[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanz zur Behandlung von Phantomphänomenen,
nämlich dem akuten Tinnitus.
[0002] Derartige Substanzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
[0003] Unter dem Phantomphänomen des Tinnitus werden von einem Patienten wahrgenommene Geräusche
verstanden, die durch das Ohr und das auditorische System erzeugt werden. Tinnitus,
der erst seit wenigen Wochen bis drei Monaten besteht, wird als akuter Tinnitus bezeichnet.
Besteht der Tinnitus länger als ein Jahr, wird er als chronisch bezeichnet. Nach epidemiologischen
Erhebungen sind in Deutschland ca. drei Millionen Erwachsene, d.h. etwa 4 % der Bevölkerung,
von chronischem Tinnitus betroffen. Global betrachtet kommt es jährlich bei ca. zehn
Millionen Menschen zu Tinnitus, der bei ca. 340.000 von einer akuten in eine chronische
Form übergeht, sog. Neuerkrankungsrate.
[0004] Zu den vielfältigen Ursachen des Tinnitus gehören chronische Lärmschädigungen, akute
Knallverletzungen des Gehörs, Hörsturz und anderweitige Erkrankungen, die mit einem
Hörverlust einhergehen. Zusammenhänge mit Innenohrschwerhörigkeit als chronischfortschreitende
Form oder als Lärmschwerhörigkeit, gefolgt von Morbus Menière und Hörsturz stehen
gemäß klinischen Studien bei mehr als zwei Drittel im Zusammenhang mit Tinnitus. An
der Entstehung und Aufrechterhaltung des Tinnitus sind auch Erkrankungen der Halswirbelsäule
sowie des Kiefergelenks und Kaumuskelsystems beteiligt. Tinnitus scheint auch eine
psychische Komponente aufzuweisen, so dass in diesem Zusammenhang von psychogenem
Tinnitus gesprochen wird. In vielen Fällen lässt sich jedoch trotz intensiver Diagnostik
keine sichere Ursache des Tinnitus erkennen.
[0005] Derzeit wird Tinnitus mit psychosomatischer Behandlung, Relaxationstherapie, Biofeedback,
Hypnotherapie, elektrischer Stimulation, Lidocain, Iontophorese oder Maskierung therapiert.
Hierbei handelt es sich jedoch um ausschließlich symptomatische Therapiekonzepte.
[0006] Die
WO 02/15907 A1 schlägt die Behandlung von Tinnitus durch die Verabreichung des Kalium-Kanal-Öffners
Flupirtin vor. Diese Behandlung hat den Nachteil, dass es sich bei Flupirtin zusätzlich
um ein muskelrelaxierendes Analgetikum handelt, wodurch eine Applikation mit nicht
zu tolerierenden Nebenwirkungen verbunden wäre.
[0007] Wang et al. (2000), Evaluating effects of some medicine on tinnitus with animal behavioral
model in rats, Zhonghua Er. Bi. Yan. Hou. Ke. Za. Zhi. 35 (5), abstract, schlagen
die Verabreichung von Nimodipin zur Behandlung von Tinnitus vor. Bei Nimodipin handelt
es sich um einen Inhibitor des Ca
++-Kanals Cav1.3. Dabei hat sich allerdings ergeben, dass die Blockade des Cav1.3-Kanals
im auditorischen System unmittelbar zur Taubheit führen würde, so dass Nimodipin für
die Behandlung von Tinnitus gänzlich ungeeignet ist.
[0008] In der
WO 2004/022069 A1 werden als eine der möglichen Ursachen von Tinnitus aberrante NMDA(N-Methyl-D-Aspartat)-Rezeptoren
beschrieben. Diese veränderten sog. Glutamatrezeptorkanäle, die u.a. von auditorischen
Nervenzellen exprimiert werden, führen zu verstärktem Einstrom von Calcium in die
Zelle. In diesem Dokument wird vorgeschlagen, zur Behandlung von Tinnitus NMDA-Rezeptor-Antagonisten
einzusetzen. Völlig unklar bleibt allerdings, ob mit diesen Substanzen die akute oder
chronische Situation des Tinnitus zu behandeln ist. Ferner finden sich keinerlei Hinweise,
wie die Applikation der Substanzen zu erfolgen hat.
[0009] In der
DE 101 24 953 A1 wird ein Behandlungskonzept bei Tinnitus vorgeschlagen, das in der Stimulation der
Expression des "Brain-derived Nerve Growth Factors" (BDNF) liegt. Die dortigen Autoren
beschreiben auf der Grundlage eines Tiermodelles, dass bei chronischem Tinnitus in
der Cochlea und im inferioren Colliculus eine Erniedrigung der BDNF-Expression vorherrscht,
weshalb als therapeutischer Ansatz die Stimulation der BDNF-Expression vorgeschlagen
wird. Die dortigen Autoren haben jedoch ganz konkret und ausschließlich die Situation
bei chronischem Tinnitus untersucht. So wurden die in dem Tiermodell verwendeten Ratten
über drei Monate mit Salicylaten behandelt, wodurch bekanntermaßen chronischer Tinnitus
induziert wird; vgl.
Penner M. J., und Jastreboff P. J. (1996), Tinnitus: Psycho-physical observations
in humans and animal models, in: Van de Water, Popper A. N., Fax, R. R. (Ed.), Clinical
aspects of hearing, Springer, New York, Heidelberg, Seiten 208 bis 304; und
Bauer, C. A., et al. (1999), A behavioral model of chronic Tinnitus in rats. Otolaryngol.
Head Neck Surg. 121, Seiten 457 bis 462.
[0010] Nicht erkannt wurde von den Autoren der
DE 101 24 953 A1 jedoch, dass es signifikante Unterschiede zwischen der Behandlung von chronischem
und akutem Tinnitus geben muss.
[0012] Zahlreiche Veröffentlichungen beschäftigen sich mit diversen Substanzen, die potentiell
zur Behandlung von Tinnitus eingesetzt werden könnten.
[0013] In
WO 2005/073237 wird die Verwendung des Wirkstoffs Gaboxadol Monohydrat für die Behandlung von neurologischen
und psychiatrischen Krankheiten, wie unter anderem Tinnitus, offenbart.
