(19)
(11) EP 2 647 695 A1

(12) DEMANDE DE BREVET EUROPEEN

(43) Date de publication:
09.10.2013  Bulletin  2013/41

(21) Numéro de dépôt: 13366002.7

(22) Date de dépôt:  02.04.2013
(51) Int. Cl.: 
C12N 1/20(2006.01)
A01N 63/02(2006.01)
 C05F 11/08(2006.01)
C05G 3/00(2006.01)
(84) Etats contractants désignés:
AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
Etats d'extension désignés:
BA ME

(30) Priorité: 03.04.2012 FR 1200992

(71) Demandeur: Polyor SARL
54000 Nancy (FR)

(72) Inventeur:
  • Claude, Pierre-Philippe
    54000 Nancy (FR)

   


(54) Mode de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes moyennement halophiles


(57) Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes caractérisé en ce que les bouillies sont réalisées en deux temps ; (i) création dans un premier temps de pré - bouillies plus concentrées en sels fertilisants que les susdites bouillies par un facteur de concentration permettant d'atteindre une milliosmolarité (mOSM) critique responsable de l'induction statique de l'osmotolérance des susdites populations bactériennes a priori osmotolérantes, et (ii) abolition dans une deuxième temps et après une certaine période d'induction statique de ce facteur de concentration par dilution des pré - bouillies jusqu'à un volume correspondant au volume préconisé pour de telles bouillies pulvérisables contenant des populations bactériennes osmotolérantes.




Description

DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION



[0001] Microbiologie appliquée à l'agronomie. L'homme de métier, sans nécessairement être microbiologiste, sera attentif à la conservation et la survie d'inocula microbiens destinés à la biofertilisation et/ou au bio-contrôle des cultures viticoles, arboricoles et des grandes cultures. Il est-aussi question de formulation et le conditionnement de préparations bactériennes non sporulantes et/ou particulièrement sujettes à dégradation dans le temps.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLÉMATIQUE


Formulation et application d'inocula bactériens par pulvérisation liquide



[0002] Les BFCP (bactéries favorisant la croissance des plantes) colonisent, outre les racines de certaines cultures, les résidus de cultures, les engrais organo-minéraux et/ou les biomasses racinaires résiduelles. Les modes d'action comprennent : (i) la production de sidérophores extracellulaires, (ii) l'antibiose contre des bactéries et des champignons pathogènes, (iii) la production de phytohormones (eg. auxines), et iv) la solubilisation des phosphates organiques et inorganiques. Or, les BFCP appartiennent à plusieurs genres, y compris Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Cellulomonas, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, (Brady)rhizobium, Xanthomonas et Stenotrophomonas.

[0003] L'application de telles BFCP par pulvérisation liquides, au feuillage ou encore au résidus de culture pailleux au sol, est recherchée en agronomie. Elle implique généralement la re-suspension d'un inoculum, solide ou liquide, en milieux aqueux et ainsi la formation d'une "bouillie" directement dans le bac (in baco) du pulvérisateur. Lorsque appliquées aux feuillages, de telles préparations auront à affronter des stresses osmotiques du fait de la coprésence de sels fertilisants et/ou de haut taux d'évapotranspiration. En effet, l'évaporation de la solution aqueuse ainsi apportée aux feuillages concentrerant les sels, de tels stresses osmotiques peuvent ainsi détruire ces populations bactériennes, du moins si elles ne sont pas suffisamment osmotolérantes.

[0004] De plus, dans la phyllosphère (feuillage), la disponibilité de sucres métabolisables par des bactéries, notamment diazotrophes, est faible, de l'ordre des kg par hectare (Murty et al. 1984, Johan et al. 2001). Pour complémenter en substrats glucidiques une activité bactérienne diazotrophe il faudrait apporter plusieurs centaines de kg de sucres pour réduire au plus une vingtaine de kg-N par hectare. Il serait plus opportun d'apporter à un inoculum bactérien foliaire un agent azoto-nutritionnel (ANN) - tel qu'un sel d'acide glutamique favorisant l'entrée de l'azote provenant de la dissolution de sels fertilisants dans le cycle de synthèse des protéines (EP10366001.5). De telles BFCP devront elles aussi affronter des stresses osmotiques bactéricides et/ou bacteriostatiques.

