[0001] Le marquage des biomolécules et le suivi des phénomènes biologiques demandent l'élaboration
de sondes fluorescentes qui sont devenues des outils incontournables pour les études
structurelles et fonctionnelles des milieux biologiques.
[0002] Une sonde fluorescente est une molécule conjuguée, composée d'un groupement fluorophore
ou fluorochrome attaché de façon covalente à un groupement ayant des propriétés d'interactions
spécifiques avec l'environnement biologique adéquat.
[0003] Cette sonde fluorescente possède la propriété d'absorber l'énergie lumineuse qui
lui est adressée à une longueur d'onde bien définie, constituant ainsi la phase d'excitation,
puis de restituer cette énergie sous forme de lumière fluorescente, appelée phase
d'émission. Ainsi, après excitation, une fois l'énergie du photon absorbée, la molécule
se trouve dans un état électroniquement excité, et retourne alors à l'état d'énergie
fondamentale en émettant un photon. Cette émission de photon, phénomène de fluorescence,
se fait à une longueur d'onde légèrement supérieure à la longueur d'onde d'excitation.
On peut alors enregistrer un spectre de fluorescence qui est spécifique de la molécule.
[0004] Il est alors possible de localiser une sonde fluorescente dans un milieu biologique
à l'aide de microscopes à fluorescence ou d'un cytomètre en flux en excitant la préparation
à une longueur d'onde appropriée.
[0005] Il existe un grand choix de fluorochromes, comme par exemple les dérivés de fluoresceine
ou de rhodamine. Tous ne sont pas adaptés au suivi biologique. Les caractéristiques
essentielles sont : les valeurs des longueurs d'onde d'excitation et d'émission pour
que l'étude soit réalisable, un coefficient d'extinction adapté à la concentration
de la sonde utilisée pour l'étude, le rendement quantique qui permet d'avoir un signal
important sans perte d'énergie et stable dans le temps, c'est-à-dire possédant une
demi-vie assez longue à l'état excité.
[0006] De plus il est souhaitable que le fluorophore sélectionné participe le moins possible
à des réactions chimiques dans son environnement au cours de la mesure, ce qui conduirait
à une perte de ses propriétés de fluorescence, c'est-à-dire une perte du signal.
[0007] Les dérivés ayant un squelette benzoxadiazole, appelés aussi benzofurazanes, possèdent
les propriétés de fluorescence requises. Les valeurs des longueurs d'ondes utilisées
pour l'excitation et l'émission, ainsi que la qualité du phénomène en intensité et
stabilité, sont reliés à la structure du composé, et de ses substituants.
[0009] Des dérivés fluorescents benzoxadiazoles pour un usage biologique ont été étudiés
(
Anal. Chim. Acta, 2005, 550, 173,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1717,
Luminscence, 2002, 17,
J. Med.Chem. 1999, 42, 3101).
[0010] Le cancer est encore une des principaies causes de mortalité du monde occidental.
Les moyens de lutte que sont la prévention, la chirurgie, la radiothérapie, l'immunothérapie
et la chimiothérapie ne permettent pas encore, dans de nombreux cas, d'éradiquer la
maladie.
[0011] Les raisons de cet échec reposent en partie sur la difficulté d'identifier la cellule
tumorale et de la traiter sélectivement sans trop endommager le tissu sain.
[0012] Des composés portant un groupe fluorescent sont décrits dans l'art antérieur pour
leur utilisation dans l'étude des cellules cancéreuses, tels que :
- des peptides, substrats de l'acétyltransférase PAT, portant un marqueur fluorescent
(NBD) utiles pour l'étude de l'activité de PAT, notamment dans des cellules cancéreuses
(Ducker et al. Methods 2006, 40, 166-170) ;
- deux dérivés fluorescents de la choline et de la phosphatidylcholine (NBD-choline
et C6-NBD-PC) permettant l'étude de la distribution et de l'absorption de la choline dans
des cellules normales ou cancéreuses (Villa et al. European Journal of Cancer 2005, 41, 1453-1459) ;
- des analogues fluorescents du méthylbenzoprim (MBP) portant un groupe fluorophore
DNS, NBD ou MMC utiles comme sonde pour la caractérisation du transport cellulaire,
de l'accumulation et de la distribution d'antifolates lipophiles, notamment dans des
lignées cellulaires cancéreuses surexprimant Pgp ou MRP (Robson et al. Biochemical Pharmacology 1998, 56, 807-816).
[0013] Les molécules hybrides conjuguées benzoxadiazoles - polyamines permettent également
de répondre à la problématique de l'identification et du traitement selectif de cellules
tumorales.
[0014] En effet, la cellule cancéreuse nécessite pour sa prolifération un grand nombre d'éléments
biologiques indispensables parmi lesquels sont présents les polyamines (spermine,
spermidine, putrescine). Les polyamines sont indispensables à toute cellule en prolifération.
En situation normale, la synthèse endogène de polyamine suffit à la cellule, mais
dans le cas des cellules cancéreuses, un apport exogène de polyamines à l'aide d'un
transport actif est le plus souvent nécessaire. Ainsi, la mise en évidence de ce transport
actif permet de détecter les cellules cancéreuses et de suivre leur-progression en
terme de croissance et de dissémination. Cependant, le transporteur de polyamine,
dans les cellules humaines, n'est, à ce jour, pas identifié au niveau moléculaire.
La seule méthode pour démontrer sa présence est donc d'utiliser une sonde reconnue
par ce transporteur qui, en s'accumulant dans la cellule, rendra compte de l'activité
du transporteur.
[0015] Le transporteur de polyamines est un complexe protéique dont la structure n'est pas
connue dans les détails.
[0016] Ce transporteur joue un rôle d'importation intracellulaire des polyamines naturelles
que sont la putrescine, la spermidine, et la spermine.
[0017] Ces polyamines sont essentielles au développement et à la croissance cellulaire.
Le métabolisme intra cellulaire pourvoit normalement aux besoins de la cellule saine.
Ce métabolisme fourni ces polyamines à partir des acides aminés que la cellule possède.
L'arginine se transforme en ornithine, l'ornithine subit une décarboxylation pour
fournir la putrescine. Cette putrescine (C4) peut s'allonger d'une chaîne en C3 grâce
à une adénosine méthionine, suivi de décarboxylation, fournissant la spermidine. Cette
dernière peut à nouveau s'allonger d'un motif en C3 grâce aussi à un autre résidu
méthionine, fournissant la spermine.
[0018] Ces polyamines également peuvent se dégrader par oxydation avec des polyamineoxydases,
et ainsi se retransformer en spermidine et putrescine.
Si le mécanisme intracellulaire est perturbé, par un dysfonctionnement quelconque
(ex : cellule cancéreuse), le métabolisme intracellulaire ne suffit plus aux besoins
de la cellule, ainsi elle va se pourvoir à l'extérieur en polyamines.
C'est ici que le transporteur de polyamine intervient. Il joue un rôle d'alimentation
et de régulation.
[0019] Dans le cas par exemple du composé de l'exemple 27 de la demande de brevet
WO 2005/100363 : le motif structural « épipodophyllotoxine » greffé sur la spermine ne semble pas
modifier la reconnaissance du transporteur de polyamines ce qui permet d'internaliser
le composé dans la cellule tumorale, qui ultérieurement jouera son rôle d'agent cytotoxique.
De la même façon les sondes fluorescentes possédant un motif polyamine seront reconnues
par le transporteur de polyamines.
[0020] Il existe cependant parmi le panel de lignées cellulaires étudiées en cancérologie,
une variabilité dans l'expression du transporteur de polyamines. A l'aide des sondes
de diagnostic, il est possible d'identifier par avance (avant traitement antitumoral)
les cellules qui seront sensibles au traitement et celles qui ne le seront pas.
[0021] Plus la fluorescence intracellulaire sera forte, plus la cellule en question sera
sensible au traitement avec un anticancéreux ciblé (par exemple le composé de l'exemple
27 de la demande de brevet
WO 2005/100363).
[0022] La présente invention se rapporte donc à des composés constitués d'un motif polyamine
lié à un motif benzoxadiazole substitué, porteur de la fluorescence qui peuvent être
utilisés comme de telles sondes. En effet, la partie polyamine de ces molécules sera
reconnue par le système de transport des polyamines et la molécule sera internalisée
au sein de la cellule cancéreuse, tandis que le motif porteur de la fluorescence sera
détecté par les systèmes d'analyse classiques en milieu biologique, permettant ainsi
de sélectionner les tumeurs qui expriment le système de transport des polyamines.
[0023] La mise en évidence de ce système de transport des polyamines sur les cellules permet
donc de sélectionner les patients porteurs de tumeurs susceptibles d'être soignées
par tout composé anticancéreux vectorisé par le système de transport des polyamines,
quel que soit son mécanisme d'action.
[0024] Ainsi, pourra être révélé dans les tumeurs prélevées par biopsies ou dans les cellules
leucémiques prélevées par ponction chez les patients hospitalisés concernés, une fluorescence
proportionnelle à l'expression du transporteur de polyamine. Les patients porteurs
de ces tumeurs pourront alors être sélectionnés afin d'être traités préférentiellement
avec les composés anticancéreux vectorisés vers le système de transport des polyamines,
en étant assurés de bien meilleures chances de réponse au traitement.
[0027] Mais, aucune de ces publications ne mentionne l'utilisation des dérivés de polyamine-benzoxadiazole
pour mettre en évidence les cellules tumorales exprimant le système de transport des
polyamines.
[0028] La présente invention concerne de nouveaux dérivés fluorescents constitués d'un motif
polyamine sur lequel est lié un motif porteur de la fluorescence, le benzoxadiazole
substitué, leur procédé de préparation et leur utilisation à la mise en évidence du
système de transport des polyamines à l'intérieur des cellules. Elle concerne également
leur utilisation à la sélection des tumeurs exprimant le système de transport des
polyamines ainsi que leur utilisation dans la sélection de patients porteurs de telles
tumeurs.
[0029] Ces dérivés correspondent à la formule 1 suivante :