[0014] Theopold (Laryng. Rhinol. Otol. 64 (1985) 609-613) beschreibt die Verwendung von Nimodipin als potentielles Therapiekonzept bei Innenohrerkrankungen.
Bei Nimodipin handelt es sich um ein kalziumantagonistisches Derivat der Dihydropyridine
mit prädilektiver Wirkung auf das zerebrale Gefäßsystem.
[0020] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Substanz zur Therapie des
akuten Tinnitus bereitzustellen, mit der bzw. dem die Nachteile aus dem Stand der
Technik verhindert werden. Insbesondere soll eine solche Substanz bereitgestellt werden,
mit der gezielt die Phantomphänomene des akuten Tinnitus behandelt werden können.
[0021] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer mit der BDNF-Signaltransduktionskaskade
interagierenden Substanz gelöst.
[0022] Bei BDNF ("Brain-derived Nerve Growth Factor") handelt es sich um ein von Neuronen
des Zentralnervensystems gebildetes basisches Protein, das aus 252 Aminosäuren besteht.
BDNF ist ein Wachstumsfaktor, der in die Entwicklung des Nervensystems involviert
ist und u.a. eine Rolle bei der Ausbildung der Plastizität der Synapsen spielt. Die
Wirkung von BDNF wird über spezielle Rezeptoren vermittelt, bspw. über den BDNF-Rezeptor
trkB, der wiederum nachgeschaltete Faktoren, wie die MAP-Kinase oder Cam-Kinase in
ihrer Aktivität bzw. Wirkungsweise reguliert. BDNF wird wiederum selbst reguliert,
bspw. über Calcium.
[0023] Sämtliche Faktoren, die BDNF in seiner Aktivität, Expression, Wirkungsweise o.Ä.
beeinflussen oder regulieren, bzw. sämtliche Faktoren, die durch BDNF auf diese Art
und Weise beeinflusst oder reguliert werden, bilden die sog. BDNF-Signaltransduktionskaskade.
[0024] Die BDNF-Signaltransduktionskaskade kann unterteilt werden in eine Kaskade, die dem
BDNF-Rezeptor trkB vorgeschaltet, und eine, die diesem nachgeschaltet ist. Die trkB-nachgeschaltete
Signaltransduktionskaskade wird durch die Bindung von BDNF sowie anderer Mitglieder
der Neurotropinfamilie an den trk-Rezeptor eingeleitet. Dies führt zu einer trk-Dimerisierung
und Aktivierung der Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors. Durch diese ligandenvermittelte
Aggregation der Rezeptoren kommt es zur Autophosphorylierung intrazellulärer Domänen,
die eine Aktivierung von Signalmolekülen, wie der Phospholipase C (PLC), der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase
(PI3-Kinase) und des Adapterproteins Shc (SH-2-enthaltendes Protein), zur Folge haben.
Die weiteren Signale, vor allem vermittelt über die ras-abhängige MAP-Kinase, beeinflusst
letztendlich zelluläre Gentranskription und Proteinsynthese.
[0025] Die trkB-vorgeschaltete Kaskade betrifft die Regulation von BDNF. So ist es bekannt,
dass die BDNF-Expression aktivitätsabhängig durch unterschiedliche Stimuli reguliert
wird, wie elektrische Stimulation oder Verletzung, reine physische Bewegung oder auch
durch den Tagesrhythmus. Vorstehend genannte Stimuli regulieren die Expression verschiedener
nicht-translatierter BDNF-Exone, die dann zusammen mit dem gemeinsamen 5'-Exon letztlich
unterschiedliche BDNF-Transkripte bilden. Die Stimuli wirken offenbar über unterschiedliche
Ca
++-induzierte Signalkaskaden auf die Promotoren der verschiedenen BDNF-Exone.
[0026] Erfindungsgemäß wird die Blockade oder Inhibition des BDNF-Rezeptors und die diesem
Rezeptor nachgeschaltete BDNF-Signaltransduktionskaskade adressiert. Es versteht sich,
dass auch trkB selbst Bestandteil der BDNF-Signaltransduktionskaskade ist.
[0029] Erfindungsgemäß kann sich eine die Blockade oder Inhibition des BDNF-Rezeptors bewirkende
oder der nachgeschalteten BDNF-Signaltransduktionskaskade interagierende Substanz
in jeglicher Ausgestaltung darstellen, d.h. es kann sich um eine solche Substanz handeln,
die sowohl chemisch als auch biochemisch oder biologisch definiert ist, die also eine
chemisch synthetisierte Verbindung jeglicher Ausprägung ist, ein Molekül, Ion, Atom,
ein Protein, Peptid, Antikörper, eine Nucleinsäure, ein Aptamer, ein Virus, Bakterium
etc. darstellt.
[0030] Unter Interaktion wird erfindungsgemäß die direkte oder indirekte Wechselwirkung
dieser Substanz mit einem Faktor der nachgeschalteten BDNF-Signaltransduktionskaskade
verstanden, die in einer Modifizierung der physiologischen Signaltransduktion innerhalb
dieser Kaskade resultiert. Derartige interagierende Substanzen sind im Stand der Technik
hinreichend beschrieben.
[0031] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird mit der Bereitstellung einer solchen
Substanz vollständig gelöst. Insbesondere haben die Erfinder erstmals eine Verwendung
derartiger Substanzen zur Therapie für die Phantomphänomene des akuten Tinnitus bereitgestellt.
[0032] Es kann nun dank der Erfindung gezielt die akute Ausprägung des Tinnitus behandelt
werden und somit im Vorfeld die problematische Chronifizierung dieses Phantomphänomens
verhindert werden. Im Stand der Technik wird häufig keinerlei Differenzierung zwischen
chronischem und akutem Tinnitus vorgenommen und vielfach lediglich Ansätze zur Behandlung
von chronischem Tinnitus vorgeschlagen, wie auch in der oben erwähnten
DE 101 24 953 A1.
[0033] Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, wenn eine solche interagierende Substanz
vorgesehen wird, die eine Blockade oder Inhibition des BDNF-Rezeptors oder der diesem
Rezeptor nachgeschalteten BDNF-Signaltransduktionskaskade bewirkt.