Osmotolérance induite et halophilie constitutive



[0005] Des osmotolérances à l'égard de ~500 mOSM sont généralement requises pour les BFCP destinées aux applications foliaires (Bonaterrea et al. 2005, 2007) ; l'osmolarité de la solution du sol est elle ~50 mOSM (Miller et Wood 1996). La richesse et la diversité bactérienne de la phyllosphère étant limitée (supra), la plupart de BFCP candidates viennent donc des sols, et ne seront donc pas a priori très halophiles, bien que potentiellement osmotolérantes une fois induites.

[0006] Nous devons donc faire ici une distinction entre halophilie constitutive et osmotolérance induite. Pour faire simple disons que les bactéries halophiles le sont, tandis que les bactéries osmotolérantes le deviennent. Puisque bon nombre de BFCP ne sont pas foncièrement halophiles (eg. Pseudomonas, Azotobacter, etc.), c'est l'induction de leurs osmotolérances qui sera ici la plus utile. En effet, les enzymes de bactéries halophiles non seulement résistent à mais exigent de fortes osmolarités (Sleator et Hill 2000, Goldman et al. 1990). Elles abritent de nombreuses charges négatives à leurs surfaces dont la répulsion mutuelle entraîne la dénaturation de l'enzyme à des osmolarités environnement plus habituelles de l'ordre de 500 mM ; l'accumulation cytolytique extraordinaire de cations peut ainsi, en neutralisant ces charges répulsives, préserver le fonctionnement du cytosol. L'halophilie constitutive de certaines BFCP exige donc des concentrations cationiques au delà de celles normalement mesurée in situ dans les sols, voire même la phyllosphère. Mieux faut donc parier sur l'osmotolérance induite de BFCP que moyennement halophiles.

[0007] L'osmotolérance bactérienne est connue (Tableau 1). Il existe deux type de valeurs osmolaires ; (i) celles choisies a priori, et (ii) celles établies a posteriori sur la base d'un indice de survie (eg. IC50) ou de croissance (eg. MIC ; Purvis et al. 2005). Ces deux types de valeurs concordent, une valeur moyenne représentative capable d'induire l'accumulation d'osmolytes compatibles étant de ~500 mOSM. A noter que cette mOSM est 10 à 12 fois plus élevée que celle dans la solution du sol, soit d'environ 50 mOSM (Miller et Wood 1996).. Ces seuils critiques ~500 mOSM ne sont pas nécessairement bactéricides en soi, mais simplement capable d'induire une suraccumulation - par synthèse de novo et/ou prélèvement extracellulaire, d'osmolytes compatibles. De plus, les délais d'induction de la production d'osmolytes compatibles sont courts, de l'ordre de quelques à plusieurs heures (Tableau 2).
Tableau 1 : Milli-osmolarité (mOSM ; mmol / L) utilisées par divers expérimentateurs pour induire activement et/ou constater l'osmotolérance de diverses bactéries et/ou BFCP.
milli-osmolarité (mOSM) soluté microorganism commentaires référence
324 NaCl Synechocystes induction expérimental Hagemann et Erdmann 1994
648 NaCl Synechocystes induction expérimental Hagemann et Erdmann 1994
1296 Sucrose Synechocystes induction expérimental Hagemann et Erdmann 1994
512 NaCl Synechocystes induction expérimental Klähn et al. 2010
450 NaCl Synechocystes induction expérimental Ferjanni et al.2003
385 NaCl Stenotrophomonas rhizophilia induction expérimental Hagemann et al. 2008
512 NaCl Stenotrophomonas rhizophilia induction expérimental Wolf et al. 2002
500 NaCl Azotobacter induction expérimental Madkour et al. 1990
500 NaCl Azospirillum induction expérimental Madkour et al 1990
128 NaCl Pseudomonas syringae induction expérimental Kurz et al. 2010
256 NaCl Pseudomonas syringae induction expérimental Kurz et al. 2010
385 NaCl Pseudomonas syringae induction expérimental Kurz et al. 2010
500 NaCl Klebsiella induction expérimental Madkour et al. 1990
500 NaCl Erwina chrysanthemi induction expérimental Gouesbet et al. 1996
500 NaCl Erwina chrysanthemi induction expérimental Goude et al. 2004
205 KCl E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
291 KH2PO4 E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
182 NaCl E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
325 Arabinose E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
314 Glucose E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
324 Mannose E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
141 Xylose E. coli constaté selon IC50 Purvis et al. 2005
         
