexpression sowohl mit einer Methylierung der intragenischen CpG Dinukleotide, als auch und vor allem mit einer in der Folge auftretenden Methylierung der Promotor-assoziierten CpG-Insel in Verbindung steht (Abb. ID, Transgen CpG hoch). Für ein Reportergen, das diese intragenischen CpG Dinukleotide nicht aufwies und effizient exprimiert wurde, wurde gezeigt, dass die CpG-Insel nicht methyliert wurde (Abb. ID, Transgen ohne CpG). Die Schlussfolgerung der Autoren war, dass für eine andauernde in vivo Expression der CpG Dinukleotid Gehalt in der unmittelbaren Nähe des Promotors und der CpG-Insel vermindert werden muss.

Eine Erhöhung der Genexpression kann ebenfalls durch die Integration kompletter CpG Inseln 5' eines Promotors in entsprechende Vektorkonstrukte erreicht werden (WO 02081677) (vgl. Abb. IB). Bei der Identifizierung des hCGBP wurden ebenfalls CpG Dinukleotide in die entsprechende Promoterregion eines Reportergens integriert und eine Erhöhung der Reporteraktivität festgestellt. In diesen transienten Zellkulturversuchen wurde allerdings das hCGBP ebenfalls überexprimiert und lag daher in nicht physiologischen erhöhten Konzentrationen vor (Voo, et al., 2000).

Es ist bereits bekannt, dass der C/G-Gehalt einen Einfluss auf die mRNA-Stabilität hat. So zeigen beispielsweise Duan und Antezana (2003), dass die Expression von drei verschiedenen Varianten eines humanen Gens in CHO-Zellen Unterschiede in der mRNA-Konzentration zur Folge hat. In der ersten Variante war die humane Gensequenz so verändert worden, dass die Anzahl von C/G-Dinukleodiden maximiert wurde. In einer zweiten Variante war stattdessen die Anzahl der TIA-Dinukleofide maximiert worden. Die Unterschiede im Steady-State-Level, d.h. in der Menge an mRNA, konnten experimentell auf Unterschiede in dem Abbau der mRNA zurückgeführt werden. Aufgrund einer Stabilisierung der Sekundärstruktur bei erhöhtem C/G-Gehalt wurden entsprechende mRNAs weniger stark abgebaut als Wildtyp, und entsprechend wurden T/A-reiche mRNAs in einem viel höheren Maße abgebaut als Wildtyp. Eine Analyse auf Proteinebene wurde nicht durchgeführt, und es ist auch keine Erhöhung der Proteinproduktion durch Erhöhung der CpG Dinukleotide zu erwarten, da eine Stabilisierung der Sekundärstruktur der mRNA die Translation negativ beeinflusst.

Deml et. al. offenbaren eine für die Expression in Säugerzellen kodonoptimierte Sequenz des HIV-I Gag-Gens. Eine spezifische Erhöhung von CpG Dinukleotiden ist nicht offenbart.

EP 1 156 112 beschreibt Kodon-optimierte Nukleinsäuresequenzen, die für gagpol kodieren.

Graf et al. (2000), J. Virology 74:10822-10826 offenbaren die Kodon-optimierte Sequenz "syngag", welche etwa 68 CpG-Dinukleotide enthält.

Ziel der Erfindung war es, ein Verfahren zur gezielten Modulation der Genexpression zu entwickeln, das die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur gezielten Modulation der Genexpression, umfassend die Schritte:

1. i. Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz,
2. ii. Modifizieren der Zielnukleinsäuresequenz, wobei die Anzahl an in der Zielnukleinsäuresequenz vorhandenen CpG Dinukleotiden unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes zur Erhöhung der Genexpression erhöht wird, wobei die Anzahl der CpG-Dinukleotide im Vergleich mit einer Kodon-optimierten, von der Wildtyp-Sequenz abgeleiteten Sequenz unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes erhöht ist, oder zur Verringerung der Genexpression verringert wird,
3. iii. Klonieren der so modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit modifizierter Anzahl der CpG Dinukleotide in einen geeigneten Expressionsvektor in operativer Verknüpfung mit einer geeigneten Transkriptionskontrollsequenz,
4. iv. Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Säuger-Expressionssystem.

Vollkommen überraschend hat sich herausgestellt, dass bei Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung genau der entgegengesetzte Effekt erreicht werden kann, als man nach Kenntnis des Standes der Technik erwarten sollte. Das heißt, mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durch die Erhöhung der Anzahl von CpG Dinukleotiden in einer Zielnukleinsäuresequenz die Expression dieser Zielnukleinsäuresequenz erhöht werden, während die Verringerung der Anzahl der CpG Dinukleotide in der Zielnukleinsäuresequenz deren Expression verhindert. Die Erhöhung der Anzahl von CpG Dinukleotiden im Leserahmen ist dabei erfindungsgemäß nicht mit der Einführung einer CpG Insel gleichzusetzen. Die Erhöhung der CpG Dinukleotide im Leserahmen unterscheidet sich definitionsgemäß von einer CpG Insel durch i) eine mögliche geringere Basenzahl (<500) und ii) das Fehlen einer Überlappung mit dem Promotorbereich.

Bei dem Expressionssystem kann es sich einerseits um eine Zelle oder andererseits um ein zellfreies System oder in vitro System handeln. Es wird ein Säuger-Expressionssystem verwendet. Vorzugsweise werden humane Zellen, insbesondere somatische Zellen und keine Keimbahn-Zellen verwendet. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Expressionssystem um ein System oder um eine Zelle, die methylierungsarm ist, d.h. dass im wesentlichen keine de novo Methylierung stattfindet. Andererseits ist es auch möglich, dieses Verfahren - für die Herstellung von transgenen nicht-humanen Organismen, insbesondere von Pflanzen und Tieren, zu verwenden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere ein Verfahren zur gezielten Veränderung der Expressionshöhe eines Transkriptes oder/und zur gezielten Veränderung der Protein-Produktion, in SäugerZellen. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch Modifikationen des Leserahmens einer zu transkribierenden DNA-Sequenz.

Die Modifikationen betreffen eine Variation des Anteils an CpG Dinukleotiden, die mit einer Veränderung der Expressionshöhe korrelieren.

Die Technologie der artifiziellen Gensynthese ermöglicht es, jede beliebige, aus diesen Möglichkeiten ausgewählte Nukleotidsequenz zu synthetisieren. Durch die Variation von Motiven innerhalb der kodierenden Region eines Gens, welche mit der Expressionshöhe korrelieren, kann mit dieser Technologie die Proteinproduktion gezielt durch die Wahl der entsprechenden Nukleinsäuresequenz moduliert werden. Als solches Motiv mit direktem Einfluss auf die Expressionshöhe wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung CpG Dinukleotide identifiziert.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur landläufigen Meinung die Einführung von CpG Dinukleotiden auf die erfindungsgemäße Art und Weise statt zu einer Reduktion der Expression zu einer Erhöhung der Genexpression führt. Umgekehrt führt die Eliminierung von CpGs zu einer Reduktion der Genexpression.

Der Ausdruck Genexpression im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl die Transkription als auch die Translation, insbesondere wird unter diesem Begriff die Proteinproduktion verstanden.

Diese Veränderungen auf Nukleinsäureebene werden im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt durch die Herstellung eines artifiziellen Gens durch de novo Gensynthese eingeführt, wobei die Aminosäuresequenz, für die das entsprechende Gen kodiert, vorzugsweise unverändert bleibt. De novo Gensynthesemethoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Die Änderung des CpG-Gehalts erfolgt vorzugsweise durch stumme Mutationen oder durch Mutationen, die die Aktivität des Genprodukts nicht zerstören. Die modifizierten Zielnukleinsäuresequenzen können, wie im Beispiel angegeben, z.B. aus langen Oligonukleotiden mit einer schrittweisen PCR hergestellt werden oder bei gängigen Gensynthese Anbietern (z.B. Geneart GmbH, Qiagen AG) bestellt werden.

Überraschenderweise kann durch die Wahl der Anzahl an CpG Dinukleotiden die Expression des entsprechenden Gens negativ (geringere Anzahl an CpG) oder positiv (erhöhte Anzahl an CpG) beeinflusst werden und sogar die Expressionsraten übersteigen, die mit einem kodonoptimierten Gen erreicht werden können. Die Expression kann unerwarteterweise sogar dann gesteigert werden, wenn die Erhöhung der Anzahl der CpG Dinukleotide auf Kosten der RNA- und Kodonoptimierung erfolgt. Vorzugsweise werden bei der Modifizierung der Zielnukleinsäuresequenz keine CpG-Inseln eingefügt, und vorzugsweise ist die modifizierte Zielnukleinsäuresequenz nicht mit CpG-Inseln assoziiert. In Abgrenzung zu den definierten CpG-Inseln, deren Einfluss auf die Expression nach dem alles-oder-nichts Prinzip funktioniert, ergibt sich bei der vorliegenden Erfindung eine Korrelation zwischen Expressionshöhe und Anzahl der CpG Dinukleotide.

Für die Expression von Genen werden diese Modifikationen vorzugsweise so eingeführt, dass die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändert wird. Im Idealfall soll nur die Nukleinsäuresequenz eines entsprechenden Gens dessen Expressionshöhe beeinflussen. Da der genetische Code degeneriert ist, besteht die Möglichkeit, für eine bestimmte Aminosäuresequenz eine Vielzahl von korrespondierenden Nukleinsäuresequenzen zu wählen.