[0034] Erfindungsgemäß wird in diesem Sinne unter einer Blockade oder Inhibition verstanden,
dass die Signalweiterleitung innerhalb der BDNF-Signaltransduktionskaskade gegenüber
der physiologischen Situation verlangsamt, verschlechtert, reduziert oder völlig unterdrückt
wird.
[0035] Diese Erkenntnis der Erfinder war völlig überraschend und steht im Gegensatz zu Erkenntnissen,
die in der
DE 101 24 953 A1 für chronischen Tinnitus beschrieben sind. So wird nämlich in dem vorstehend genannten
Dokument eine Stimulation der BDNF-Expression gefordert, wohingegen gemäß der Erfindung
zur Behandlung von Phantomphänomenen, wie dem akuten Tinnitus, eine Inhibition der
BDNF-Expression bzw. BDNF-Signaltransduktion gefordert wird. Die Erfinder haben deshalb
erkannt, dass bei akutem Tinnitus eine Therapie zu erfolgen hat, die genau entgegengesetzt
ausgestaltet ist, wie dies gemäß dem vorgenannten Dokument für chronischen Tinnitus
vorgeschlagen wird. Eine Übertragung dieses bekannten Konzeptes auf den akuten Zustand
hätte deshalb fatale Folgen.
[0036] Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bei Ratten durch kurzzeitige Gabe von
Salicylaten akuten Tinnitus induziert und in den cochleären Ganglien eine verstärkte
Expression von BDNF festgestellt. Die Erfinder konnten nachweisen, dass die Verhältnisse
bei der Induktion von chronischem Tinnitus genau umgekehrt liegen, es dort also zu
einer verminderten Expression von BDNF in den cochleären Ganglien kommt.
[0037] Es hat sich also überraschenderweise gezeigt, dass eine Differenzierung zwischen
akutem und chronischem Tinnitus für die Wahl der richtigen Behandlungsmethode essentiell
ist und bislang nicht oder nicht ausreichend im Stand der Technik erfolgt ist. Akuter
Tinnitus ist deshalb erfindungsgemäß über eine Inhibition bzw. Blockade der BDNF-Signaltransduktionskaskade,
bspw. durch Hemmung der BDNF-Expression, zu behandeln, wohingegen gemäß der
DE 101 24 953 A1 bei chronischem Tinnitus eine Stimulation der BDNF-Expression zu erfolgen hat.
[0038] Die Erfinder präsentieren hier erstmals molekulare Daten, die die Mechanismen der
Pathologie von Tinnitus aufzeigen, und bereichern damit die Grundlagenwissenschaften
und die Medizin um ein besseres Verständnis über diese Phantomphänomene und zeigen
gleichzeitig einen ursächlichen Therapieansatz auf.
[0039] Erfindungsgemäß wird auch eine solche Substanz zur Verwendung vorgesehen, die eine
Blockade oder Inhibition der trkB nachgeschalteten Signaltransduktionskaskade bewirkt.
[0040] Substanzen, die Faktoren der BDNF-Signaltransduktionskaskade inhibieren, lassen sich
leicht über Aktivitäts- bzw. Inhibitionstests ermitteln, die zum Routinehandwerk eines
Molekularbiologen oder eines klinischen Chemikers bzw. Pharmakologen gehören.
[0041] Erfindungsgemäß wird alternativ eine solche Substanz vorgesehen, die eine Blockade
oder Inhibition des BDNF-Rezeptors (trkB) oder der diesem nachgeschalteten Signaltransduktionskaskade
bewirkt.
[0042] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein weiterer geeigneter Angriffspunkt für einen
therapeutischen Eingriff ausgenutzt wird. So kann trkB selbst mittels geeigneter im
Stand der Technik bekannter Substanzen und damit die gesamte nachfolgende BDNF-Signaltransduktionskaskade
blockiert werden. Ferner können mittels des "molecular drug designs" anhand von kristallographischen
Daten über trkB geeignete, mit diesem Rezeptor interagierende Substanzen entwickelt
werden, die vorteilhafte Wirkstoffe für ein Arzneimittel zur Behandlung von akutem
Tinnitus oder Phantomschmerz darstellen. Auch Faktoren, die trkB in der Signaltransduktionskaskade
nachgeschaltet sind, wie bspw. PLC, PI3-Kinase oder Shc, sind geeignete Angriffspunkte
für eine erfindungsgemäße Verwendung der Substanz. Eine Stilllegung oder Inhibition
dieser Faktoren führt ebenfalls zu einer geeigneten Blockade der BDNF-Signaltransduktionskaskade.
[0043] Dabei ist es bevorzugt, wenn als Substanz ein MAP-Kinase-, ein Cam-Kinase-Inhibitor
oder ein trkB-Antagonist vorgesehen wird. Besonders geeignete MAP-Kinase-Inhibitoren
sind erfindungsgemäß die Substanzen U 0126 oder PD 98058.
[0044] Wie die Erfinder feststellen konnten, sind derartige Substanzen zur Behandlung von
akutem Tinnitus besonders gut geeignet. U 0126, MEK1/2-Inhibitor, und PD 98058, ein
MEK1-Inhibitor können von Cell Signalling Technology, Inc., Beverly, MA, Vereinigte
Staaten von Amerika, bezogen werden. Dabei obliegt die Wahl der eingesetzten Konzentration
dem Fachmann und ist abhängig von der Ausprägung der Krankheit, dem übrigen Therapiekonzept
sowie verschiedenen vom zu behandelnden Patienten individuellen Faktoren. Vor diesem
Hintergrund wird die eingesetzte Konzentration für den jeweiligen Einzelfall vom Fachmann
unter Verwendung von Routinemaßnahmen festgelegt.
[0045] Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verwendung wird die
Substanz lokal am oder im Ohr.