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans laquelle :
R1 représente un ou deux groupes NO2 en position 4 et/ou 6, la chaîne polyamine peut être en position 5, 6 ou 7 ;
R2 représente un hydrogène, un alkyle en C1-6, un benzyle, un groupe perfluoroalkyle ;
les valeurs de a, b, c peuvent être de 2 à 5, indépendamment les unes des autres,
et représentent des enchaînements alkylènes séparant les groupes aminés ;
les valeurs de d et e peuvent être indépendamment de 0 ou 1 mais ne peuvent pas représenter
en même temps la valeur 0 ;
à la condition que lorsque e = 0, alors R2 ne peut représenter un hydrogène ; et
à l'exception du composé pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 3, b = 4, c =3 et d = e = 1.
[0030] Les composés de la présente invention peuvent être sous forme de sels d'addition
minéraux ou organiques.
[0031] Dans la présente invention, on entend par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui
est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement
sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable
pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.
[0032] Par « sel pharmaceutiquement acceptable » d'un composé, on entend désigner dans la
présente invention des sels qui sont pharmaceutiquement acceptables, comme défini
ici, et qui possèdent l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent.
[0033] Par « sel d'addition », on entend plus particulièrement, au sens de la présente invention,
un sel d'addition d'un acide minéral ou organique.
[0034] A titre d'exemple, on peut citer les sels d'addition d'acide formés avec des acides
minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique,
l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques
tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique,
l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique,
l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque,
l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique,
l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique,
l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique,
l'acide tartrique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide
trifluoroacétique et similaires.
[0035] Par « 4-NO
2 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe NO
2 (nitro) en position 4.
[0036] Par « alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée
saturée, linéaire ou ramifiée, comportant de 1 à 6 atomes de carbone. En particulier,
il peut s'agir d'un groupe méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, tert-butyle,
isobutyle, pentyle ou encore hexyle.
Par « perfluoroalkyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe alkyle
tel que défini ci-dessus où tous les atomes d'hydrogènes ont été remplacés par des
atomes de fluor.
[0037] Avantageusement, R
1 représente un groupe NO
2 en position 4.
Plus particulièrement la présente invention concerne les composés dans lesquels :
- R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e =1,
- R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1,
- R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, ou
- R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
[0038] Encore plus particulièrement l'invention concerne les composés suivants :
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine
correspondant au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a =3, b= 4, c = 3, d = e =1,
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-méthyl-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine
correspodant au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1,
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine correspondant
au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2 R2 = H, a = 0, b = 4, c=3, d = 0, e = 1,
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1,
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2=H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, et
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
[0039] L'invention concerne également un procédé de synthèse des composés de formule 1 caractérisé
en ce qu'il comprend les étapes a), b) et c) suivantes :
- a) Couplage d'un dérivé de benzoxadiazole de formule 2