469 KCI E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
496 KH2PO4 E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
463 NaCl E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
386 Arabinose E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
488 Glucose E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
469 Mannose E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
164 Xylose E. coli constaté selon MIC Purvis et al. 2005
         
430 na na MOYENNE na
~ 50 sels divers microflore du sol condition in pedo Miller et Wood 1996
TABLEAU 2 : Temps (délais) d'induction de la production d'osmolytes compatibles chez diverses bactéries
temps d'incubation délais d'induction milli-osmolarité (mOSM) soluté osmolyte prédominant microorganism référence
120 minutes 4 à 5 minutes 324 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Synechocystes Hagemann et Erdmann 1994
120 minutes 4 à 5 minutes 648 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Synechocystes Hagemann et Erdmann 1994
120 minutes 4 à 5 minutes 1296 Sucrose glucosyl-glycérol (GG) Synechocystes Hagemann et Erdmann 1994
12 heures 1 heure 512 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Synechocystes Klähn et al. 2010
72 heures 10 heures 450 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Synechocystes Ferjanni et al. 2003
             
32 heures 4 heures 385 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Stenotrophomonas rhizophilia Hagemann et al. 2008
selon API ? selon API ? 512 NaCl glucosyl-glycérol (GG) Stenotrophomonas rhizophilia Wolf et al. 2002
             
18 heures (18 heures ?) 500 NaCl tréhalose (TRE) Azotobacter Madkour et al. 1990
18 heures (18 heures ?) 500 NaCl proline (PRO), glutamate (GLU) Klebsiella Madkour et al. 1990
30 heures (30 heures ?) 500 NaCl proline (PRO), glutamate (GLU) Azospirillum Madkour et al. 1990
             
72 heures (72 heures ?) 128 NaCl NAGGN Pseudomonas syringae Kurz et al. 2010
72 heures (72 heures ?) 256 NaCl NAGGN Pseudomonas syringae Kurz et al. 2010
72 heures (72 heures ?) 385 NaCl NAGGN Pseudomonas syringae Kurz et al. 2010
             
15 heures 5 heures 500 NaCl divers (PRO, bétaine, ectoine, etc.) Erwina chrysanthemi Gouesbet et al. 1996
28 heures 1 à 25 heures 500 NaCl glucosyl-glycérate (GGate) Erwina chrysanthemi Goude et al. 2004
             
30 heures 5-10 heures 205 KCI tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 291 KH2PO4 tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 182 NaCl tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 325 Arabinose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 314 Glucose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 324 Mannose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 141 Xylose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
             
30 heures 5-10 heures 469 KCI tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 496 KH2PO4 tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 463 NaCl tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 386 Arabinose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 488 Glucose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 469 Mannose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005
30 heures 5-10 heures 164 Xylose tréhalose (TRE) E. coli Purvis et al. 2005


[0008] Or, ces accumulations d'osmolytes compatibles s'accomplissent toujours en pleine croissance des populations bactériennes, voire le plus souvent en fin de phase de croissance exponentielle ; on parle ici d'induction dynamique de l'osmotolérance. Il ne s'agit donc pas d'acclimatation, mais bien de conditionnement métabolique. L'osmotolérance induite demeure donc aux yeux de l'homme du métier un phénomène essentiellement lié à la croissance en milieux de culture.