[0048] Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine lokale Applikation der mit der die Blockade
oder Inhibition des BDNF-Rezeptors bewirkenden Substanz oder der mit der nachgeschalteten
BDNF-Signaltransduktionskaskade interagierenden Substanz besonders vorteilhaft ist,
da nämlich, wie die Erfinder in weiteren Experimenten feststellen konnten, bei akutem
Tinnitus die BDNF-Expression im auditorischen Cortex im Gegensatz zur Situation in
den cochleären Ganglien überraschenderweise reduziert ist. Eine systemische Applikation
von die BDNF-Signaltransduktionskaskade inhibierenden Substanzen würde deshalb im
Cortex zu einer noch weiteren Erniedrigung der BDNF-Expression führen und damit schädliche
Effekte auf den Organismus haben. Bei akutem Tinnitus wäre deshalb eine systemische
Gabe der Substanz, die die BDNF-Signaltransduktionskaskade inhibiert, kontraindikativ.
[0049] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Substanz zur therapeutischen
und/oder prophylaktischen Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus bei
einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus: MAP-Kinase-Inhibitor, insbesondere U 0126 oder PD 98058, Cam-Kinase-Inhibitor
und trkB-Antagonist.
[0050] Die Erfinder haben erstmals eine konkrete medizinische Anwendung der vorgenannten
Substanzen im Zusammenhang mit Phantomphänomenen, nämlich dem akuten Tinnitus erkannt
und vorgeschlagen.
[0051] Ein weiterer nicht beanspruchter Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Diagnose der
Phantomphänomene des akuten Tinnitus bei einem tierischen oder menschlichen Lebewesen,
das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer biologischen Probe des Lebewesens,
(b) Bestimmung des Niveaus der Expression von BDNF in der biologischen Probe, (c)
Vergleich des Niveaus aus Schritt (b) mit einem Referenzwert aus einem gesunden Lebewesen,
und (d) Korrelation eines über dem eines gesunden Lebewesens liegenden Niveaus mit
einer positiven Diagnose.
[0052] Es kann eine jegliche derartige biologische Probe verwendet werden, die jedoch vorzugsweise
aus dem Ohr stammt, wie eine Gewebeprobe, Zellen, bspw. cochleäre Ganglien oder Nervenzellen.
Bei der biologischen Probe kann es sich aber auch um eine systemische Blutprobe handeln;
Lang et al. (2005), Association of BNDF serum concentrations with central serotonergic
activity: Evidence from auditory signal processing, Neuropsychopharmacology 30 (6),
Seiten 1148-1153. Dabei ist darauf zu achten, dass es bei einer Gewebeprobenentnahme aus dem Ohr nicht
zur Schädigung des Gehörs kommt, wobei solch eine Vorsichtsmaßnahme dann nicht einzuhalten
ist, wenn es sich um einen Tinnitus handelt, der sich zentral zu einem nicht mehr
intakten Ohr ausbildet. Eine solche Probenentnahme zur Bestimmung des Niveaus der
Expression von BDNF kann dann auch gleichzeitig zur Messung der Funktionsfähigkeit
der Übertragung und Nutzung zentralerwärts gelegener Nerven genutzt werden, um z.B.
die Effizienz der Implantation eines Cochlea-Implantats zu optimieren.
[0053] Das nicht beanspruchte Verfahren wird in einem geeigneten biologischen System durchgeführt,
wobei übliche Puffer wie Tris-oder HEPES-Puffer Verwendung finden können. Die Bestimmung
des Expressionsniveaus in Schritt (b) erfolgt über übliche molekular- oder zellbiologische
Methoden, wie ELISA-Technik und Westernblot auf Proteinebene, oder Northernblot auf
mRNA-Ebene. Geeignete molekularbiologische Methoden sind bspw. beschrieben in
Sambrook, J. und Russel, D. W. (2001), Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden
Beschreibung.
[0054] Eine molekularbiologische Diagnose des akuten Tinnitus kann etabliert und bereitgestellt
werden.
[0055] Zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus bei einem menschlichen Lebewesen
können folgende Schrittedurchgeführt werden: (a) Bereitstellen eines Arzneimittels,
das eine die Blockade oder Inhibition des BDNF-Rezeptors bewirkende oder mit der BDNF-Signaltransduktionskaskade
interagierende Substanz sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. weitere
Hilfsstoffe und/oder Wirkstoffe aufweist, und (b) Applizieren, ggf. lokal, des Arzneimittels
dem Lebewesen, und ggf. (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b).
[0057] Als weitere Wirkstoffe kommen bspw. klassische Tinnitusmittel in Frage.
[0058] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden
Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind.
[0059] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
[0060] In den beiliegenden Figuren ist Folgendes dargestellt:
- Fig. 1:
- Die Operation und lokale Zufuhr von Salicylat verändert nicht signifikant die Hörschwellen;
- Fig. 2
- Akute systemische und lokale Applikation von Salicylat führt nach einer bestimmten
Zeit zu einer gesteigerten c-fos-Expression in der Cochlea;
- Fig. 3
- In situ-Hybridisierungsanalyse von c-fos und BDNF-Exon III und Exon IV-Splice-Varianten in
der Cochlea von adulten Ratten nach lokaler und systemischer Applikation von Salicylat;
- Fig. 4
- Eine RT-PCR-Analyse zeigt eine dosisabhängige differenzielle Veränderung der Expression
von c-fos und BDNF-Exon III- und Exon IV-Expression in der Cochlea nach systemischer
und lokaler Applikation von Salicylat;
- Fig. 5
- Die lokale Applikation von Salicylat reduziert die Expression von c-fos, BDNF Exon
III- und Exon IV in dem auditorischen Cortex;
- Fig. 6
- Die durch Salicylat bedingte Hochregulation der BDNF-Expression in cochleären Neuronen
wird durch den Typ-Ca++-Kanal-Antagonisten Nifedipin inhibiert; und
- Fig. 7
- Die durch Salicylat bedingte Hochregulation der BDNF-Expression in cochleären Neuronen
wird durch das Benzodiazepin Midazolam inhibiert.
Ausführungsbeispiel
MATERIAL UND METHODEN
Tiere
[0061] Für die Experimente wurden weibliche adulte Wistar-Ratten verwendet, die zwischen
280 und 300 Gramm wogen. Die Behandlung und der Umgang mit diesen Tieren erfolgte
in Übereinstimmung mit den Institutsrichtlinien der Universität Tübingen, Tierforschungsanstalt.