dans laquelle R1 représente un ou 2 groupes NO2 en position 4 et/ou 6 ; et avantageusement un groupe NO2 en position 4 ;
R3 représente un substituant halogène mobile en position ortho ou para du groupe R1,
avec une polyamine de formule 6, en position 5, 6 ou 7, c'est-à-dire en ortho ou para
du groupe R1, dans laquelle P représente un groupement protecteur des fonctions amine et où a,
b, c, d et e ont les mêmes significations que celles données précédemment.

[0040] Les groupements protecteurs P peuvent être des groupements BOC (tertiobutyloxycarbonyle)
clivables en milieu acide (HCl ou acide trifluoroacétique (TFA))
[0041] Au cours de cette réaction de couplage la polyamine réagit avec le benzoxadiazole
par substitution de l'halogène par traitement avec une base dans un solvant inerte.
[0042] Plus particulièrement, le composé de formule 2 est le 4-nitro-7-chlorobenzoxadiazole.
[0043] Plus particulièrement encore, le solvant inerte est l'acétonitrile et la base le
carbonate de Cesium.
[0044] Les différents benzoxadiazoles sont décrits dans les publications suivantes :
J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1998, 2165,
J. Chem.Soc, Perkin Trans 2, 1999, 569. Des exemples de dérivés polyamine, les dérivés spermine protégés par 3 groupes benzyloxycarbonyel
ou tertiobutyloxycarbonyle, sont décrits dans la publication : (
Tet. Let. 1998, 39, 439).
b) Le composé issu de la réaction de couplage a) est alkylé par un halogénure d'alkyle
en présence d'une base dans un solvant inerte. On utilisera préférentiellement le
THF (tétrahydrofurane) comme solvant.
De manière préférentielle, on utilisera comme base l'hydrure de sodium ou un carbonate
alcalin.
[0045] De manière préférentielle également, on utilisera le THF comme solvant.
c) Le composé issu de l'étape b) est ensuite déprotégé en milieu acide à température
ambiante pour obtenir les composés de formule 1.
[0046] De manière préférentielle cette étape de déprotection se fait dans l'acide chlorhydrique
ou dans l'acide trifluoroacétique.
[0047] La présente invention concerne également l'utilisation des composés de formule 1
suivante :

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci,
dans laquelle :
R1 représente un ou deux groupes NO2 en position 4 et/ou 6, la chaîne polyamine peut être en position 5, 6 ou 7 ;
R2 représente un hydrogène, un alkyle en C1-6, un benzyle, un groupe perfluoroalkyle ;
les valeurs de a, b, c peuvent être de 2 à 5, indépendamment les unes des autres,
et représentent des enchaînements alkylènes séparant les groupes aminés ;
les valeurs de d et e peuvent être indépendamment de 0 ou 1 mais ne peuvent pas représenter
en même temps la valeur 0 ;
comme sonde fluorescente de diagnostic pour la mise en évidence des tumeurs exprimant
le système de transport des polyamines.
[0048] Les composés de la présente invention peuvent être sous forme de sels d'addition
minéraux ou organiques.
Avantageusement, R
2 ne représentera pas un hydrogène lorsque e = 0.
[0049] Avantageusement, R
1 représente un groupe NO
2 en position 4.
Plus particulièrement, les composés de formule 1 utiles comme sonde fluorescente de
diagnostic concernent les composés dans lesquels :
- R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e =1,
- R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1,
- R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, ou
- R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
Encore plus particulièrement, les composés de formule 1 concernent les composés suivants
:
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine
correspondant au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a =3, b= 4, c = 3, d = e =1,
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-méthyl-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine
correspodant au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1,
- Le N-(3-Aminopropyl)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine correspondant
au composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2 R2 = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1,
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1,
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, et
- Le composé de formule 1 pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
[0050] Les exemples suivants décrivent les différents stades pour la préparation des composés
de l'invention et ne sont en aucune manière limitatifs.
Exemple 1 : Synthèse du N-(3-aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine.
[0051]