In Abgrenzung zu den bisher beschrieben Verfahren soll 1) die für das Transkript kodierende Region modifiziert werden, wodurch dieses Verfahren unabhängig von Vektoren und anderen gentechnischen Vorraussetzungen angewendet werden kann und 2) für eine Steigerung der Expression die Anzahl an CpG Dinukleotiden erhöht werden. Die zusätzlich eingeführten CpGs sind dabei nicht methyliert.

Vorzugsweise wird die Anzahl der CpG Dinukleotide im Vergleich mit der Sequenz der zu exprimierenden Zielnukleinsäure um mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, stärker bevorzugt mindestens 5, stärker bevorzugt mindestens 8, stärker bevorzugt mindestens 10, noch stärker bevorzugt mindestens 15, und bis zu 20 oder noch mehr, insbesondere um 30-50 oder auch bis zu 100 oder darüber, je nach Länge des zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, erhöht oder verringert, je nach der gewünschten Expressionshöhe.

Vorzugsweise wird die Anzahl der CpG Dinukleotide im Vergleich mit der Sequenz der zu exprimierenden Zielnukleinsäure um mindestens 10 %, vorzugsweise mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 100 %, vorzugsweise mindestens 200 % bzw. um das Fünffache oder Zehnfache oder mehr erhöht.

Wenn CpGs eliminert werden, ist es bevorzugt, alle CpGs, die im Rahmen des genetischen Codes eliminiert werden können, zu eliminieren. Man kann aber auch weniger CpGs eliminieren; z.B. 10 %, 50 % oder 75 %, wobei hier die Eliminierung wiederum von der gewünschten Expressionshöhe abhängt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass die Erhöhung bzw. Verringerung der Anzahl an CpG Dinukleotiden eine stufenweise Modulation der Genexpression erlaubt. Es wurde überraschenderweise ein Dosiseffekt beobachtet. Das heißt, dass der Grad der Genexpression durch das Hinzufügen oder Eliminieren von mehr oder weniger CpG Dinukleotiden eingestellt werden kann.

Wie bereits erwähnt, ist es möglich und bevorzugt, sich die Degeneration des genetischen Codes so zunutze zu machen, dass vorzugsweise die maximale Anzahl an CpG Dinukleotiden eingefügt oder eliminiert wird, ohne die Aminosäuresequenz der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz zu verändern. Die maximale Anzahl an einzufügenden CpG Dinukleotiden ist vorzugsweise begrenzt durch die Variationsmöglichkeiten der degenerierten Kodons einer vorgegebenen Aminosäuresequenz.

Andererseits kann gegebenfalls die Anzahl der CpG Dinukleotide noch darüber hinaus erhöht werden, auch wenn dadurch die korrespondierende Aminosäuresequenz verändert wird. In diesem Fall ist darauf zu achten, dass die Funktion des Peptids bzw. Proteins nicht beeinträchtigt wird.

Die CpG-Dinukleotide können, je nach Art der Degeneration des genetischen Codes, innerhalb eines Kodons oder auch kodonübergreifend entfernt oder hinzugefügt werden.

Zusätzlich zu der Veränderung der Anzahl an CpG Dinukleotiden in der zu exprimierenden Zielnukleinsäure kann letzere je nach dem gewünschten Grad der Genexpression auf Nukleinsäureebene weiter verändert werden. Wenn z. B. eine Erhöhung der Genexpression angestrebt wird, so wird die Anzahl der CpG Dinukleotide vorzugsweise auf eine solche Weise erhöht, dass durch das Einbringen von weiteren CpG Dinukleotiden keine nachteiligen Wirkungen entstehen wie z. B. stärker ausgeprägte Sekundärstrukturen der mRNA, welche sich nachteilig auf die Translation auswirken könnten, weitere Motive, die die Expression negativ beeinflussen, z. B. RNA-Instabilitätsmotive, splice-aktivierende Motive, Endonukleasen-Erkennungsstellen und dergleichen. Andererseits ist es natürlich auch möglich, wenn die Anzahl der CpG Dinukleotide zur Verringerung der Genexpression verringert wird, die CpG Dinukleotide gerade an solchen Stellen zu eliminieren, die nach Änderung der Nukleotidsequenz zu gerade solchen Motiven führt.

Natürlich ist es auch möglich und auch bevorzugt, zusätzlich zu der Erhöhung oder Verringerung der Anzahl an CpG Dinukleotiden, darüber hinaus noch eine Nukleinsäure-Optimierung dahingehend vorzunehmen, dass entweder die Genexpression gefördert oder gehemmt wird bzw. verringert wird.

Derartige Optimierungen sind demnach das Einfügen oder Entfernen von Motiven, welche die Genexpression beeinflussen können, z.B. Sekundärstruktur-stabilisierende Sequenzabfolgen, Regionen mit erhöhter Selbsthomologie, Regionen mit erhöhter Homologie zum natürlichen Gen, RNA-Instabilitätsmotive, splice-aktivierende Motive, Polyadenylierungs-Motive, adeninreiche Sequenzabschnitte, Endonukleasen-Erkennungsstellen und dergleichen. Noch eine weitere Möglichkeit der Optimierung besteht darin, die Kodonwahl für das gewünschte Expressionssystem jeweils zu optimieren.

Das heißt es kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Expression noch dadurch erhöht oder vermindert werden, dass zusätzlich zum Einfügen von CpG Dinukleotiden die Kodonwahl optimiert oder verschlechtert wird. Erfindungsgemäße expressions-optimierte Konstrukte lassen sich beispielsweise erzeugen, indem man die Kodonverteilung so wählt, wie sie in dem verwendeten Expressionssystem auftritt. Bei dem Säuger-Expressionssytem handelt es sich vorzugsweise um ein humanes System. Vorzugsweise wird daher die Kodonoptimierung an die Kondonwahl humaner Gene angepasst. Bevorzugt soll hierbei eine Kodonwahl verwendet werden, wie sie in Säugerzellen am häufigsten oder am zweithäufigsten verwendet wird (Ausubel et al., 1994), um eine generelle Stabilisierung der RNA und eine optimale Kodonwahl zu gewährleisten. Noch mehr bevorzugt wird die Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der Gene Optimizer Technologie (DE 102 60 805.9 oder PCT/EP03/14850) für eine optimale Expression modifiziert.

Im Gegensatz zur Kodonoptimierung können aber auch "schlechte", von dem Expressionsystem selten benutzte Kodons verwendet werden, um die Anzahl der CpG Dinukleotiden zu erhöhen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch eine heterologe Zielnukleinsäuresequenz verwendet werden. Der Ausdruck "heterologe Zielnukleinsäuresequenz" bezieht sich auf die Herkunft der Zielnukleinsäuresequenz und die Herkunft des Expressionssystems. Vorzugsweise sind somit die Zielnukleinsäuresequenz und das Expressionssystem zueinander heterolog, d.h. dass sie entweder aus unterschiedlichen Spezies stammen und/oder dass die Kodonwahl der Wildtyp-Zielnukleinsäuresequenz eine andere ist als die des Expressionssystems. Der Ausdruck heterolog umfasst im Sinne der Erfindung somit auch Unterschiede im Bezug auf die Kodonwahl. Die Kodonwahl bezeichnet den für eine jeweilige Spezies bevorzugten Kodongebrauch im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes.

Als Expressionsvektor kann jeder geeignete Expressionsvektor verwendet werden. Solch ein Vektor ist vorzugsweise geeignet für die Expression in Säuger-Zellen. Die modifizierte zu exprimierende Zielnukleinsäure wird so in den Vektor hineinkloniert, dass sie sich in operativer Verknüpfung mit einer geeigneten Transkriptionskontrollsequenz und gegebenenfalls weiteren Regulatorelementen befindet. Eine solche Transkriptionskontrollsequenz kann ein geeigneter Promotor sein, der entweder konstitutiv oder induzierbar sein kann.

Konstitutiv aktive Promotoren sind vorzugsweise ausgewählt aus, aber nicht beschränkt auf CMV (Cytomegalovirus) Promotor und Simian Virus 40 (SV40). Induzierbare Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tetracyclin-abhängige Promotoren. Der Fachmann auf dem Gebiet ist ohne Weiteres in der Lage, weitere geeignete Promotoren je nach Anwendung auszuwählen, z.B. auch Promotoren zellulären Ursprungs.

Hierbei ist grundsätzlich jedes induzierbare Promotorsystem geeignet, das im Stand der Technik bekannt ist. Es kann beispielsweise ein natürlicher oder artifizieller induzierbarer Promotor verwendet werden, beispielsweise ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Tet on /Tet off-System). Des Weiteren kann aber auch ein induzierbarer viraler Promotor verwendet werden.

Vorzugsweise ist der induzierbare Promotor durch einen transaktiven Faktor induzierbar. Ein viraler induzierbarer Promotor, der durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, kann von einem beliebigen Virus abgeleitet sein. Vorzugsweise werden hierfür Sequenzen von Retroviren, HCV (Hepatitis-C-Virus), HBV (Hepatitis-B-Virus), HSV (Herpes-Simplex-Virus), EBV (Epstein-Barr-Virus), SV 40 (Simian-Virus 40), AAV (Adenoassoziierte Virus), Adenovirus, Papillomviren oder Ebolavirus verwendet. Die hierbei verwendeten transaktiven Faktoren sind demgemäß z.B. ausgewählt aus den folgenden viralen Faktoren, jedoch nicht beschränkt auf diese: NS5A (HCV), HB X (HBV), VP16/ICP4 (EBV), EBNA1/Rta (EBV), ART (HHV8), Large T-Antigen (SV40), Rep78/68 (AAV), E1A (Adenovirus), E2 (Papillomvirus) und VP30 (Ebolavirus).