[0062] Die Ratten wurden gemäß dem Verfahren
von Guitton, M. J. et al. (2003), Salicylate induces tinnitus through activation of
cochlear NMDA receptors, J. Neurosci. 23, Seiten 3944 bis 3952, intraperitoneal anästhesiert, um ein sog. Gelfoam (Gelita Tampon; B. Braun Medical,
Melsungen, Deutschland) über das runde Fenster beider Ohren zu platzieren. Das Gelfoam
wurde wie angegeben mit Salicylat, das in artifizieller Perilymphlösung (70 mg/ml)
verdünnt wurde, oder mit dem entsprechenden Volumen von artifizieller Perilymphe alleine,
getränkt. Das Gelfoam wurde auf der Nische des runden Fensters platziert, wie beschrieben;
Guitton J. et al. (a.a.O.). Das Salicylat wurde so für 20 Stunden lokal appliziert.
Nach dieser Zeit wurden die Tiere getötet und die Cochlea und der auditorische Cortex
entfernt.
Gewebepräparation
[0063] Die Tiere wurden mit Kohlenstoffdioxid tiefanästhesiert und anschließend decapiert.
Die Cochleae wurden isoliert und wie zuvor beschrieben präpariert; vgl.
Knipper, M. et al. (2000), Thyroid hormone deficiency before the onset of hearing
causes irreversible damage to peripheral and central auditory systems, J. Neurophysiol.
83, Seiten 3101 bis 3112. Kurz, die Cochleae wurden durch Immersion in 2 % Paraformaldehyd, 125 mM Saccharose
in 100 mM phosphatgepufferter Saline (PBS), pH 7,4, für zwei Stunden fixiert, nach
der Fixierung für 45 Minuten in "Rapid bone decalcifier (#904687, Eurobio, Fisher-Scientific,
61130 Nidderau, Deutschland) decalcifiziert, anschließend gefolgt von einer Inkubation
über Nacht in 25 % Saccharose, 1 mM Proteaseinhibitor (Pefabloc, Roche) in Hanks-gepufferter
Saline. Nach der Übernachtinkubation wurden die Cochleae in O.C.T.-Verbindung (Miles
Laboratories, Elkhart, Ind., USA) eingebettet. Die Gewebe wurden dann bei 10 µm Dicke
für die
in situ-Hybridisierung kryogeschnitten, gelagert auf SuperFrost*/plus-Objektträger und vor
der Verwendung bei -20°C gelagert.
Ribosondensynthese und in situ-Hybridisierung
[0065] Genomische DNA aus Rattenlebergewebe wurde mittels des Easy-DNA-Kits von Invitrogen
gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Eine Polymerasekettenreaktion wurde durchgeführt,
um alle vier nicht codierenden 5'-Exons des BDNF-Gens zu amplifizieren.
[0066] Um die Exon-3-spezifische Sonde zu amplifizieren, wurde ein Sinn(Sense)-Primer (5'
acc cac ttt ccc att cac cg 3') und ein Gegensinn(Antisense)-Primer (5' cct ttt tca
gtc act act tg 3') jeweils entsprechend den Nucleotidpositionen 536 bis 555 und 957
bis 976 des genomischen Fragmentes B (
Timmusk, T. et al. (1995), Identification of brain-derived neurotrophic factor promoter
regions mediating tissue-specific, axotomy-, and neuronal activity-induced expression
in transgenic mice, J. Cell. Biol. 128, Seiten 185 bis 199, verwendet. Für die Exon-4-spezifische Sonde wurde ein Sinn-Primer (5' cca atc gaa
gct caa ccg aa 3') und ein Gegensinn-Primer (5' tca ggg tcc aca caa agc tc 3') entsprechend
den Nucleotidpositionen 1732 bis 1751 und 2059 bis 2078 des genomischen Fragmentes
B verwendet (Timmusk, T. et al., a.a.O.). Um die gemeinsame Ribosonde für das codierende
Exon-5 zu amplifizieren, wurde ein Sinn-Primer (5' gag gac cag aag gtt cg 3') und
ein Gegensinn-Primer (5' ttt atc tgc cgc tgt gac 3') entsprechend der Nucleotidpositionen
309 bis 325 und 534 bis 551 verwendet (Zugangsnummer M61175). Um die c-fos-Sonde zu
synthetisieren, wurde ein Sinn-Primer (5' gac ttt tgc gca gat ctg tc 3') und ein Gegensinn-Primer
(5' ctg ctc tac ttt gcc cct tc 3') entsprechend den jeweiligen Nucleotidpositionen
276 bis 295 und 508 bis 527 der cDNA verwendet (Zugriffsnummer X06769).
[0067] In der PCR-Reaktion wurde die genomische DNA zuerst für vier Minuten bei 94°C denaturiert,
gefolgt von 30 Zyklen von einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 55°C und einer Minute
bei 72°C. Die Verlängerungsreaktion wurde bei 72°C für zehn Minuten durchgeführt.
Die amplifizierten Fragmente wurden in einem 1%igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetrennt.
Fragmente, die den erwarteten Längen der genspezifischen Sonden entsprechen, wurden
unter Verwendung des QIAquick-Gel-Extraction-Kits von Qiagen extrahiert. Die erwarteten
Längen der amplifizierten Fragmente waren 351 Nucleotide (Exon-III), 347 Nucleotide
(Exon-IV), 243 Nucleotide (Exon-V) und 252 Nucleotide (c-fos). Diese Fragmente wurden
in einen pCR II Topo-Vektor (Invitrogen) kloniert und ihre Nucleotidsequenzen wurden
mittels eines automatischen Sequenzierers verifiziert.