[0052] La synthèse de ce composé de formule 1 est réalisée selon le schéma suivant :

Stade 1 : Préparation de la triBOC spermine de formule 3 (Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 2397).
[0053]

[0054] 40 g de spermine sont placés en solution dans 300 mL de CH
2Cl
2, et refroidis à 0°C. On ajoute goutte à goutte 23,8 mL de trifluoroacétate d'éthyle
en solution dans 50 mL de CH
2Cl
2. La solution sous agitation est laissée 1 heure ensuite à température ambiante. Le
résidu obtenu est repris dans 600 mL de THF, on y introduit 140,28 mL de triéthylamine.
Une solution de 174,48 g de BOC
2O dans 200 mL de THF est alors introduite en maintenant la température à 20°C. L'agitation
à température ambiante est maintenue encore trois heures, puis le milieu réactionnel
est jeté sur de l'eau et extrait par l'éther isopropylique. Après décantation, séchage
sur sulfate de sodium, filtration et évaporation, la solution organique est évaporée.
Le résidu obtenu est alors repris dans 900 mL d'un mélange MeOH/H
2O 8/2. On ajoute 192,6 g de carbonate de Césium et on porte le tout à reflux pendant
trois heures. Après évaporation du méthanol sous pression réduite, on ajoute de l'eau
et on extrait par de l'éther isopropylique. On décante la phase organique, puis on
introduit dans cette phase organique de l'acide chlorhydrique 0,5 N. On laisse décanter.
Il apparaît 3 phases. La phase du milieu sous forme huileuse contient le produit attendu
sous forme de chlorhydrate. On décante cette phase, puis on la reprend par du CH
2Cl
2, et on sèche sur sulfate de sodium. Après filtration et évaporation, on obtient 54
g du chlorhydrate de la triBOC spermine sous forme d'une huile incolore utilisée directement
dans l'étape suivante (Rdt = 50%). CCM SiO
2 : CH
2Cl
2-MeOH-NH
4OH (90-10-10) Rf = 0,5.
[0055] Stade 2 : Condensation avec le fluorophore.
[0056] 5,39 g de l'huile obtenue au stade 1 sont mis en solution dans 100 mL d'acétonitrile,
de 6,42 g de carbonate de Césium et de 2 g de 4-chloro-7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazole
sous agitation. Le mélange est porté au reflux pendant une heure. Le milieu réactionnel
est fixé sur de la silice et le solvant évaporé. Le résidu solide est placé en tête
de colonne de flash chromatographie, et éluée avec un gradient partant de l'heptane
pur au mélange heptane-AcOEt (50-50). On obtient alors 4,4 g (66%) d'une huile rouge.
CCM : Si02 Heptane/AcOEt (50-50) Rf = 0,3. SM (APCI) m/z = 666,3 (MH+) ;
1H RMN (CDCl
3) : 8,47(d, 1H, J = 8Hz, H
5), 7,96(m, 1H, NH), 6,17(d, 1H, J = 8Hz, H
6), 3,53(m, 2H, NHCH
2), 3,38(m, 2H, CH
2NH), 3,10-3,21(m, 8H, NCH
2), 1,92(m, 2H, CH
2), 1,66(m, 2H, CH
2), 1,43-1.51(m, 31H, CH
2, t-Bu).
[0057] Stade 3 : Alkylation en R
2. Préparation de l'ester tertiobutylique de l'acide (3-{t-butoxycarbonyl-[4-(t-butoxycarbonyl-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-amino)-butyl]-amino}-propyl)-carbamique
de formule 5.
[0058] Le composé obtenu au stade précédent (4,4 g) est dissous dans 150 mL d'acétonitrile,
en présence de 4 g de carbonate de Césium et 2,05 mL d'iodure de méthyle. Le milieu
réactionnel est agité à température ordinaire pendant quatre heures. Le milieu est
fixé sur silice par évaporation du solvant puis chromatographié sur une colonne flash
de diamètre 50 mm. Par élution en gradient à partir de l'heptane pur au mélange heptane
-AcOEt (50-50), on obtient 4,2 g d'une huile rouge (Rdt = 93%). CCM : Heptane-AcOEt
(30-70) Rf = 0,4. SM (ESI) m/z = 680,4 (MH+) ;
1H RMN (DMSO) : 8,48(d, 1H, J = 8Hz, H
5), 6,40(d, 1H, J = 8Hz, H
6), 3,47(m, 2H, NHCH
2), 3,33(s, 3H, NCH
3), 3,24(m, 2H, CH
2NH), 3,15(m, 2H, NCH
2), 3,08(m, 4H, NCH
2), 2,88(m, 2H, NCH
2), 1,91(m, 2H, CH
2), 1,54(m, 2H, CH
2), 1,36(m, 31H, CH
2, t-Bu).
[0059] Stade 4 : 4,2 g du composé du stade précédent sont dissous dans 20 mL d'une solution 4M d'HCl
dans le dioxane et maintenus trois heures sous agitation à température ordinaire.
Le précipité orange du chlorhydrate est alors filtré rincé par du méthanol puis par
de l'éther éthylique. Après séchage sous pression réduite, on obtient 2,8 g (92%)
de sel du N-(3-aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine
de formule 1. F=260°C. SM (ESI) m/z = 380,2 (MH+) ;
1H RMN (D
2O) : 8,50(d, 1H, J = 8Hz, H
5), 6,41(d, 1H, J = 8Hz, H
6), 4,27(m, 2H, NHCH
2), 3,54(s, 3H, NCH
3), 3,11-3,27(m, 10H, CH
2NH), 2,26(m, 2H, CH
2), 2,11(m, 2H, CH
2), 1,82(m, 4H, CH
2).
[0060] De la même façon, les composés de formule 1 où d = 0, e = 1 et b = 3, c = 4 ou bien
b = 4 et c = 3, peuvent être préparés selon la même méthodologie en utilisant la spermidine
diprotégèe. Les différentes méthodes utilisées pour préparer ces polyamines protégées
de formule 6 (P = benzyloxycarbonyle ou bien tertiobutyloxycarbonyle) sont soit décrites
dans la demande de brevet
WO 2005/100363, soit indiquées dans les publications mentionnées.
Exemple 2 : Synthèse de la N-1-(7-Nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl]butane-1,4-diamine
[0061]