Als induzierbarer Promotor, der durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, wird vorzugsweise ein retroviraler LTR-Promotor oder eine funktionelle Teilsequenz davon verwendet. Vorzugsweise ist daher der transaktive Faktor ein retrovirales Tat oder Tax Protein. Der LTR-Promotor kann ausgewählt sein aus den LTRs von HIV-1, HIV-2, SIV, HTLV und anderen verwandten Retroviren, die LTR-Promotoren aufweisen. Insbesondere sind lentivirale Promotoren bevorzugt, insbesondere die von HIV.

Vorzugsweise sind die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Transkriptionskontrollsequenzen, d.h. z.B. Promotoren und/oder Enhancer etc., nicht mit CpG-Inseln assoziiert.

Es ist auch möglich, zusätzlich zur Erhöhung der Anzahl der CpG Dinukleotide in der zu exprimierenden Zielnukleinsäure, die Anzahl der CpG Dinukleotide in den übrigen auf dem Vektor vorhandenen Sequenzen oder Teilen davon zu verringern. Dabei können in diesen übrigen Vektorsequenzen oder Teilen davon die CpG Dinukleotide ganz eliminiert werden. Vorzugsweise geschieht dies wiederum unter Beibehaltung der Aminosäuresequenz unter Ausnutzung der Degeneration des genetischen Codes. Es kann auch nur eine teilweise Eliminierung der CpG Dinukleotide in diesen Sequenzen stattfinden, z.B. um mindestens 5 %, vorzugsweise mindestens 10 %, vorzugsweise mindestens 15 %, vorzugsweise mindestens 25 %, vorzugsweise mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 75 % oder mehr. Vorzugsweise werden alle CpGs entfernt, soweit dies möglich ist.

Somit kann, je nach Anwendung (Silencing oder Expressionssteigerung) die Anzahl an CpG Dinukleotiden unabhängig von der gewählten Kodonoptimierung variiert werden.

In den meisten Fällen ist eine vollständige Eliminierung von CpGs aus dem Leserahmen möglich. Nach oben, d.h. bei der Erhöhung der Anzahl der CpGs, ist die kodierte Aminosäuresequenz limitierend.

Die Zielnukleinsäuresequenz kann für eine RNA, Derivate oder Mimetika davon, ein Peptid oder Polypeptid, ein modifiziertes Peptid oder Polypeptid, ein Protein oder ein modifiziertes Protein kodieren.

Die Zielnukleinsäuresequenz kann auch eine chimäre und/oder zusammengesetzte Sequenz von unterschiedlichen Wildtyp-Sequenzen sein, beispielsweise kann sie für ein Fusionsprotein oder mosaikartig aufgebaute Polygenkonstrukte kodieren. Die Zielnukleinsäuresequenz kann auch für eine synthetische Sequenz kodieren. Es ist hierbei auch möglich, die Nukleinsäuresequenz synthetisch zu entwerfen, beispielsweise mit Hilfe eines Computermodells.

Bei der zu exprimierenden Zielnukleinsäure kann es sich bevorzugt um eine Sequenz für ein Gen für ein beliebiges Protein, z.B. ein rekombinantes Protein, ein artifizielles Polypeptid, ein Fusionsprotein und dergleichen, handeln. Bevorzugt sind diagnostische und/oder therapeutische Peptide, Polypeptide und Proteine. Das Peptid/Protein kann z.B. verwendet werden für i) die Herstellung von therapeutischen Produkten, wie z.B. humane Enzyme (z.B. Asparaginase, Adenosin Deaminase, Insulin, tPA, Gerinnungsfaktoren, Vitamin K-Epoxid-Reduktase), Hormone (z.B. Erythropoietin, Follicle-stimulating hormone, Östrogene) und andere Proteine humanen Ursprungs (z.B. bone morphogenetic proteins, Antithrombin), ii) virale, bakterielle oder von Parasiten abgeleitete Proteine, die als Impfstoffe eingesetzt werden können (abgeleitet von HIV, HBV, HCV, Influenza, Borellien, Haemophilus, Meningococcus, Antrax, Botolinus Toxoid, Diphtherie Toxoid, Tetanus Toxoid, Plasmodium, etc.) oder iii) Proteine, die für die Herstellung von diagnostischen Testsystemen verwendet werden können (z.B. Blutgruppenantigene, HLA Proteine).

Als weitere Möglichkeit kann ein Gen gewählt werden, das Botenstoffe (Cytokine/Chemokine) produziert, z.B. G-CSF, GM-CSF, Interleukine, Interferone, PDGF, TNF, RANTES oder MIP1α oder Domänen, Fragmente oder Varianten davon, die geeignet sind, die natürlichen Abwehrmechanismen benachbarter Zellen zu induzieren oder in Kombination mit geeigneten Antigenen eine spezifische Immunantwort zu verstärken.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Produktion von Proteinen, wie z.B. Enzymen (Polymerasen, Proteasen, etc.) für biotechnologische Anwendungen.

Bei der zu exprimierenden Zielnukleinsäure kann es sich auch um ein Regulatorgen handeln, das nach seiner Expression in einer Zelle als molekulares Schaltermolekül die Expression anderer Gen an- oder abschaltet. Als solches Regulatorgen kann beispielsweise eine Komponente eines Signaltransduktionswegs oder ein Transkriptionsfaktor verwendet werden. Der Begriff "Exprimieren umfasst in diesem Zusammenhang die Transkription der Zielnukleinsäuren und gegebenenfalls die Translation der durch Transkription erhaltenen RNA.

Schließlich kann es sich bei der zu exprimierenden Zielnukleinsäure um eine funktionelle RNA (z.B. Ribozym, Decoy oder siRNA) handeln, die vorzugsweise für therapeutische oder enzymatische Zwecke eingesetzt werden kann.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine modifizierte Nukleinsäure mit einer transkriptionsfähigen Region, die von einer Wildtyp-Sequenz abgeleitet ist, wobei die transkriptionsfähige Region so modifiziert ist, dass die Anzahl an CpG Dinukleotiden im Vergleich mit der Wildtyp-Sequenz unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes erhöht ist. Die modifizierte Nukleinsäure kann in einem Expressionssystem wie oben beschrieben exprimiert werden, und die transkriptiosnfähige Region ist so modifiziert, dass sie in Bezug auf das verwendete Säuger-Expressionssystem kodonoptimiert ist und dass die Anzahl der CpG-Dinukleotide im Vergleich mit der kondonoptimierten, von der Wildtyp-Sequenz abgeleiteten Sequenz unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes erhöht ist.

Eine Wildtyp-Sequenz im Sinne dieser Erfindung ist eine Nukleinsäuresequenz, die natürlich vorkommt.

Wie oben bereits erwähnt, ist es jedoch auch möglich, dass die Zielnukleinsäuresequenz für eine zusammengesetzte Gensequenz kodiert, welche aus unterschiedlichen Wildtyp-Sequenzen zusammengesetzt sein kann. In einem solchen Fall bezieht sich Wildtyp-Sequenz auf die Sequenz, welche noch nicht im Sinne der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde (Erhöhung oder Verringerung der Anzahl der CpG-Dinukleotide).

Die Anzahl der CpG Dinukleotide in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann, wie oben erwähnt, um mehrere CpG Dinukleotide erhöht sein. Vorzugsweise ist die Anzahl auf die maximale Anzahl erhöht, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes möglich ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der eine oben erwähnte erfindungsgemäße modifzierte Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit geeigneten Transkriptionskontrollsequenzen umfasst. Der Vektor wird vorzugsweise für eine Erhöhung der Expression in Säuger-Zellen einer beliebigen DNA Sequenz eingesetzt. Der Vektor ist vorzugsweise von bekannten Vektoren abgeleitet. In den Sequenzbereichen des Vektors, die von der erfindungsgemäßen modifizierten Nukleinsäuresequenz verschieden sind, ist vorzugsweise die Anzahl der CpG Dinukleotide verringert. Vorzugsweise ist die Anzahl an CpG Dunkleotiden in diesen übrigen Vektorsequenzen oder Teilen davon um mindestens 5 %, vorzugsweise mindestens 10 %, vorzugsweise mindestens 15 %, vorzugsweise mindestens 25 %, vorzugsweise mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 75 % oder mehr verringert.

Die Reduktion von CpGs wird vorzugsweise durch artifizielle Gensynthese der einzelnen Vektormodule (Antibiotikumsresistenzgen, Selektionsmarker, Multiple cloning site etc.) wie oben beschrieben, erreicht. Die einzelnen Module werden mit entsprechenden DNA Fragmenten essentieller, nicht veränderbarer Module (Replikationsursprung, Polyadenylierungsstelle, viraler Promotor etc.) unter Verwendung singulärer Restriktionsstellen zu einem funktionellen Vektor zusammengesetzt. Bei dem Vektor kann es sich um einen viralen (z.B. abgeleitet von Adenoviren, Retroviren, Herpesviren, Alphaviren etc.) oder bakteriellen Ursprungs oder nackte DNA (Expressionsplasmide) handeln.

Der modulare Aufbau des Vektors erlaubt darüber hinaus eine schnell und einfach durchzuführende Veränderung bezüglich der einzelnen Module. Die Anzahl der Module kann variiert und entsprechend der Anwendung angepasst werden.