Reverse Transkription, semiquantitative PCR
[0069] Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Total-RNeasy-Kits von Qiagen sowohl aus der
Cochlea als auch aus Hirngewebe isoliert und mit DNase (Ambion) behandelt, um DNA-Kontaminanten
zu entfernen. Die RNA wurde anschließend gereinigt und die Konzentrationen mittels
spektrometrischer Messungen bestimmt. Die reverse Transkription der Hirngewebe wurde
in einem 20 µl Reaktionsvolumen unter Verwendung von 1 µg Gesamt-RNA als Template
und SUPERSCRIPT II Rnase H
--reverse Transkriptase gemäß dem Protokoll von Invitrogen durchgeführt. Wegen der
begrenzten Menge von RNA in den cochleären Geweben wurde unter Verwendung von 50 ng
Gesamt-RNA als Template Qiagen Senscript reverse Transkriptase verwendet, wie im Protokoll
von Qiagen beschrieben. Für die PCR wurde die Anzahl der Zyklen und die Anlagerungstemperatur
optimiert, so dass die Signale, die für BDNF, c-fos und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH) erhalten wurden, nicht gesättigt waren.
[0070] Die PCR-Primersequenzen für arc waren 5' caa tgt gat cct gca gat tg 3' und 5' tgt
tgg cat agg ggc taa ca 3'; für BDNF waren diese 5' ttc gac ccc gcc cgc cgt gg3' und
5' ccc ctt tta atg gtc agt gt 3'; für c-fos waren diese 5' gac ttt tgc gca gat ctg
tc 3' und 5' att cct ttc cct tcg gat tc 3'; für GAPDH waren diese 5' tct act gc gtc
ttc ac acc a 3' und 5' agg aga caa cct ggt cct cag t 3'. Die PCR wurde in einem 25
µl Endreaktionsvolumen durchgeführt, wobei gleichzeitig beide Primer für GAPDH und
die aktivitätabhängigen Gene verwendet wurden. In dieser Duplex-PCR-Reaktion stellt
ein Haushaltsgen in der gleichen PCR-Reaktion eine interne Kontrolle dar, so dass
die Intensität des aktivitätsabhängigen Gens unzweideutig mit der Kontrolle und den
behandelten Proben verglichen werden kann. PCR-ready-to-go-Beads von Amershan Pharmacia
wurden verwendet, um eine Standardisierung der PCR-Bedingungen zu gewährleisten und
Kontaminationen beim Pipettieren zu reduzieren. Letztlich wurden die PCR-Produkte
in einem 2%igen Agarosegel analysiert, das mittels einer Ethidium-Bromid-Färbung und
Densitometrischer Analyse unter Verwendung eines Alpha-Imagers 2200 von Biometra visualisiert
wurde. Die Intensität des amplifizierten aktivitätsabhängigen Gens wurde für jede
Reaktion auf den Level des coamplifizierten GAPDH normalisiert. Die Amplifizierungsbedingungen
für arc, BDNF, c-fos und GAPDH waren für die anfängliche Denaturierungsphase von 94°C
für drei Minuten, 30 Zyklen von jeweils einer Minute Denaturierung (94°C), einer Minute
Anlagerung (54°C), 1,5 Minuten Verlängerung (72°C) und einer abschließenden Verlängerungsphase
von zehn Minuten bei 72°C. Die PCR-Fragmente wurden kloniert und sequenziert, wie
zuvor beschrieben.
ABR-Screening (ABR = "Auditory brainstem response")
ERGEBNISSE
[0072] Wie oben beschrieben, wurde weiblichen Ratten etwa gleichen Gewichts Salicylat in
die Nische des runden Fensters lokal appliziert. Um jegliche posttraumatischen Auswirkungen
auf die Expression der aktivitätsabhängigen Gene in den cochleären Neuronen auszuschließen,
wurden ausschließlich Individuen verwendet, die keine Veränderung des Hörvermögens
nach Gelfoam-Applizierung zeigten. Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden keine signifikanten
Veränderungen in dem Klick-abhängigen ABR-Screening vor oder 20 Stunden nach der Operation
festgestellt.
[0073] Die Schwellen im ABR-Screening waren vor und nach der Operation (OP) weitgehend identisch
und es zeigten sich weder bei der Applikation von Salicylat (n = 13; 5 µl; 70mg/kg;
Salicylat) noch von artifizieller Perilymphe (n = 9; 5 µl; Kontrolle) wesentliche
Unterschiede; vgl. Fig. 1 (A). Ein frequenzspezifisches ABR-Screening vor und 20 Stunden
nach lokaler Applikation von Salicylat (n = 5; 5 µl; 70 mg/kg; Salicylat) oder artifizieller
Perilymphe (n = 6; 5 µl, Kont) in die Nische des runden Fensters zeigt, dass es zu
keinem Hörverlust kommt; vgl. Fig. 1(B).
[0074] In einem ersten Ansatz zum Herausfinden des geeigneten Zeitpunktes, zu dem entweder
lokal oder systemisch appliziertes Salicylat die Cochlea erreicht und die neuronale
Erregbarkeit modifiziert, wurde im Cochleagewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach
der Salicylatapplizierung über RT-PCR-Analyse die c-fos-Expression untersucht. Dabei
wurde festgestellt, dass die Gelfoam-Applikation von Salicylat (5 µl, 70 mg/ml) die
c-fos-Expression nicht vor etwa 20 Stunden beeinflusst, möglicherweise auf Grund einer
verlangsamten Sekretion der Flüssigkeit aus dem Gelfoam. Eine signifikante Hochregulation
von c-fos wurde 20 Stunden, nicht jedoch drei Stunden nach Applizierung festgestellt
(Fig. 2A). Hierzu im Gegensatz wurde durch systemische Gabe von Salicylat (350 mg/kg
Klörpergewicht) über intraperitoneale Injektion bereits nach drei Stunden eine Hochregulation
von c-fos beobachtet ohne signifikante Veränderungen bei längeren Zeiten von bis zu
20 Stunden. Die Expression von GAPDH ist sowohl im Kontrollansatz als auch salicylatbehandelten
Ansatz gleich, wodurch demonstriert wird, dass in diesen Experimenten gleiche Mengen
von RNA (50 ng) verwendet wurden (Fig. 2B). Um entsprechende akute Wirkungen zu vergleichen,
wurden im Folgenden die Effekte von lokal appliziertem Salicylat 20 Stunden und systemisch
injiziertem Salicylat drei Stunden nach Applikation untersucht.