[0063] Il est synthétisé selon la présente invention par le procédé suivant :
Stade 1 : Porter à reflux 30 minutes, dans 5 mL d'acétonitrile, un mélange constitué de 200
mg de 4-chloro-7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazole et de 190 mg d'ester tertiobutylique
de l'acide (4-aminobutyl)-carbamique, et 320 mg de carbonate de Césium. Après refroidissement
le milieu est versé dans l'eau et extrait avec de l'acétate d'éthyle. Décanter et
sécher la phase organique sur sulfate de sodium. Filtrer et évaporer sous pression
réduite. Une chromatographie flash sur silice éluée avec un gradient de l'heptane
pur à l'acétate d'éthyle pur en 30 minutes, permet d'isoler après évaporation 280
mg (rdt 80%) de l'ester tertiobutylique de l'acide [4-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ylamino)-butyl]-carbamique
sous forme d'une huile. CCM SiO2 : Heptane-AcOEt (30-70), Rf = 0,5. SM (ESI) m/z = 352,1 (MH+) ; 1H RMN (DMSO) 9,55(s, 1H, NH), 8,50(d, 1H, J = 8Hz, H5), 6,83(m, 1H, NH), 6,42(d, 1H, J = 8Hz, H6), 3,47(m, 2H, NHCH2), 2,96(m, 2H, CH2NH), 1,66(m, 2H, CH2), 1,48(m, 2H, CH2), 1,36(s, 9H, t-Bu).
Stade 2 : 280 mg du carbamate obtenu au stade précédent sont mis en solution dans 15 mL de
chlorure de méthylène et 2 mL d'acide trifluoroacétique, puis agités pendant 15 minutes
à température ambiante. Après évaporation, le résidu huileux obtenu est cristallisé
dans l'éther isopropylique. On isole 150 mg (rdt 51%) de trifluoroacétate de N-1-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl]butane-1,4-diamine.
CCM SiO2 : CH2C12-MeOH-NH4OH (90/10/1), Rf = 0,7. SM (ESI) m/z = 252,1 (MH+) ; 1H RMN (DMSO) 9,54(s, 1H, NH), 8,53(d, 1H, J = 8Hz, H5), 7,70(s, 2H, NH2), 6,44(d, 1H,
J = 8Hz, H6), 3,50(m, 2H, NHCH2), 2,84(m, 2H, CH2NH), 1,59-1,76(m, 4H, CH2CH2).
Exemple 3 (comparatif) : Synthèse de la N-(3-Aminopropyl)-N'-[3-(7-méthylbenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ylamino)-propyl]-butane-1-4-diamine.
[0064]
Stade 1 : 250 mg de triBOC spermine obtenue au stade 1 de l'exemple 1 sont mis à réagir avec
100 mg de diméthylamide de l'acide 4-fluorobenzo[1,2,5]oxadiazole-4-sulfonique en
présence de 0,17 mL de triéthylamine dans 10 mL d'acétonitrile sous agitation à température
ordinaire pendant 30 minutes. Le milieu réactionnel est jeté sur de l'eau acidifiée
avec HCl et extrait avec de l'acétate d'éthyle. Après décantation et lavage de la
phase organique par de l'eau saturée de NaCl, la solution est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. On obtient 250 mg d'une huile jaune (Rdt = 84%). SM (ESI) m/z
= 728,5 (MH+) ; 1H RMN (DMSO) : 7,83(d, 1H, J = 8Hz, H5), 6,30(d, 1H, J = 8Hz, H6), 3,35(m, 2H, NHCH2), 2,68(s, 6H, NMe2), 3,23(m, 2H, CH2N), 3,14(m, 6H, CH2N), 2,87(m, 2H, NCH2), 1,86(m, 2H, CH2), 1,55(m, 2H, CH2), 1,36(m, 31H, CH2, t-Bu).
Stade 2 : 250 mg du composé protégé précédemment obtenu sont agités à température ambiante
pendant 30 minutes dans 2 mL d'acide trifluoroacétique et 10 mL de CH2Cl2. Après évaporation, on cristallise avec un rendement quantitatif 260 mg de trifluoroacétate
de N-(3-aminopropyl)-N'-[3-(7-méthylbenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ylamino)-propyl]-butane-1-4-diamine
dans l'éther isopropylique, avec des traces d'acétone. SM (ESI) m/z = 428,3 (MH+)
; 1H RMN (DMSO) : 7,84(d, 1H, J = 8Hz, H5), 6,37(d, 1H, J = 8Hz, H6), 2,85-3,05(m, 12H, NHCH2), 2,70(s, 6H, NMe2), 2,00(m, 2H, CH2), 1,90(m, 2H, CH2), 1,62(s, 4H, CH2).
Exemple 4 : Etude pharmacologique
1. Sélectivité des sondes vis-à-vis des cellules tumorales.
[0065] Les cellules issues de biopsies sont dissociées mécaniquement en présence ou non
de trypsine selon la constitution du tissu considéré. Les cellules hématopoiétiques
sont séparées et isolées selon les méthodes de préparation classiques des cellules
sanguines. Une fois isolées dans un temps assez court pour assurer la viabilité des
cellules étudiées, les cellules sont mises en présence de la sonde telle que synthétisée
par exemple dans les exemples 1 à 3 et laissées incubées dans le milieu de culture
recommandé pour le tissu considéré en présence d'aminoguanidine. L'aminoguanidine
permet d'éviter une dénaturation
in vitro des polyamines. On procèdera en absence de sérum (trop riche en polyamine et donc
source d'erreur de mesure). Une incubation de une à quatre heures est suffisante et
permet une détection de la fluorescence par immunochimie ou par cytométrie en flux
en choisissant les longueurs d'onde d'excitation et d'émission compatibles avec le
substituant de la sonde fluorescente. Cette analyse est réalisée par un cytomètre
en flux ou par histochimie selon une méthodologie standard en excitant, dans l'étude
ci-dessous la sonde obtenue à l'exemple 1, le N-(3-aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine
par une source de 488nm et en mesurant l'émission de fluorescence à 525nm. Dans ce
même exemple, des cellules A549 dérivées d'une tumeur humaine d'un cancer du poumon
non à petites cellules ont été testées en comparaison de cellules MRC-5 issues d'un
poumon sain et disponibles commercialement auprès de banques de lignées cellulaires.