Für eine stabile Integration in Zellen können Elemente, wie eukaryontische Selektionsmarker (z.B. Resistenzgene gegen Hygromycin, Zeocin etc.; Selektionsreporter, wie GFP, LNGFR etc; oder Rekombinationssequenzen für eine gerichtete Rekombination) eingesetzt werden, wobei die entsprechenden Gensequenzen, soweit möglich, ebenfalls im Gehalt von CpGs reduziert werden können. Für Anwendungen in der Gentherapie können Sequenzen eingeführt werden, die immunstimulierenden Motiven entgegen wirken (z.B. immunreprimierende CpG Motive). Entsprechend können für Anwendungen bei Immunisierungen, wie z.B. bei Impfungen oder zur Herstellung von Antikörpern, Sequenzen integriert werden, welche immunstimulierende Faktoren (z.B. Immunstimulierende CpG Motive) enthalten.

Ein für diese Erfindung bevorzugter Vektor ist der in SEQ ID NO. 27 dargestellte Vektor.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind eukaryontische Zellen, stärker bevorzugt Säugetierzellen, am meisten bevorzugt humane Zellen; die eine Zielnukleinsäure oder einen Vektor (vorzugsweise in Form eines DNA-Konstrukts) wie oben beschrieben enthalten, wobei die Nukleinsäure oder der Vektor in einer transkriptionsfähigen Form vorliegen. Die Zellen sind vorzugsweise somatische Zellen bzw. bevorzugt solche Zellen, die im wesentlichen keine de novo Methylierung durchführen.

Das DNA-Konstrukt kann beispielsweise episomal vorliegen oder stabil ins Chromosom integriert sein. Dabei können in der Zelle ein oder mehrere Kopien vorliegen. Für das Einbringen besagter DNA-Konstrukte können Genfähren viralen (z.B. Adenoviren, Retroviren, Herpesviren, Alphaviren etc.) oder bakteriellen Ursprungs oder nackte DNA (Expressionsplasmide) verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Säuger-Expressionssystem, umfassend

1. a) eine modifizierte Nukleinsäuresequenz mit einer transkriptionsfähigen Region, die von einer Wildtyp-Sequenz abgeleitet ist, wobei die modifizierte Nukleinsäuresequenz so modifiziert ist, dass sie in Bezug auf das verwendete Säuger-Expressionssystem Kodon-optimiert ist und eine im Vergleich mit der Kodon-optimierten Sequenz erhöhte oder verringerte Anzahl an CpG Dinukleotiden aufweist, in operativer Verknüpfung mit einer Transkriptionskontrollsequenz und
2. b) eine Expressionsumgebung, ausgewählt aus einer Säugetierzelle und einer zellfreien Expressionsumgebung, worin (a) exprimiert werden kann, wobei das Säuger-Expressionssystem bei Expression einer modifizierten Nukleinsäuresequenz mit erhöhter Anzahl an CpG Dinukleotiden eine erhöhte Expression zeigt und bei Expression einer modifizierten Nukleinsäuresequenz mit verringerter Anzahl an CpG Dinukleotiden eine verringerte Expression zeigt.

Die vorliegende Erfindung kann somit verwendet werden, um die Expression einer Zielnukleinsäuresequenz zu erhöhen oder zu verringern. Wird die Expression gesteigert, so sollte vorzugsweise eine Erhöhung der Expression um mindestens 5 %, bevorzugt um mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 20 %, stärker bevorzugt mindestens 30 %, noch stärker bevorzugt mindestens 50 %, noch stärker bevorzugt mindestens 100-400 % oder mehr erfolgen. Je nach Länge der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz und der Anzahl der CpG Dinukleotide, die eingefügt werden können, kann auch eine Steigerung der Expression um das Zweifache, Dreifache, Fünffache oder sogar Zehnfache bis Zwanzigfache oder sogar bis Einhundert- bis Zweihundertfache erreicht werden.

Wird eine Verringerung der Expression gewünscht, so sollte vorzugsweise eine Verringerung der Expression, d.h. z.B. eine Erniedrigung der Transkriptmenge um mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 20 %, stärker bevorzugt mindestens 30 %, noch stärker bevorzugt mindestens 50 %, stärker bevorzugt mindestens 75% erfolgen. Vorzugsweise sollte die Expression sich an die Nachweisgrenze annähern.

Wie oben bereits ausführlich dargelegt, hängt die Höhe der Transkription von der Anzahl der CpG Dinukleotide im Gen ab. Das heißt, dass bei längeren Genen oder bei Genen mit mehr Möglichkeiten CpG Dinukleotide einzufügen, eine höhere Steigerung der Expression zu erreichen ist. Umgekehrt sollte es mit Hilfe der vorliegenden Erfindung möglich sein, durch die gezielte Eliminierung möglichst aller CpG Dinukleotide die Expression signifikant zu verringern, je nach Anwendung auch bis zur Nachweisgrenze.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel und Diagnostika auf der Grundlage der erfindungsgemäßen modifizierten Nukleinsäuren und/oder Vektoren. Die modifzierten Nukleinsäuren und Vektoren können bei diagnostischen, therapeutischen und/oder gentherapeutischen Anwendungen eingesetzt werden, insbesondere auch zur Herstellung von Impfstoffen.

Insbesondere können das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Expressionssysteme, Nukleinsäuresequenzen, Vektoren und Zellen zur Herstellung von DNA-Impfstoffen verwendet werden. Alternativ zu herkömmlichen Tot- und Lebendimpfstoffen gewinnt die Entwicklung von Impfstoffen, die auf "nackter" Plasmid-DNA basieren, immer mehr an Bedeutung. Der Vorteil der DNA-Impfstoffe liegt in einer Aufnahme der DNA in Zellen, verbunden mit der authentischen Produktion (inklusive Modifikation) der Antigene und einer effizienten Aktivierung von zellulärer und humuraler Immunantwort. Dabei korreliert die Höhe der induzierten Immunantwort mit der produzierten Antigenmenge und damit mit der Expressionsleistung der DNA-Konstrukte. Wenn die Expression eines beliebigen Antigens durch die Anreicherung von CpG Dinukleotiden in der kodierenden Sequenz erhöht werden kann, wird in der Folge die Aktivierung des Immunsystems und damit die Schutzwirkung verbessert.

A: Methylierung von CpG Dinukleotiden führt zur Abschaltung der Genexpression.
B: CpG Inseln schützen vor einer Methylierung und der damit verbundenen Abschaltung.
C: Sekundäre Hypomethylierung der CpG Inseln führt zu einer Genabschaltung.
D: Sekundäre Hypomethylierung kann verhindert werden durch die Reduktion von CpG Dinukleotiden im Leserahmen.

A und B: Langzeit Durchfluss-Zytometrie Analyse stabil transfizierter Flp-In 293T und CHO Zellen. Die Y-Achse gibt die GFP-bedingte Fluoreszenzintensität (MFI "mean fluorescence intensity") und die x-Achse die Messzeitpunkte in Wochen nach Transfektion.
A: FACS Analyse von huGFP und ΔCpG-GFP rekombinanten 293T Zellen.
B: FACS Analyse von huGFP und ΔCpG-GFP rekombinanten CHO Zellen.
C: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme stabiler Zelllinien.

GFP Proteinnachweis in stabil transfizierten Zellen. Expressionanalyse der GFP Leserahmen. Rekombinante Flp-In CHO Zellen, die das huGFP oder das ΔCpG-GFP Gen stabil im Zellgenom integriert haben, wurden lysiert und die Expression der Gene wurde durch konventionelle Immunoblot Analysen nachgewiesen. Auftrag der huGFP, ΔCpG-GFP und Mock-Proben sind angegeben. Von beiden polyklonalen Zellkulturen (poly.) wurden monoklonale Zelllinien etabliert (mono. 14 und 7 für ΔCpG-GFP und mono. 10 und 9 für huGFP). Mock-Zellen entspricht einer unveränderten Ausgangszellpopulation.

Quantitative Bestimmung spezifischer Transkripte stabiler Zellen. Realtime PCR Analyse spezifischer Hygromycin-Resistenzgen und gfp RNAs aus cytoplasmatischen RNA Präparationen. Die Realtime PCR Auswertung der LC Analysen sind für CHO Zellen (Hygromycinresistenz A und gfp B) sowie für 293T Zellen (Hygromycinresistenz C und gfp D) dargestellt. Abgebildet sind die Anzahl der PCR Zyklen (X-Achse) und die Fluoreszenzintensität (Y-Achse). Die spezifischen Kinetiken sind für huGFP- und ΔCpG-GFP-Produkte sowie für die primer dimer angezeigt.

MIP1alpha Expressionsanalyse nach transienter Transfektion. Repräsentative ELISA Analyse der Zelllysate und Überstände transfizierter H1299 Zellen. H1299 Zellen wurden mit jeweils 15 µg Wildtyp-und optimierten murinen MIP1alpha Konstrukten transfiziert. Die jeweilige Proteinkonzentration wurde durch konventionelle ELISA Tests im Zellkulturüberstand und im Zelllysat anhand entsprechender Standardkurven quantifiziert. Die Balken repräsentieren den Mittelwert der Gesamtproteinkonzentration für jeweils 2 unabhängige Ansätze, die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung. Auf der X-Achse ist die Anzahl der CpG Dinukleotide im offenen Leserahmen und auf der Y-Achse die Gesamtproteinkonzentration in pg/ml angegeben. Wt entspricht dem Expressionskonstrukt des jeweiligen Wildtyp-Gens.