[0075] In einem weiteren Schritt wurde der Effekt von lokal und systemisch appliziertem
Salicylat auf die Expression bestimmter BNDF-Splice-Varianten in den cochleären Spiralganglien
(SG) der Ratte mittels
in situ-Hybridisierung untersucht. Zum Vergleich wurde die c-fos-Expression beobachtet. Wie
exemplarisch in Fig. 3 für drei individuelle Experimente in Duplikaten gezeigt, waren
die Hybridisierungssignale für c-fos (Fig. 3A), BDNF-Exon-III (Fig. 3B) und BDNF-Exon
IV (Fig. 3C) in der mittleren basalen cochleären Windung im Vergleich zu der Applizierung
des gleichen Volumens von artifizieller Perilymphe (Fig. 3, Kontrolle) nach sowohl
lokaler (links, 5 µl; 70 mg/ml; lokale Applikation) als auch systemischer (rechts,
350 mg/kg Körpergewicht; systemische Applikation) Gabe von Salicylat signifikant erhöht
(dunkle Färbung). Unter Verwendung von Sense-Proben wurden keine Hybridisierungssignale
beobachtet (Daten nicht gezeigt). Entlang der tonotopischen Achse zeigte die BDNF-Expression
eine charakteristische Abnahme von den basalen/mittelbasalen hin zu den mehr apikalen
cochleären Windungen (Schimmang, T. et al. (2003) a.a.O.) und der Salicylat induzierte
Anstieg in dem Expressionsmuster beeinflusste primär die mehr basal gelegenen cochleären
Windungen.
[0076] Um mögliche Unterschiede in den Aktivierungsmustern bestimmter BDNF-Transkripte auf
verschiedene Anregungsstufen zu untersuchen, wurde der Effekt von verschiedenen Dosierungen
von Salicylat analysiert, welche die neuronale Erregbarkeit unterschiedlich beeinflussen
könnten; vgl.
Kumagai (1992), Effect of intravenous injection of aspirin on the cochlea, Hokkaido
Igaku Tasshi 67 (2), Seiten 216 bis 233;
Stypulkowski (1990), Mechanisms of salicylate ototoxicity, Hear Res. 46 (1-2), Seiten
113 vis 145. Dazu wurde die Auswirkung von lokal applizierten Gelfoams, getränkt mit verschiedenen
Volumina (5, 10, 20 µl) von 70 mg/ml Salicylat und parallel die Auswirkung von verschiedenen
Konzentrationen systemisch applizierten Salicylats (250 mg/kg, 350 mg/kg, 500 mg/kg
Körpergewicht) untersucht. Unter Verwendung von semiquantitativer RT-PCR-Analyse der
Gesamt-RNAs wurden in dem cochleären Gewebe c-fos-, BDNF-Exon-III- und BDNF-Exon-IV-Transkripte
untersucht (Fig. 4).
[0077] Interessanterweise wurde für beide Applizierungsmethoden ein dosisabhängiger Effekt
von Salicylat festgestellt, der im Vergleich zu GADPH zu leichten Veränderungen der
Hochregulation der c-fos-Expression führte. Die größten Auswirkungen wurden bei einer
Applizierung von 5 µl oder 10 µl Salicylat am runden Fenster bzw. bei einer Injektion
von 250 mg/kg oder 350 mg/kg Salicylat festgestellt, wohingegen bei höheren Konzentrationen
in beiden Applizierungsmethoden weniger deutliche Auswirkungen festgestellt wurden
(Fig. 4A).
[0078] Unter Verwendung des gleichen Templates, um sowohl BDNF-Exon-III oder -IV zu amplifizieren,
zeigte sich ein deutlicher Unterschied im Aktivierungsmuster der verschiedenen aktivitätsabhängigen
Gene.
[0079] Unabhängig von der Applizierungsmethode wurde das BDNF-Exon-III mit etwas Verzögerung
nach dem BDNF-Exon-IV aktiviert, was bei höheren Konzentrationen von Salicylat in
einem Peak der Expression von BDNF-Exon-III (Fig. 4B) resultiert, während sowohl c-fos
(Fig. 4A) als auch BDNF-Exon-IV (Fig. 4C) bereits auf geringere Dosen von Salicylat
reagieren. Vergleichbare Ergebnisse wurden in drei Experimenten in Duplikaten erhalten,
welche die densitometrische Analyse, die in Fig. 4B gezeigt ist, bestätigen, wonach
es zu einer signifikanten Erhöhung der Expression des BDNF-Exons-IV (49 ± 12 %, n
= 8, p < 0,05) und von c-fos (69 ± 11 %, n = 8, p < 0,05) kommt.
[0080] Im auditorischen Cortex wurden die BDNF-Exon-III und -IV-Splice-varianten, das gemeinsame
BDNF-Exon-V und c-fos-Transkripte amplifiziert (Daten nicht gezeigt). Es wurden auditorische
Cortices untersucht, die aus Tieren erhalten wurden, in denen die Cochlea hinsichtlich
der dosisabhängigen Wirkung des Salicylates untersucht wurden, die mRNA wurde isoliert
und eine RT-PCR wurde durchgeführt, wie unter Material und Methoden beschrieben.
[0081] Während lokal oder systemisch appliziertes Salicylat zur Erhöhung der Expression
der untersuchten aktivitätsabhängigen Gene in der Cochlea führt (Fig. 4), wurde in
drei unabhängigen Experimenten in Duplikaten festgestellt, dass beide Methoden im
auditorischen Cortex zu entgegengesetzten Effekten auf die aktivitätsabhängigen Gene
führen. Im Gegensatz zur Auswirkung auf die cochleären Neuronen führte die lokale
Applikation von sämtlichen Dosierungen von Salicylat zur Reduktion der Expression
von c-fos (Fig. 5A, links), von BDNF-Exon-III (Fig. 5B, links) und BDNF-Exon-IV (Fig.
5C, links).
[0082] Während in der Cochlea für verschiedene Dosierungen und verschiedene BDNF-Transkripte
ein unterschiedliches Aktivierungsmuster festgestellt wurde, war der abnehmende Effekt
bei höheren Konzentrationen im auditorischen Cortex nicht so eindeutig (Fig. 5A-C).