Résultats :
[0066] La figure 1 annexée donne les images obtenues par un microscope à fluorescence standard
des cellules cultivées sur lame. Elle montre une incorporation bien supérieure de
la sonde de l'exemple 1 dans les cellules tumorales (Figure 1A) que dans les cellules
issues de tissus sain (Figure 1B). Ce différentiel a également été confirmé par cytométrie
en flux.
[0067] Ce résultat confirme l'intérêt d'utiliser les composés de la présente invention comme
sonde fluorescente de diagnostic permettant de sélectionner les tumeurs éligibles
pour un traitement avec un composé anticancéreux vectorisé par le transporteur de
polyamines.
2. Prédictivité de la réponse aux agents anticancéreux vectorisés vers le système
de transport des polyamines.
[0068] Afin de comparer l'incorporation des sondes telles que décrites ci-dessus et ainsi
de démontrer le caractère prédictif de la réponse aux agents vectorisés vers le système
de transport des polyamines, une mesure de la cytotoxicité par une méthode standard
(ici la mesure de l'ATP résiduel à l'aide du kit ATPlite de la société Perkin-Elmer)
a été réalisée. On utilisera un composé anticancéreux dérivé de l'épipodophyllotoxine
dont la pénétration intracellulaire dépend du transporteur de polyamine, tel le composé
décrit dans l'exemple 27 de la demande de brevet
WO 2005/100363 et à titre de référence, l'étoposide, une épipodophyllotoxine non vectorisée. Ces
2 composés ont le même mécanisme d'action sur les cellules cancéreuses : ce sont tous
les 2 des inhibiteurs de la topoisomérase 2.
[0069] Un panel de lignées leucémiques a été testé afin de rendre compte de l'incorporation
de sonde, ici celle décrite à l'exemple 1, en regard de la sensibilité à un agent
vectorisé tel que le composé de l'exemple 27 de la demande de brevet
WO 2005/100363 et en comparaison de l'étoposide non vectorisé. Après 72 heures d'incubation avec
le composé de l'exemple 27 de la demande de brevet
WO 2005/100363 ou l'étoposide, la cytotoxicité est évaluée à l'aide du kit ATPlite. Les cellules
de même lignée ont également été incubées en présence de la sonde décrite à l'exemple
1, et ont été analysées par cytométrie en flux. L'intensité de fluorescence mesurée
à 525nm a été suivie de 0 à 1 heure 30 minutes et la pente de la variation d'intensité
a été calculée.
Résultats :
[0070] Dans un premier temps la comparaison de la cytotoxicité du composé de l'exemple 27
de la demande de brevet
WO 2005/100363 et de l'étoposide de mode d'action similaire, a permis, par l'établissement d'un
ratio des IC
50, d'identifier les leucémies pour lesquelles la vectorisation avait un rôle prépondérant
dans l'efficacité du composé.
[0071] Pour l'ensemble des lignées testées, la capacité d'incorporer la sonde fluorescente,
caractérisée par la fluorescence mesurée par cytométrie de flux est également mesurée.
[0072] Ces résultats sont donnés dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1
Lignée cellulaire |
Cytotoxicité de l'Etoposide IC50 (µM) |
Cytotoxicité du composé de l'exemple 27 de WO 2005/100363 IC50 (µM) |
Ratio d' IC50 Etoposide/composé de l'exemple 27 de WO 2005/100363 |
Activité de transport des polyamines* |
CEM |
0,06 |
0,003 |
20 |
421 |
BL-41 |
0,4 |
0,009 |
44 |
164 |
BLUE-1 |
1 |
0,1 |
10 |
58 |
U-937 |
0,4 |
0,04 |
10 |
33 |
KG-1 |
5 |
5 |
1 |
17 |
* Unité arbitraire d'intensité de fluorescence : (intensité des cellules en présence
de sonde) - (intensité des cellules en l'absence de sonde). |
[0073] Il apparaît clairement que l'intensité de fluorescence est la plus forte dans les
cellules pour laquelle la vectorisation est également importante.
[0074] En conclusion, le fait de mesurer l'incorporation de la sonde permet de prédire une
meilleure efficacité et une meilleure sélectivité antitumorale d'un composé anticancéreux
tel que le composé de l'exemple 27 de la demande de brevet
WO 2005/100363. Ces résultats démontrent que le suivi de l'incorporation de la sonde permet d'identifier
des cellules leucémiques disposant d'un fort transport actif des polyamines, et par
conséquent susceptibles d'être traitées efficacement par les composés anticancéreux
vectorisés par le transporteur de polyamines.
[0075] Le différentiel obtenu par cytométrie en flux est comparable à celui visualisé par
histochimie. Il est possible de réaliser un test plus simple en ne mesurant la fluorescence
qu'à un temps donné. Ceci a été vérifié en réalisant cette mesure de fluorescence
après 1 heure 30 minutes d'incubation seulement. Ceci peut présenter un avantage dans
un cadre hospitalier pour apporter une réponse rapide à la sélection de cellules répondeuses.
[0076] Par extension, de telles mesures peuvent s'appliquer à des blastes de patients prélevées
par prise de sang ou ponction de moelle au cours des analyses de routine. La mesure
de l'intensité de fluorescence sera réalisée par une procédure de routine par cytométrie
de flux ou histocytochimie dans tous les hôpitaux disposant d'une plate-forme de cytologie
et/ou d'anatomopathologie.
1. Utilisation d'un composé de formule générale 1 :