MIP1alpha und GM-CSF Expressionsanalyse nach transienter Transfektion. Repräsentative ELISA Analyse der Überstände transfizierter H1299 Zellen. H1299 Zellen wurden mit jeweils 15 µg Wildtyp- und optimierten humanen MIP1alpha (A) und GM-CSF (B) Konstrukten transfiziert. Die jeweilige Proteinkonzentration im Überstand der Zellkultur 48h nach Transfektion wurde durch konventionelle ELISA Tests entsprechender Standardkurven quantifiziert. Die Balken repräsentieren den Mittelwert für jeweils 2 unabhängige Ansätze, die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung. Auf der X-Achse ist die Anzahl der CpG Dinukleotide im offenen Leserahmen und auf der Y-Achse die Proteinkonzentration im Überstand in pg/ml angegeben. Wt entspricht dem Expressionskonstrukt des jeweiligen Wildtyp-Gens.

A: Plasmidkarte des P-smallsyn Plasmides.
B: Plasmidkarte des Pc-ref. Module und Herkunft der Sequenzen (Wildtyp "Wt" in schwarz und synthetisch in grau) sind angegeben.

HIV-1 p24 Nachweis nach transienter Transfektion. Expressionanalyse der P-smallsyn und Pc-ref Vektoren. H1299 Zellen wurden mit den angegebenen Konstrukten transfiziert und die Proteinproduktion wurde durch konventionelle Immunoblot Analysen nachgewiesen. Analyse der Zelllysate von HIV-1 p24 transfizierten H1299 Zellen. Molekulargewichte (precision plus protein standard, Bio-Rad) sowie Auftrag der R/p24, s/p24 und Mock-transfizierten Proben sind angegeben. Mock-Transfektion entspricht einer Transfektion mit ursprünglichem pcDNA3.1 Plasmid.

HIV-1 p24-Expressionsanalyse verschiedener Expressions-konstrukte. H1299 Zellen wurden mit jeweils 15 µg R/p24, R/p24ΔCpG, s/p24 und s/p24ΔCpG Konstrukten sowie mit pcDNA3.1 (Mock Kontrolle) in unabhängigen Zweifachansätzen transfiziert. Die jeweilige p24-Proteinkonzentration im Zelllysat wurde durch konventionelle Immunoblot Analysen (A) und durch ELISA Tests (B) anhand entsprechender Standardkurven quantifiziert. Die Balken repräsentieren den Mittelwert der p24 Konzentration (in µg/ml) im Zelllysat für jeweils 2 unabhängige Ansätze.

Zwei Varianten an Grünfluoreszenz-Protein (GFP) Genen, die sich in der Anzahl an CpG Dinukleotiden unterscheiden, wurden hergestellt. Das huGFP Gen wies 60 CpGs auf, das ACpG-GFP Gen hatte keine CpGs. Das CpG depletierte Gen ΔCpG-GFP wurde künstlich aufgebaut. Beim Design des ΔCpG-GFP wurde darauf geachtet, keine seltenen Kodons oder negativ wirksamen cis-aktiven Elemente wie Spleißstellen oder poly(A) Signalstellen einzufügen. Der codon adaptation index (CAI), ein Maß für die Güte der Kodonwahl, wurde durch die Depletierung der CpGs nur geringfügig verändert (CAI(huGFP) = 0,95; CAI(ΔCpG-GFP) = 0,94). Die kodierende Aminosäuresequenz des GFP wurde dabei nicht verändert. Zur Subklonierung wurden weitere Schnittstellen eingefügt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO. 1/2 angegeben.

Die Sequenz wurde als vollsynthetisches Gen hergestellt (Geneart GmbH), unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Bam HI in den Expressionsvektor pcDNA/5FRT (Invitrogen) kloniert und unter die transkriptionelle Kontrolle des Cytomegalo-Virus (CMV) frühen Promotor/Enhancer gestellt ("pc-ΔCpG-GFP").

Zur Herstellung eines analogen, jedoch in seiner CpG Verteilung unveränderten GFP Expressionsplasmides, wurde die kodierende Region des humanisierten GFP Genes (huGFP) mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligonukleotide huGFP-1 und huGFP-2 aus einem kommerziell erhältlichen Vektor amplifiziert und ebenfalls unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Bam HI in den Expressionsvektor pcDNA/5FRT einkloniert ("pc-huGFP", SEQ ID NO. 3/4).

Für eine schnelle Etablierung und Selektion von stabilen, rekombinaten Zellen wurde das Flp-In System von Invitrogen verwendet. Ein weiterer, wesentlicher Vorteil dieses Systems besteht in einer gerichteten Integration einer Kopie des Transgens in einen definierten Lokus der Zielzelle. Diese Technologie schafft damit die beste Vorraussetzung für den quantitativen Vergleich der Expression eines beliebigen Transgens, da physiologische und genetische Faktoren der Zielzelle weitestgehend identisch sind. Um eine zusätzliche Absicherung zu erreichen, wurden zwei unterschiedliche Säugetierzellen für diese vergleichenden Analysen ausgewählt. Die Zelllinien Flp-In CHO und Flp-In 293T wurden von Invitrogen bezogen und bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert. Die Zelllinien wurden in Dulbecco's Modifiziertem Eagle Medium high glucose (DMEM) (293T) und HAMs F12 (CHO) mit L-Glutamin, 10 % inaktiviertem fötalem Rinderserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden nach Erreichen der Konfluenz im Verhältnis 1:10 subkultiviert.

Die Etablierung stabil transfizierter Zellen wurden gemäß der Angaben des Herstellers durchgeführt. 2,5 x 10⁵ Zellen wurden in 6-well Kulturschalen ausgesät und 24 h später durch Calciumphosphat Kopräzipitation (Graham and Eb, 1973) mit 1,5 µg Transferplasmid und 13,5 µg pOG44 transfiziert. Zellen wurden bis zu einem Verhältnis von >90 % GFP positive Zellen mit 100 µg/ml Hygromycin für 293T und 500 µg/ml für CHO Zellen selektioniert. Die Anzahl an GFP positiven Zellen wurde für alle Zelllinien mittels konventioneller Durchfluss-Zytometrie Analyse bestimmt.

Die Expression der Reporterkonstrukte wurde über einen Zeitraum von 16 Monaten durch regelmäßige Messung der GFP-vermittelten grünen Autofluoreszenz in einem Durchfluss-Zytometer (Becton-Dickinson) bestimmt. Die Angaben der mittleren Fluoreszenzintensitäten sind in Abb. 2A (293T Zellen) und 2B (CHO Zellen) zusammengefasst. Die huGFP-Expression konnte über den gesamten Messzeitraum in beiden Zelllinien relativ konstant mit einer mittleren Fluoreszenz-Intensität von 800 (293T) bzw. 700 (CHO) nachgewiesen werden. Das in der Anzahl an CpGs reduzierte ΔCpG-GFP Reporterkonstrukt konnte ebenfalls über den gesamten Messzeitraum in konstanter Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden. Die mittlere Fluoreszenzintensität war jedoch verglichen mit dem huGFP um den Faktor 10-20 (293T) bzw. 6-9 (CHO) reduziert. Die Reduktion der GFP-vermittelten Fluoreszenz war auch im Fluoreszenzmikroskop nachweisbar (Abb. 2C).

Da für einen Abfall der GFP-vermittelten Fluoreszenz unterschiedliche Ursachen in Betracht gezogen werden können (Instabilität des Proteins, reduzierter Kemexport der RNA, geringere Transkriptionsrate etc.) wurden zusätzlich Western Blot Analysen und quantitative Realtime PCR durchgeführt.

Für den Proteinnachweis durch Immunoblot wurden die stabilen transfizierten CHO Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI) gewaschen, in eiskaltem PBS abgekratzt, 10 Min. bei 300 x g abzentrifugiert und in Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 % Triton X-100 (w/v)) 30 min auf Eis lysiert. Unlösliche Bestandteile des Zellysates wurden 30 min bei 10000 x g und 4 °C abzentrifugiert. Die Gesamtproteinmenge des Überstandes wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, München) nach Herstellerangaben bestimmt. Die Proben wurden mit gleichem Volumen an 2-fach Probenpuffer (Laemmli, 1970) versetzt und 5 min auf 95 °C erhitzt. 40 µg Gesamtprotein aus Zelllysaten wurden über ein 12,5 %iges SDS/Polyacrylamidgel aufgetrennt (Laemmli, 1970) auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert und mit einem monoklonalen GFP-spezifischen Antikörper (BD-Bioscience) und einem sekundären, HRP (Meerrettich-Peroxidase: horse-radish-preoxidase) gekoppelten Antikörper detektiert und mittels chromogener Färbung nachgewiesen. Der Proteinnachweis per Western Blot bestätigte die Daten aus der FACS Messung. Für beide Genvarianten wurde in stabil transfizierten CHO Zellen das Volllänge-GFP Protein nachgewiesen, Unterschiede in der Prozessierung oder proteolytischen Degradation waren nicht nachzuweisen (Abb. 3).