[0009] Pourtant, l'induction statique de l'osmotolérance existe et peut contribuer à rendre plus résistantes les biomasses bactériennes pulvérisables. En effet, les travaux de Cayley et al. (1991, 2000) indiquent qu'un phénomène d'encombrement moléculaire (molecular crowding ; Ellis 2001, Spitzer 2011) dans les cytosol de bactéries osmo-stressées résulte d'un volume cellulaire (Vc uL / mg de protéine) plus petit ; les interactions protéines:ADN sont donc favorisées et contrefont d'éventuels effets néfastes liés à une surconcentration cationique. Cela dit, l'encombrement moléculaire à hautes pressions osmotiques environnantes n'est pas explicitement valorisé en agronomie, mais ne sert qu'à expliquer le métabolisme soutenue de certaines bactéries malgré de telles pressions osmotiques environnantes (Ellis 2001, Zimmermann et Trach 1991, Spitzer 2011).

DIVULGATION DE L'INVENTION


Problème technique aperçu



[0010] La phyllosphère - du fait d'une évapotranspiration importante favorisant l'accumulation de sels résiduels, est un environnement plutôt osmogène ; de tels stress osmotiques sont généralement suffisants pour nuire au ou arrêter le fonctionnement desdites BFCP, y comprises celles provenant des sols. Ces stresses osmotiques sont d'autant plus nuisibles si un sel fertilisant est apporté conjointement au feuillage.

[0011] Or, en réponse à ces stresses osmotiques il eut été possible en principe de simplement apporter aux feuillages des bactéries expressément et foncièrement osmotolérantes, voire halophiles. Or, des bactéries halophiles, en raison de leurs adaptation à des environnement très osmogènes, nécessitent des potentiels hydriques et des pression osmotique environnant peu compatibles avec le fonctionnement habituel de BFCP, voire des phyllosphères qu'elles doivent habiter. Les populations bactériennes osmotolérantes, et donc ici que moyennement halophiles, doivent elles être induites à l'être lors de leurs croissance. De plus, cette osmotolérance une fois induite n'est pas nécessairement constitutive, et un certain délai une fois le stress osmotique in folio (i.e. sur/dans le feuillage) perçue par les bactéries. Or entre temps, ledit stress osmotique, particulièrement important lors de l'évaporation de la solution aqueuse peut lui s'avérer franchement bactéricide. Il faut donc recourir à une induction post-croissance afin de maximiser, ou même assurer in folio la survie desdites BFCP en présences de sels fertilisants NP.

[0012] Cela dit, les BFCP ainsi les plus osmotolérantes ont aussi des volumes cellulaires (Vc ; uL/mg de protéine bactérienne) réduits en raison d'un certain encombrement moléculaire. Or, ces bactéries, en raison de ces Vc comprimés sont ainsi d'autant plus sujettes à des stresses hypo - osmotiques, notamment si elles doivent être immergées in baco dans des bouillies pulvérisables d'osmolarités quelconques.

[0013] L'osmotolérance acquise par induction dynamique via l'imposition d'une osmolarité quelconque lors de la croissance des bactéries (osmolarité de croissance ; OSMc) devrait dicter l'osmolarité de plasmolyse (OSMp) en dessous de laquelle lesdites bactéries exploseront en raison d'une trop forte pression intracellulaire (πi). C'est cet ajustement OSMc ≈ OSMp qui n'est pas à ce jour explicitement pris en compte par l'homme du métier car il implique le plus souvent la formation d'une pré - bouillie, in baco, plus concentrée a priori perçue comme doublement préjudiciable à la survie desdites bactéries.

Solution technique proposée



[0014] La solution technique consiste à ajuster, précisément, l'osmolarité de la bouillie, in baco, en fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc) à la quelle les bactéries ont été produites. Cela implique la formation, transitoire sur une période, par exemple, de 8 à 12 heures, d'une pré - bouillie le plus souvent plus concentrée que la bouillie pulvérisable ; il fallut donc prévoir et jauger la dilution de cette pré - bouillie "sur - concentrée", en sorte, afin de respecter une OSMp calculée qu'il faut donc explicitement respecter. La solution technique proposée consiste donc à placer des BFCP, avantageusement chitinolytiques et/ou fongistatiques, au sein de pré - bouillies dont l'osmolarité préétablie aux environs d'un certain seuil critique, ici et à titre d'exemple le plus avantageux ~500 mOSM, induira une osmotolérance acquise lors de la croissance de ces populations bactériennes.