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci,
dans laquelle :
R1 représente un ou deux groupes NO2 en position 4 et/ou 6 ;
la chaîne polyamine peut être en position 5, 6 ou 7 ;
R2 représente un hydrogène, un alkyle en C1-6, un benzyle, un groupe perfluoroalkyle ;
les valeurs de a, b, c peuvent être de 2 à 5, indépendamment les unes des autres,
et représentent des enchaînements alkylènes séparant les groupes aminés ;
les valeurs de d et e peuvent être indépendamment de 0 ou 1 mais ne peuvent pas représenter
en même temps la valeur 0 ;
comme sonde fluorescente de diagnostic pour la mise en évidence des tumeurs exprimant
le système de transport des polyamines.
2. Composé de formule générale 1 :

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci :
dans laquelle :
R1 représente un ou deux groupes NO2 en position 4 et/ou 6 ;
la chaîne polyamine peut être en position 5, 6 ou 7 ;
R2 représente un hydrogène, un alkyle en C1-6, un benzyle, un groupe perfluoroalkyle ;
les valeurs de a, b, c peuvent être de 2 à 5, indépendamment les unes des autres,
et représentent des enchaînements alkylènes séparant les groupes aminés ;
les valeurs de d et e peuvent être indépendamment de 0 ou 1 mais ne peuvent pas représenter
en même temps la valeur 0 ;
à la condition que lorsque e = 0, alors R2 ne peut représenter un hydrogène ; et
à l'exception du composé pour lequel R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 3, b = 4, c =3 et d = e = 1.
3. Composé selon la revendication 2 dans lequel R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.
4. Composé selon la revendication 2 dans lequel R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 4, c=3, d = 0, e = 1.
5. Composé selon la revendication 2 dans lequel R1 = 4-NO2, R2 = H ou alkyle en C1-6, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
6. Composé selon la revendication 2 dans lequel R1 = 4-NO2, R2 = alkyle en C1-6, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
7. Composé selon la revendication 2, le N-(3-Aminopropyl)-N'-{3-[méthyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine,
dans lequel :
R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a =3, b= 4, c = 3, d = e =1.
8. Composé selon la revendication 2, le N-(3-Aminopropyl)-N'-méthyl-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine,
dans lequel : R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
9. Composé selon la revendication 2, le N-(3-Aminopropyl)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine,
dans lequel : R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
10. Composé selon la revendication 2, dans lequel : R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
11. Composé selon la revendication 2, dans lequel : R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
12. Composé selon la revendication 2, dans lequel : R1 = 4-NO2, R2 = Méthyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
13. Procédé de synthèse d'un composé de formule 1 tel que défini à la revendication 1,
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) Couplage d'un dérivé de benzoxadiazole de formule 2

dans laquelle R1 représente un ou 2 groupes nitro en position 4 et/ou 6 ;
R3 représente un substituant halogène mobile en position 7,
avec une polyamine de formule 6 dans laquelle P représente un groupement protecteur
des fonctions amine et où a, b, c sont compris entre 2 et 5, indépendamment les uns
des autres, et où d et e peuvent être indépendamment 0 ou 1 ;

b) Alkylation du composé issu de la réaction de couplage a) par un halogénure d'alkyle
en présence d'une base dans un solvant inerte ; et
c) Déprotection du composé issu de l'étape b) en milieu acide à température ambiante
pour obtenir le composé de formule 1.
1. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel 1:

oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, worin:
R1 eine oder zwei NO2-Gruppen an Position 4 und/oder 6 darstellt;
die Polyamin-Kette an Position 5, 6 oder 7 vorliegen kann;
R2 einen Wasserstoff, ein C1-6-Alkyl, ein Benzyl, eine Perfluoralkyl-Gruppe darstellt;
die Werte von a, b, c unabhängig voneinander 2 bis 5 betragen können und Alkylen-Verbindungen
darstellen, welche die Amingruppen voneinander trennen;
die Werte von d und e unabhängig 0 oder 1 sein können, aber nicht gleichzeitig den
Wert 0 haben können;
als fluoreszierende Sonde für die Diagnostik zum Nachweis von Tumoren, welche das
Polyamin-Transport-System exprimieren.
2. Verbindung der allgemeinen Formel 1:

oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, worin:
R1 eine oder zwei NO2-Gruppen an Position 4 und/oder 6 darstellt;
die Polyamin-Kette an Position 5, 6 oder 7 vorliegen kann;
R2 einen Wasserstoff, ein C1-6-Alkyl, ein Benzyl, eine Perfluoralkyl-Gruppe darstellt;
die Werte von a, b, c unabhängig voneinander 2 bis 5 betragen können und Alkylen-Verbindungen
darstellen, welche die Amingruppen voneinander trennen;
die Werte von d und e unabhängig 0 oder 1 sein können, aber nicht gleichzeitig den
Wert 0 haben können;
unter der Bedingung, dass, wenn e = 0, R2 dann keinen Wasserstoff darstellen kann;
mit Ausnahme der Verbindung, bei der R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3 und d = e = 1.
3. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R1 = 4-NO2, R2 = C1-6-Alkyl, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.
4. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R1 = 4-NO2, R2 = H oder C1-6-Alkyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
5. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R1 = 4-NO2, R2 = H oder C1-6-Alkyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
6. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R1 = 4-NO2, R2 = C1-6-Alkyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
7. Verbindung gemäß Anspruch 2, N-(3-Aminopropyl)-N'-{3-[methyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)amino]propyl}-butan-1,4-diamin,
worin:
R1 = 4-NO2, R2 = Methyl, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.
8. Verbindung gemäß Anspruch 2, N-(3-Aminopropyl)-N'-methyl-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butan-1,4-diamin,
worin:
R1 = 4-NO2, R2 = Methyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
9. Verbindung gemäß Anspruch 2, N-(3-Aminopropyl)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butan-1,4-diamin,
worin:
R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
10. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin:
R1 = 4-NO2, R2 = Methyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
11. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin:
R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
12. Verbindung gemäß Anspruch 2, worin:
R1 = 4-NO2, R2 = Methyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1, wie in Anspruch 1 definiert,
dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
a) Kopplung eines Benzoxadiazol-Derivats der Formel 2

worin R1 ein oder zwei Nitrogruppen an Position 4 und/oder 6 darstellt;
R3 einen beweglichen Halogen-Substituenten an Position 7 darstellt,
mit einem Polyamin der Formel 6, worin P eine Schutzgruppe der Aminfunktionen darstellt,
und worin a, b, c unabhängig voneinander 2 bis 5 betragen, und worin d und e unabhängig
0 oder 1 sein können;

b) Alkylierung der aus der Kopplungsreaktion a) hervorgegangenen Verbindung durch
ein Alkylhalogenid in Gegenwart einer Base in einem inerten Lösungsmittel; und
c) Entschützen der aus Schritt b) hervorgegangenen Verbindung in saurem Milieu bei
Umgebungstemperatur zum Erhalt der Verbindung der Formel 1.
1. Use of a compound of general formula 1:

or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
in which:
R1 represents one or two NO2 groups at position 4 and/or 6;
the polyamine chain can be at position 5, 6 or 7;
R2 represents a hydrogen, a C1-6 alkyl, a benzyl, a perfluoroalkyl group;
the values of a, b, c can be 2 to 5, independently of each other, and represent alkylene
chains separating the amino groups;
the values of d and e may be 0 or 1 independently but may not represent the value
0 at the same time;
as fluorescent diagnostic probe to detect tumors expressing the polyamine transport
system.
2. Compound of general formula 1:

or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
in which:
R1 represents one or two NO2 groups at position 4 and/or 6;
the polyamine chain can be at position 5, 6 or 7;
R2 represents a hydrogen, a C1-6 alkyl, a benzyl, a perfluoroalkyl group;
the values of a, b, c can be 2 to 5, independently of each other, and represent alkylene
chains separating the amino groups;
the values of d and e may be 0 or 1 independently but may not represent the value
0 at the same time;
provided that when e = 0, R2 may not represent a hydrogen;
with the exception of the compound for which R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3 and d = e = 1.
3. Compound according to claim 2, in which R1 = 4-NO2, R2 = C1-6 alkyl, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.
4. Compound according to claim 2, in which R1 = 4-NO2, R2 = H or C1-6 alkyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
5. Compound according to claim 2, in which R1 = 4-NO2, R2 = H or C1-6 alkyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
6. Compound according to claim 2, in which R1 = 4-NO2, R2 = C1-6 alkyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
7. Compound according to claim 2, N-(3-aminopropyl)-N'-{3-[methyl-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadia-zol-4-yl)-amino]-propyl}-butane-1,4-diamine,
in which:
R1 = 4-NO2, R2 = methyl, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.
8. Compound according to claim 2, N-(3-aminopropyl)-N'-methyl-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxa-diazol-4-yl)-butane-1,4-diamine,
in which: R1 = 4-NO2, R2 = methyl, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
9. Compound according to claim 2, N-(3-aminopropyl)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-yl)-butane-1,4-diamine,
in which: R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.
10. Compound according to claim 2, in which: R1 = 4-NO2, R2 = methyl, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
11. Compound according to claim 2, in which: R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.
12. Compound according to claim 2, in which: R1 = 4-NO2, R2 = methyl, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.
13. Method to synthesize a compound of formula 1 as defined in claim 1,
characterized in that it comprises the following steps:
a) Coupling a derivative of benzoxadiazole of formula 2

in which R1 represents one or two nitro groups at position 4 and/or 6;
R3 is a halogen substituent mobile at position 7, with a polyamine of formula 6 in which
P is a protector group of the amine functions and in which a, b, c lie between 2 and
5, independently of each other, and in which d and e can independently be 0 or 1;

b) Alkylating the compound derived from the coupling reaction a) with an alkyl halide
in the presence of a base in an inert solvent; and
c) Deprotecting the compound derived from step b) in an acid medium at room temperature
to obtain the compound of formula 1.