Für eine Aufklärung der Transkriptionsaktivität wurde eine quantitative Realtime PCR (Light Cycler, Roche) für die stabil transfizierten CHO Zellen durchgeführt. Cytoplasmatische RNA wurde aus den Zellen präpariert (RNeasy, Quiagen) und mit DNase behandelt (500 U RNase-freie DNase / 20 µg RNA). 1 µg der DNase-behandelten RNA wurde als Matrize für eine Reverse Transcription (Random Primed, p(dN)₆, 1st strand C-DNA Synthesis kit for RT-PCR, Roche) mit anschließender PCR (RT-oligo1 und RT-oligo2) eingesetzt. Das resultierende PCR Produkt wurde verdünnt und für eine light cycler (LC) Analyse (SYBR, Roche) eingesetzt. Als interne Kontrolle wurde die RNA Menge des ebenfalls in das Zellgenom integrierten Hygromycinresistenzgens bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 zusammengefasst. Die RNA Mengen der Hygromycinresistenz zeigten keinen Unterschied in allen gemessenen Konstrukten (Abb. 4A für CHO Zellen und 4C für 293T Zellen). Die Ergebnisse der GFP RNA korrelierten dagegen sehr gut mit den Ergebnissen der Proteinexpression (GFP Fluoreszenzintensität). Für das CpG-deletierte Konstrukt war nach Quantifizierung der Light Cycler Daten im Vergleich zu dem Ausgangskonstrukt eine etwa siebenfach geringere cytoplasmatische RNA-Menge in CHO Zellen (Abb. 4B) und eine etwa dreißigfach geringere RNA-Menge in 293T Zellen (Abb. 4D) nachzuweisen.

In diesem Beispiel wurde die Nukleinsäuresequenz des murinen MIP1alpha Gens so verändert, dass eine Reihe von Konstrukten mit unterschiedlicher Anzahl von CpG Dinukleotiden entstand, ohne jedoch die kodierende Aminsäuresequenz zu verändern. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des murinen MIP1alpha Genproduktes in synthetische MIP1alpha-kodierende Leserahmen, unter Verwendung der Kodonwahl humaner Zellen, rückübersetzt. In einer ersten Serie von Konstrukten wurden die zufällig entstanden CpG Dinukleotide wieder schrittweise aus der Sequenz entfernt, ohne jedoch seltene Kodons, die eine Expression erwartungsgemäß verschlechtern würden, einzufügen. Darüberhinaus wurde ein CpG-Dinukleotid optimiertes MIP1alpha Genkonstrukt hergestellt, welches doppelt soviele CpG Dinukleotide wie das kodonoptimierte Konstrukt aufwies. In diesem Falle wurde bewusst eine Verschlechterung der Kodonwahl in Kauf genommen, um möglichst viele CpG Dinukleotide einzufügen. Nach Stand der Technik wäre zu erwarten, dass dieses Genkonstrukt auf Grund seiner schlechteren Kodonwahl eine geringere Expression als das kodonoptimierte Genkonstrukt aufweisen würde.

Diese Genvarianten wurde unter Verwendung von langen Oligonukleotiden und einer schrittweisen PCR als vollsynthetische Leserahmen aufgebaut und in einen Expressionsvektor kloniert. Die hergestellte MIP1 alpha Vektorvarianten erwiesen sich in der Expressionshöhe des (murinen MIP1alpha als vollständig unterschiedlich. Für den Fachmann nicht vorhersehbar zeigte sich, dass die Varianten mit den geringsten CpGs am schlechtesten exprimiert wurden und mit der Erhöhung der CpGs eine Steigerung der MIP1alpha Expression in Säugerzellen einherging. Insbesondere war für den Fachmann nicht vorhersehbar, dass das Konstrukt mit der maximal möglichen Anzahl an CpG Dinukleotiden, die jedoch auf Kosten einer Verschlechterung der Kodonwahl eingeführt wurden, eine signifikant stärkere Expression aufwies, als das kodonoptimierte Gen.

Varianten des murinen Mip1alpha Gens, die sich in der Anzahl an CpG Dinukleotiden unterscheiden, wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben künstlich aufgebaut und unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Notl in den Expressionsvektor pcDNA3.1 subkloniert. Die künstlich hergestellten Gene wurden in ihrer Kodonwahl jeweils an das Säugersystem angepasst. Beim Entfernen der CpG Dinukleotide wurden keine seltene Säugerkodons verwendet, beim Einfügen von CpG Dinukleotide über die Anzahl von Dinukleotiden die mit einer normalen Kodonadaptierung erreicht werden, wurden bewusst auch seltene Kodons verwendet.

Die kodonoptimierten, jedoch mit unterschiedlicher Anzahl von CpG Dinukleotiden versehenen Konstrukte wiesen durchweg einen CAI-Wert von über 0,9 auf und unterschieden sich nur unwesentlich. Die CAI Werte des Wildtyp-Gens, als auch des CpG Dinukleotid optimierten Gens (42 CpGs) wiesen dagegen sehr niedrige CAI Werte (unter 0,8) auf. Nach Stand der Technik wäre also eine vergleichbare Expression der kodonoptimierten Gene zu erwarten, jedoch eine deutlich geringere Expression des Wildtypgens und des CpG Dinukleotid optimierten Gens. Die Bezeichnung der Konstrukte, die Anzahl der CpGs sowie die CAI Werte sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NO. 5/6 bis SEQ ID NO. 13/14 angegeben. Das analoge, der Wildtyp-Sequenz entsprechende Expressionskonstrukt (Wildtyp-Referenzkonstrukt), war in seiner CpG Verteilung unverändert. Die kodierende Region wurde mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligonukleotide mamip-1 und mamip-2 aus einem cDNA Klon (von RZPD bezogen) amplifiziert und ebenfalls unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Notl in den Expressionsvektor pcDNA3.1 einkloniert ("pc-mamipwt", SEQ ID NO. 15, GenBank Accession Nummer AA071899).

Zur Quantifizierung der Chemokin-Expression wurden humane H1299 Zellen mit den jeweiligen Expressionskonstrukten transfiziert und die Proteinmenge in den Zellen und im Zellkulturüberstand mittels kommerzieller ELISA Testkits gemessen.

1,5 x 10⁵ humane Lungenkarzinomzellen (H1299) wurden in 6-well Zellkulturschalen ausgesät und 24 h später durch Calciumphosphat Präzipitation mit 15 µg des entsprechenden Expressionsplasmids transfiziert. Zellen und der Zellkulturüberstand wurden 48 h nach der Transfektion geerntet. Die transfizierten Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben lysiert und die Gesamtproteinmenge des Zelllysates wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay bestimmt. Aus dem Zellkulturüberstand wurden durch Zentrifugation bei 10000 x g für 15 min bei 4 °C unlösliche Zellbestandteile entfernt.

Aus 1-5 µg Gesamtprotein aus Zellysaten sowie aus verdünnten Zellkulturüberständen wurde jeweils in einem kommerziell erhältlichen ELISA Assay (R & D Systems), die Expression des Mip1alpha nach den Angaben des Herstellers überprüft. Vergleichbar mit den Daten der GFP- und p24-Expressionskonstrukten, korrelierte die Gesamtmenge an detektierbaren Mip1alpha mit der Anzahl an CpGs im Leserahmen. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Anzahl der Konstrukte erlaubte erstmals eine detaillierte Auswertung des Zusammenhangs der Expressionshöhe mit der Anzahl an CpGs innerhalb der kodierenden Region.

Ein repräsentatives Ergebnis einer Auswertung mittels Cytokin ELISA ist in Abbildung 5 wiedergegeben. Die Balken entsprechen dem Mittelwert zweier unabhängiger Transfektionsansätze, die Fehlerbalken repräsentieren die jeweilige Standardabweichung.

In der Tabelle 1 sind die relativen Proteinmengen zweier unabhängiger transienter Transfektionsexperimente (in zweifach Ansätzen) bezogen auf das Wildtyp-Konstrukt aufgelistet. Diese Ergebnisse belegen eine deutliche Reduktion der Proteinexpression mit der Verringerung der CpG Dinukleotide und eine deutliche Erhöhung verglichen mit dem Wildtyp-Gen und den kodonoptimierten Genen, korrelierend mit der zusätzlichen Einführung solcher Motive und trotz einer Verschlechterung der Kodonanpassung. Konstrukt SEQ ID NO. ID Expression* StdAbw** Anzahl CpG CAI*** pc-maMIP wt 15 100 % 4 % 8 0,76 pc-maMIP 0 5 2 % 9 % 0 0,92 pc-maMIP 2 7 8 % 27 % 2 0,93 pc-maMIP 4 9 7 % 33 % 4 0,93 pc-maMIP 13 11 146 % 5 % 13 0,97 pc-maMIP 42 13 246 % 4 % 42 0,72 * Prozentualer Mittelwert der Proteinmenge aus 2 Versuchen (in Doppelansätzen) im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge des Wildtyp-Konstruktes (maMIP wt)
** Standardabweichung
*** Codon-Adaptationsindex

Um die bisher erhaltenen Ergebnisse und Interpretationen weiter zu festigen, wurden analog zu Beispiel 2 Varianten des humanen MIP1alpha Gens, des humanen GM-CSF Gens, des humanen IL-15 Gens und des murinen GM-CSF-Gens, die sich in der Anzahl an CpG Dinukleotiden vom Wildtyp Gen unterscheiden, künstlich aufgebaut und unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und NotI in den Expressionsvektor pcDNA3.1 subkloniert. Die Bezeichnung der Konstrukte, Anzahl der CpGs sowie die CAI Werte sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Wildtypsequenzen (wt) und der Sequenzen mit veränderter Anzahl an CpG Dinukleotiden sind in SEQ ID NO. 17/18 bis SEQ ID NO. 23/24 und SEQ ID NO. 48/49 bis SEQ ID NO. 54/55 angegeben. Die Expressionskonstrukte wurden mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligonukleotide humip-1 und humip-2, hugm-1 und hugm-2, huil-1 und huil-2, magm-1 und magm-2 aus entspechenden cDNA Klonen (von RZPD bezogen) amplifiziert und ebenfalls unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und NotI in den Expressionsvektor pcDNA3.1 einkloniert ("pc-huMIP-wt", GenBank Accession Nummer NM_021006, "pc-huGM-wt", GenBank Accession Nummer M11220, "pc-hulL-wt", GenBank Accession Nummer BC018149, "pc-muGM-wt", GenBank Accession Nummer NM_049969 mit einer Abweichung).