[0015] Cette solution technique implique la mise en contacte directe au sein de ladite pré - bouillie desdites BFCP et de sels fertilisants, mise en contacte sels/bactéries pourtant contraire aux habitudes de l'homme de métiers, d'autant plus que ces pré - bouilles sont expressément sur - concentrées, ou plus exactement sous - diluées (infra). Le coeur de l'invention est donc une certaine « pré - bouillie » in baco concentrant transitoirement les sels fertilisants normalement présents dans la bouillie pulvérisable finale par un certain facteur de concentration selon le poids moléculaire des principaux constituants, avantageusement des sels azotée et/ou de agents azoto-nutritionnels, la concentration de ces constituants, la dose-hectare, ainsi que le volume pulvérisable finalement préconisé. Or, ce volume final de la bouille sera lui aussi précisé en fonction le l'osmolarité de croissance (OSMc) desdites populations bactériennes.

[0016] Concrètement, il s'agit d'un procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes caractérisé en ce que les bouillies sont réalisées en deux temps ; (i) création dans un premier temps de pré - bouillies plus concentrées en sels fertilisants que les susdites bouillies par un facteur de concentration permettant d'atteindre une milliosmolarité (mOSM) critique responsable de l'induction statique de l'osmotolérance des susdites populations bactériennes a priori osmotolérantes, et (ii) abolition dans une deuxième temps et après une certaine période d'induction statique de ce facteur de concentration par dilution des pré-bouillies jusqu'à un volume correspondant au volume préconisé pour de telles bouillies pulvérisables contenant des populations bactériennes osmotolérantes. Les populations bactériennes sont constituées d'espèces bactériennes Gram négatives (Gram-) et/ou Gram positives (Gram+).

[0017] La période d'induction statique est comprise entre 6 et 24 heures, plus particulièrement entre 8 et 18 heures, et plus usuellement d'environs 12 heures.

[0018] La milliosmolarité (mOSM) critique de la pré - bouillie concentrée est comprise entre 330 et 1 250, et avantageusement aux alentours de 500. À titre illustratif, les volumes (L) de telles pré - bouillies permettant d'assurer mOSM d'approximativement 500 mM, facteur d'induction statique de l'osmotolérance des bactéries osmotolérantes concernées, sont présentés au Tableau 4.

[0019] La dilution desdites pré - bouillies est effectuée par l'apport d'un volume aqueux fonction de la dose hectare (L/ha) du produit, du poids moléculaire des sels fertilisants le constituant (g/mole), et leurs concentrations dans le produit (g-sel/L) respectant une mOSM minimale de la bouillie fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc) appliquée lors production des populations bactériennes en milieux liquides et/ou solide. La mOSM minimale fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc) appliquée lors production des populations bactériennes en milieux liquides et/ou solide est elle fonction de l'osmolarité de plasmolyse (OSMp) de ces populations bactériennes. Enfin, l'osmolarité de plasmolyse (OSMp) de ces populations bactériennes est elle donnée par la le paramètre α2 (mOSM) de la relation décrivant le volume cellulaire, Vc (uL/mg de protéine bactérienne), desdites bactéries en fonction d'OSMPp, à savoir [Vc = α1 / (OSMp + α2) + Vc,min,] où Vc,min et le volume cellulaire minimal atteint en fonction d'OSMp et α1 est un autre paramètre empirique (uL/mg de protéine bactérienne).