Mittels densitometrischer Analyse wurde bestätigt, dass es zu einer signifikanten
Abnahme der Expression von BNDF-Exon-IV (49 ± 12 %, n = 8, p < 0,05) und c-fos (69
± 11 %, n = 8, p < 0,05) kommt.
[0083] In einem weiteren Experiment haben die Erfinder untersucht, ob das erstmals bei akutem
Tinnitus festgestellte Phänomen der erhöhten BDNF-Expression unter Verwendung von
Isradipin, einem L-Typ-Ca
++-Kanal-Antagonisten, der die BDNF-Rezeptor vorgeschaltete Signaltransduktionskaskade
beeinflusst, aufgehoben werden kann.
[0084] Hierzu wurden 22 Stunden vor der Gewebeentnahme 10 µl 0,9%ige Kochsalzlösung (Fig.
6A, Saline) und 10 µl einer 10 mM Isradipinlösung (Fig. 6B, Isradipine) lokal in die
Nische des runden Fensters, d.h. vor die Rundfenstermembran, appliziert. 3 Stunden
vor der Gewebeentnahme an der Cochlea wurde identisches Volumen Kochsalzlösung (C)
bzw. 350 mg/kg Körpergewicht Salicylat (Scy) systemisch injiziert. Nach der Entnahme
des Gewebes wurde die Expression von BDNF in beiden Ansätzen analysiert.
[0085] In Fig. 6 ist die Expression des BDNF Exon IV unter vorstehend genannten Bedingungen
dargestellt. Wie erwartet bewirkt das Salicylat eine Hochregulation von BDNF in den
cochleäre Neuronen (Fig. 6A, rechte Spur), während im identisch durchgeführten Ansatz
in der Tiergruppe, in der Isradipin anstelle von Kochsalz appliziert wurde, die Hochregulation
von BDNF inhibiert wird.
[0086] Das vorstehend beschriebene und in Fig. 6 dargestellte Experiment wurde unter identischen
Bedingungen auch für einen weiteren L-Typ-Ca
++-Kanal-Antagonisten, Nifedipin, durchgeführt. Dabei wurde ebenfalls ein inhibitorischer
Effekt auf die nach der Induktion von akutem Tinnitus erhöhte BDNF-Expression in den
cochleären Neuronen nachgewiesen, obgleich weniger stark, als mit Isradipin (Daten
nicht gezeigt).
[0087] Die Erfinder haben ferner untersucht, ob die mit akutem Tinnitus einhergehende erhöhte
BDNF-Expression durch die Verabreichung von GABA-Rezeptor-Agonisten, die mit der vorgeschalteten
Signaltransduktionskaskade interagieren, wie Benzodiazepinen, inhibiert werden kann.
Wie bereits zuvor beschrieben, wurde weiblichen Ratten steigende Mengen von Salicylat
(Scy) in die Nische des runden Fensters lokal appliziert. Dabei zeigte sich, wie auf
Grund der zuvor diskutierten Experimente erwartet, eine Zunahme der Expression des
BDNF-Exon-IV-Transkriptes in den cochleären Neuronen, und eine Abnahme der Expression
des aktivitätsabhängigen Cytoskelettproteins Arc im auditorischen Cortex. Das Ergebnis
einer repräsentativen RT-PCR ist in Fig. 7A für n = 3 mit vergleichbarem Ergebnis
gezeigt.
[0088] In einem weiteren experimentellen Ansatz wurde den Ratten 350 mg/kg Salicylat systemisch
appliziert. Wie in Fig. 7A für die lokale Rundfensterapplikation gezeigt, führt auch
die systemische Gabe von Salicylat zu einer erhöhten Expression von BDNF-Exon-IV (Fig.
7B, oben) und erwartungsgemäß von c-fos (Fig. 7C, oben) in cochleären Neuronen, während
im primären auditorischen Cortex eine Abnahme der Expression von Arc (Fig. 7B, unten)
und BDNF-Exon-IV (nicht gezeigt) und gelegentlich von c-fos (Fig. 7C, unten) nachweisbar
ist.
[0089] Zweieinhalb Stunden nach der Induktion von akutem Tinnitus über die Injektion von
350 mg/kg Salicylat wurde den Tieren systemisch Midazolam (Dormicum, Roche, Grenzach-Wyhlen,
Deutschland) (0,5 mg/kg Körpergewicht) verabreicht und die Gen-Expression nach Organentnahme
mit Hilfe der RT-PCR untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Midazolam (MDZ) zu
einer signifikanten Reduktion des Effektes von Salicylat auf die Expression von BDNF-Exon-IV
(n = 7) in den cochleären Neuronen und von Arc im auditorischen Cortex führt (Fig.
7B, rechter Balken, n = 12), die Expression von c-fos jedoch unbeeinflussbar bleibt
(Fig. 7C, rechter Balken, n = 7 bis 12). Die statistische Auswertung wurde mit dem
"Student's T-test" durchgeführt; * = p < 0,05.
[0090] In einem weiteren dem vorstehenden entsprechenden Experiment wurde ein GABA-Rezeptor-Agonist
unter ansonsten identischen Bedingungen nicht systemisch sondern lokal in die Nische
des Runden Fensters appliziert. Dabei stellte sich heraus, dass die mit akutem Tinnitus
verbundene erhöhte BDNF-Exon-IV-Expression in den cochleären Neuronen noch stärker
inhibiert wurde und die Auswirkungen auf die Expression von BDNF-Exon-IV im auditiven
Cortex deutlich reduziert waren.
[0091] Die lokale Applikation eines BDNF-Antagonisten hebt folglich die bei akutem Tinnitus
beobachtete pathologische Fehlregulation der BDNF-Expression auf. Die Erfinder konnten
deshalb nachweisen, dass es sich bei erfindungsgemäßen BDNF-Antagonisten um Substanzen
handelt, die für die Behandlung von akutem Tinnitus grundsätzlich geeignet sind.
[0092] Die Erfinder konnten erstmals zeigen, dass mittels Substanzen, die die Blockade oder
Inhibition des BDNF-Rezetors bewirken bzw. mit der nachgeschalteten BDNF-Signaltransduktionskaskade
interagieren bzw. diese inhibieren, wirksam akuter Tinnitus behandelt werden kann.