Zur Quantifizierung der Cytokin-Expression wurden humane Zellen mit den jeweiligen Expressionskonstrukten transfiziert und die Proteinmenge im Zellkulturüberstand mittels kommerzieller ELISA Testkits gemessen.

Wie in Beispiel 2 beschrieben wurden H1299 Zellen transient mit 15 µg des entsprechenden Expressionsplasmids transfiziert. Der Zellkulturüberstand wurde 48 h nach der Transfektion geerntet. Aus dem Zellkulturüberstand wurden durch Zentrifugation unlösliche Zellbestandteile entfernt.

Aus verdünnten Zellkulturüberständen wurde jeweils in einem kommerziell erhältlichen ELISA Assay (R & D Systems für MIP1alpha; BD Pharmingen für GM-CSF und IL-15) die Expression des humanen MIP1alpha, des humanen GM-CSF, humanen des IL-15 und des murinen GM-CSF überprüft. Vergleichbar mit den Daten der erwähnten Expressionskonstrukte, korrelierte die Gesamtmenge an detektierbaren Cytokinen im Kulturüberstand mit der Anzahl an CpGs im Leserahmen. Die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Ein repräsentatives Ergebnis einer Auswertung mittels Cytokin ELISA ist in Abbildung 6 wiedergegeben. Die Balken entsprechen dem Mittelwert zweier unabhängiger Transfektionsansätzen, die Fehlerbalken repräsentieren die jeweilige Standardabweichung. In der Tabelle 2 sind die relativen Proteinmengen jeweils von einem transienten Transfektionsexperiment (in 2-fach Ansätzen) bezogen auf das Wildtyp-Konstrukt aufgelistet. Analog der Ergebnisse aus Beispiel 2 belegen auch diese Ergebnisse eine deutliche Erhöhung der Proteinproduktion, korrelierend mit der zusätzlichen Einführung solcher Motive, verglichen mit den Wildtyp-Genen. Konstrukt SEQ ID NO. Expression* Anzahl CpG CAI** pc-huMIP wt 21 100 % 8 0,76 pc-huMIP 43 17 393 % 43 0,72 pc-huGM wt 23 100 % 10 0,82 pc-huGM 63 19 327 % 63 0,70 pc-hulL wt 56 100 % 3 0,65 pc-huIL 21 52 313 % 21 0,98 pc-muGM wt 58 100 % 11 0,75 pc-muGM 62 54 410 % 62 0,75 * Prozentualer Mittelwert der Proteinmenge aus jeweils einem Versuch, in Doppelansätzen im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge des entsprechenden wildtyp Konstruktes (bezeichnet wt)
** Codon-Aadaptationsindex

Als Basis für die Herstellung eines modular aufgebauten und in der Anzahl der CpG Dinukleotide soweit als möglich reduzierten Plasmides wurde die Nukleinsäuresequenz des Plasmides pcDNA5 (Invitrogen) herangezogen. Die DNA Sequenz, die für das Ampicillinresistenzgen (bla) kodiert wurde wie unter Beispiel 1 beschrieben synthetisch hergestellt, und unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen ClaI und BglII subkloniert. Die Anzahl CpGs wurde dabei von 72 auf 2 reduziert. Ebenso wurde die Multiple Cloning Site neu konzipiert, synthetisch aufgebaut und unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen SacI und PmeI subkloniert, wodurch die Anzahl der CpGs von 11 auf 1 verringert wurde. Der CMV Promotor (31 CpGs), die BGH Polyadenylierungsstelle (3 CpGs) und der pUC Replikationsursprung (45 CpGs) wurden unverändert in das Plasmid integriert. Die Hygromycin-Resistenzkassete wurde deletiert. Der CMV Promotor wurde durch PCR Amplifikation mit den Oligonukleotiden CMV-1 und CMV-2, die zusätzlich eine ClaI und eine SacI Restriktionsschnitstelle 3' bzw. 5' anfügten, kloniert. Analog wurde der pUC ori mit den Oligonukleotiden ori-1 (enthält Xmal Schnittstelle) und ori-2 (enthält BglII Schnittstelle) und die BGH Polyadenylierungsstelle mit den Oligonukleotiden pa-1 (PmeI) und pa-2 (XmaI) durch PCR amplifiziert und unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme subkloniert. Das Plasmid pcDNA5 wurde als Template bei allen PCR Reaktionen eingesetzt. Der Aufbau dieses Plasmides ist schematisch in Abbildung 7A ("P-smallsyn") dargestellt und die vollständige Sequenz ist in SEQ ID NO. 25 angegeben.

Um den Einfluss der Anzahl von CpGs im Vektor auf die Expressionshöhe eines Transkriptes zu untersuchen, wurde der Referenzvektor so modifiziert, dass er als Kontrolle verwendet werden konnte. Durch PCR Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotide ref-del-1 und ref-del-2, die jeweils eine Nsil Restriktionsschnittstelle am 5' Ende einfügten, Spaltung mit NsiI und Ligation wurde die Hygromycin-Resistenzkassette aus dem Plasmid pcDNA5 entfernt (siehe Abbildung 6B, "Pc-ref").

Als Testtranskript wurde das von HIV-1 abgeleitete p24 Kapsidprotein verwendet. Die kodierende Region des bereits früher auf eine Expression in humanen Zellen optimierte p24 (Graf et al. 2000) wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide p24-1 und p24-2 aus einem HIV-1 syngag Konstrukt (Graf et al., 2000) amplifiziert und unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Bam HI in die beiden Vergleichsvektoren einkloniert ("R/p24" und "s/p24").

Um den Einfluss der CpG Anzahl im Vektor aus die Expression des Transkriptes zu überprüfen, wurden die Konstrukte R/p24 und s/p24 transient in humane Zellen transfiziert und die Expression des p24 analysiert.

Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden H1299 Zellen transient mit 15 µg des entsprechenden Expressionsplasmids transfiziert. Zellen wurden 48 h nach der Transfektion geerntet. Die transfizierten Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben lysiert und die Gesamtproteinmenge des Überstandes wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay bestimmt. 50 µg Gesamtprotein aus Zellysaten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in einer Western Blot Analyse mit einem monoklonalen p24-spezifischen Antikörper 13-5 (Wolf et al., 1990) auf die Expression des p24 überprüft (Abb. 8). In zwei unabhängigen Transfektionsansätzen war eine deutlich höhere p24 Expression nach Transfektion des smallsyn Konstruktes (s/p24) zu erkennen.

Zwei Varianten des von HIV-1 abgeleiteten Kapsidproteigens p24, die sich in der Anzahl an CpG Dinukleotiden unterscheiden, wurden hergestellt. Das syn p24 Gen wies 38 CpGs auf, das p24ΔCpG Gen hatte keine CpGs. Das CpG depletierte Gen p24ΔCpG wurde wie unter Beispiel 1 beschrieben künstlich aufgebaut und unter Verwendung der Schnittstellen HindIII und Bam HI in den Expressionsvektor P-smallsyn (in Beispiel 4 beschrieben) ("s/p24ΔCpG") und in den Referenzvektor Pc-ref ("R/p24ΔCpG") kloniert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von p24ΔCpG ist in SEQ ID NO. 26/27 angegeben. Als Referenzkonstrukte wurden die Plasmide R/p24 und s/p24, die im Beispiel 4 beschrieben sind, verwendet.

Um den Einfluss der CpG Anzahl im Vektor und im insert (Transkript) zu überprüfen, wurden die Konstrukte R/p24, R/p24ΔCpG, s/p24 und s/p24ΔCpG transient in humane Zellen transfiziert und die Expression des p24 analysiert.

Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden H1299 Zellen transient mit 15 µg des entsprechenden Expressionsplasmids transfiziert. Zellen wurden 48 h nach der Transfektion geerntet. Die transfizierten Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben lysiert und die Gesamtproteinmenge des Lysates wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay bestimmt.

50 µg Gesamtprotein aus Zellysaten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in einer Western Blot Analyse mit einem monoklonalen p²⁴-spezifischen Antikörper 13-5 auf die Expression des p24 überprüft (Abb. 9A). Wie in Beispiel 4 bereits gezeigt, führte die Verwendung des CpG deletierten Vektors P-smallsyn bei identischem Transgen zu einer sichtbaren Steigerung der p24 Produktion (Vergleich R/p24 und s/p24). Vergleichbar mit den Daten der GFP- und der Cytokin/Chemokin-Expressionskonstrukten, korrelierte die Menge an detektierbaren p24 im Zelllysat, bei Verwendung des identischen Vektorhintergrundes, mit der Anzahl an CpGs im Leserahmen (Vergleich R/p24 und R/-p24ΔCpG sowie s/p24 und s/p24ΔCpG). Die Daten wurden in einem p24-spezifischen ELISA bestätigt (Abb. 9B). Das Konstrukt mit 38 CpGs (p24) wies eine ca. 2,5 fach (Pc-ref) bzw. ca 25 % (P/smallsyn) höhere Menge an p24 auf als das Konstrukt ohne CpGs (p24 DcpG). Die Ergebnisse sind in Abb. 9 gezeigt.

Die Korrelation der Proteinproduktion mit der Anzahl an CpG Dinukleotiden konnte in den hier genannten Beispielen belegt werden. Die ausgewählten Gene stammen aus so unterschiedlichen Organismen wie einer Qualle, einem humanpathogenen Virus und Säugetieren. Es liegt daher nahe, diesen Mechanismus als allgemeingültig anzusehen. Die Beispiele belegen weiterhin, dass diese Korrelation in vitro sowohl bei einer transienten Transfektion, als auch bei stabilen rekombinanten Zellen Gültigkeit hat. Das hier beschriebene Verfahren, die Genexpression in Eukaryonten durch gezielte Modulation der CpG Dinukleotide, sowohl in der kodierenden Region, als auch im Vektorhintergrund, gezielt zu verändern, kann folglich für die Produktion von Biomolekülen für biotechnologische, diagnostische oder medizinische Anwendung verwendet werden.

SEQ ID NO. Bezeichnung Sequenz 5' - 3' 28 huGFP-1 29 huGFP-2 AGTAGGATCCTATTACTTGTACAGCTCGT 30 RT-oligo1 CCCTGAAGTTCATCTGCACC 31 RT-oligo2 GATCTTGAAGTTCACCTTGATG 32 mamip-1 CAGGTACCAAGCTTATGAAGGTCTCCACCACTGC 33 mamip-2 34 hugm-1 CAGGTACCAAGCTTATGTGGCTGCAGAGCCTGC 35 hugm-2 36 humip-1 CAGTACCAAGCTTATGCAGGTCTCCACTGCTGC 37 humip-2 38 p24-1 39 p24-2 40 CMV-1 41 CMV-2 GAATGAGCTCTGCTTATATAGACC 42 ori-1 43 ori-2 44 pa-1 45 pa-2 46 ref-del-1 47 ref-del-2 AGTCATGCATCCATAGAGCCCACCGCATCCCCA 48 huil-1 CAGGTACCAAGCTTATGAGAATTTCGAAACCAC 49 huil-2 50 magm-1 51 magm-2

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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
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  <212> PRT
  <213> Künstliche Sequenz
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:depletiertes
  delta green-fluorescent-protein (GFP) Gen
• <400> 2
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  <211> 720
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:humanes
  green-fluorescent-protein (huGFP) Gen
• <220>
  <221> CDS
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  <212> PRT
  <213> Künstliche Sequenz
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:humanes
  green-fluorescent-protein (huGFP) Gen
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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
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  CpG-Dinukleotiden)
• <220>
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  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
  MIP1alpha-OCpG (murines MIP1alpha-Gen mit 0
  CpG-Dinukleotiden)
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  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: murines
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  CpG-Dinukleotiden)
• <220>
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  <213> Künstliche Sequenz
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: murines
  MIPlalpha-2CpG (murines MIP1alpha Gen mit 2
  CpG-Dinukleotiden)
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  <212> DNA
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  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
  MIPalpha-4CpG (murines MIPalpha Gen mit 4
  CpG-Dinukleotiden)
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  <213> Künstliche Sequenz
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
  MIPalpha-4CpG (murines MIPalpha Gen mit 4
  CpG-Dinukleotiden)
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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
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  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
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  CpG-Dinukleotiden)
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  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:murines
  MIPalpha-13CpG (murines MIPalpha Gen mit 13
  CpG-Dinukleotiden)
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  MIPalpha-42CpG (murines MIPalpha Gen mit 42
  CpG-Dinukleotiden)
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  MIPlalpha-43CpG (humanes MIP1alpha-Gen mit 43 CpG)
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  Gen
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  <223> humanes GM-CSF Gen Wildtyp (10 CpG)
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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:p smallsyn
  Vektor
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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:p24 delta CpG
  Gen (HIV-1 Plasmid p24 (Kapsidprotein) Gen mit
  depletierten CpG-Dinukleotiden)
• <220>
  <221> CDS
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  <212> PRT
  <213> Künstliche Sequenz
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:p24 delta CpG
  Gen (HIV-1 Plasmid p24 (Kapsidprotein) Gen mit
  depletierten CpG-Dinukleotiden)
• <400> 27
• <210> 28
  <211> 34
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  huGFP-1
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  caataagctt gccaccatgg tgagcaaggg cgag    34
• <210> 29
  <211> 29
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  huGFP-2
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  agtaggatcc tattacttgt acagctcgt    29
• <210> 30
  <211> 20
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  RT-oligol
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  ccctgaagtt catctgcacc    20
• <210> 31
  <211> 22
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer oligo2
• <400> 31
  gatcttgaag ttcaccttga tg    22
• <210> 32
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  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  mamip-1
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  caggtaccaa gcttatgaag gtctccacca ctgc    34
• <210> 33
  <211> 43
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  mamip-2
• <400> 33
  cagagctcga gtcatgaaga ctaggcattc agttccaggt cag    43
• <210> 34
  <211> 33
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer hugm-1
• <400> 34
  caggtaccaa gcttatgtgg ctgcagagcc tgc    33
• <210> 35
  <211> 43
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer hugm-2
• <400> 35
  cagagctcga gtcatgaaga ctactcctgg actggctccc agc    43
• <210> 36
  <211> 33
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  humip-1
• <400> 36
  cagtaccaag cttatgcagg tctccactgc tgc    33
• <210> 37
  <211> 45
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  humip-2
• <400> 37
  cagagctcga gtcatgaaga ctaggcactc agctccaggt cactg    45
• <210> 38
  <211> 43
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer p24-1
• <400> 38
  actaggtacc atctaagctt atgcccatcg tgcagaacat cca    43
• <210> 39
  <211> 45
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer p24-2
• <400> 39
  tcaagagctc gactggatcc tattacagca ccctggcctt gtggc    45
• <210> 40
  <211> 41
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer CMV-1
• <400> 40
  caaaggtacc gttaatcgat gttgacattg attattgact a    41
• <210> 41
  <211> 24
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer CMV-2
• <400> 41
  gaatgagctc tgcttatata gacc    24
• <210> 42
  <211> 35
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer ori-1
• <400> 42
  gtcacccggg tagtgaattc atgtgagcaa aaggc    35
• <210> 43
  <211> 35
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer ori-2
• <400> 43
  gatcttttct acgggagatc tgtcaatcga tagct    35
• <210> 44
  <211> 42
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer pa-1
• <400> 44
  gttagagctc cagtgtttaa acctgtgcct tctagttgcc ag    42
• <210> 45
  <211> 39
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer pa-2
• <400> 45
  caaacctacc gatacccggg ccatagagcc caccgcatc    39
• <210> 46
  <211> 42
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  ref-del-1
• <400> 46
  tcagatgcat ccgtacgtta acatgtgagc aaaaggccag ca    42
• <210> 47
  <211> 33
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
  ref-del-2
• <400> 47
  agtcatgcat ccatagagcc caccgcatcc cca    33
• <210> 48
  <211> 33
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:primer 5'-3
• <220>
  <223> huil-1
• <400> 48
  caggtaccaa gcttatgaga atttcgaaac cac    33
• <210> 49
  <211> 45
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:primer 5-3
• <220>
  <223> huil-2
• <400> 49
  cagagctcga gtcatgaaga ctaagaagtg ttgatgaaca tttgg    45
• <210> 50
  <211> 34
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:primer 5-3
• <220>
  <223> magm-1
• <400> 50
  caggtaccaa gcttatggcc cacgagagaa aggc    34
• <210> 51
  <211> 43
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:primer 5' -3
• <220>
  <223> magm-2
• <400> 51
  cagagctcga gtcatgaaga ctatttttgg cctggttttt tgc    43
• <210> 52
  <211> 489
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetisches
  Gen
• <220>
  <223> humanes IL-15-21CpG
• <220>
  <221> CDS
  <222> (1)..(489)
• <400> 52
• <210> 53
  <211> 162
  <212> PRT
  <213> Künstliche Sequenz
  <223> humanes IL-15-21CpG
• <400> 53
• <210> 54
  <211> 426
  <212> DNA
  <213> Künstliche Sequenz
• <220>
  <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:synthetisches
  Gen
• <220>
  <223> murines GM-CSF-62CpG
• <220>
  <221> CDS
  <222> (1)..(426)
• <400> 54
• <210> 55
  <211> 141
  <212> PRT
  <213> Künstliche Sequenz
  <223> murines GM-CSF-62CpG
• <400> 55
• <210> 56
  <211> 489
  <212> DNA
  <213> human
• <220>
  <223> humanes IL-15-wildtyp (3CpG)
• <220>
  <221> CDS
  <222> (1)..(489)
• <400> 56
• <210> 57
  <211> 162
  <212> PRT
  <213> human
  <223> humanes IL-15-wildtyp (3CpG)
• <400> 57
• <210> 58
  <211> 426
  <212> DNA
  <213> murin
• <220>
  <223> murines GM-CSF-wildtyp (11 CpG)
• <220>
  <221> CDS
  <222> (1)..(426)
• <400> 58
• <210> 59
  <211> 141
  <212> PRT
  <213> murin
  <223> murines GM-CSF-wildtyp (11 CpG)
• <400> 59