[0020] Les populations bactériennes a priori osmotolérantes sont produites par fermentation liquide ou solide de milli-osmolarités de croissance (OSMc) comprises entre 50 et 1 000, plus particulièrement entre 200 et 800, et avantageusement entre 300 et 600. Le facteur de concentration à abolir est lui compris entre 3,8 et 113 et cela selon la concentration (g-sel/L) des sels fertilisant, le poids moléculaire (PM) de ceux-ci et la quantité de produit préconisé par hectare (i.e. dose-hectare en g, Kg ou L par hectare), voire - le cas échéant, l'osmolarité de la fraction soluble de la formulation solide et/ou liquide, de ladite préparation bactérienne. La milli-osmolarité (mOSM) de la bouillie une fois ledit facteur de concentration aboli par dilution aqueuse ne doit pas elle être inférieure à des valeurs comprises entre 175 et 360, plus avantageusement entre 190 et 330, notamment dans le cas de bactéries produites en présence d'OSMc (omolarités de croissance) les plus élevées, soit ici de l'ordre de 1,00.

[0021] Les populations bactériennes sont avantageusement chitinolytiques, et/ou proviennent de familles taxonomiques choisies parmi un groupe comprenant les Xanthomonadaceae et les Pseudomonadaceae, voire du genre Stenotrophomonas. Ces populations bactériennes a priori osmotolérantes produisent comme osmolyte compatible du glucosyl-glycérol (GG) et/ou du glucosyl-glycerate (GGate). A titre d'exemple, Stenotrophomonas maltophilia (Crossman et al. 2008), précédemment Pseudomomonas maltophilia et/ou Xanthomonas maltophilia est ubiquitaire dans les sols, et taxonomiquement proche des Azotobacteracea. De nombreuses espèces ont été répertoriées ; S. terrea, S. humi, S. rhizophilia, S. dokdonesis, etc. (Hagemann et al. 2008, Wolf et al. 2002, Heylen et al. 2007, Yoon et al.2008). Parce que certaines espèces de sont chitinolytiques (Metcalfe et al. 2002a, 2002b ; Kobayashi et al. 2002), Stenotrophomonas est parfois préconisée pour le biocontrôle de maladies fongiques foliaires Poaceae causées par Rhizoctonia solani (Giesler et Yuen 1998), ou encore Magnaprothe poae (Kobayashi et al. 1995). Or, l'efficacité de telles applications n'est pas très bonne du fait d'osmotolérances insuffisantes. Pourtant, certaines Stenotrophomonas peuvent être induites à produire un osmolyte compatible ; le glycosyl glycérol (Marin et al. 2002) voire d'autres osmolytes.

Principaux avantages, et activité inventive



[0022] L'invention permet de mieux réconcilier l'application foliaire de sels fertilisants et BFCP, et donc du coup fertilisation foliaire et régie phytosanitaire des cultures, et cela sans surcharge de travail pour l'utilisateur puisque les deux opérations peuvent être combinées en une seule.

[0023] Cette (sur)concentration de sels combinée à des préparations bactériennes est toute sauf évidente pour l'homme du métier. La hauteur inventive de cette solution technique est donc appréciable dans la préconisation d'une « pré - bouillie » in baco, sur-concentrée en sorte par rapport à la bouillie pulvérisable in fine. Pour le microbiologiste, mais non pour l'agronome et/ou l'agriculteur, cette sur-concentration peut effectivement induire une certaine osmotolérance des BFCP ; une fois cette induction terminée le facteur de concentration est aboli lors du rétablissement du volume préconisé pour la bouillie pulvérisable. L'homme du métier ne peut pas cependant concevoir qu'une telle exposition à un quelconque stress en soi bien supérieur à l'osmolarité du sol - soit généralement de l'ordre de 50 mOSM (Miller et Wood 1996), puisse être recherchée et/ou comporter en soi un avantage technique en agronomie. Il cherchera plutôt à préserver au maximum la survie de ces microorganismes jusqu'à leurs application au champ ; cette préservation doit donc à ses yeux exclure au tant que possible un tel stress osmotique.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS ET FIGURES



[0024] 
Figure 1 :
Les coefficients exponentiels de mortalités en fonction de la durée de conditions propices au dessèchement de bactéries Gram- obtenues de cultures avec et sans osmo - adaptation en présence de 0,5 ou 0,7 M-NaCl (données de Bonaterra et al. 2005 et 2007, figures 3). Quatre expérimentations sont décrites ; les deux premières comprennent des bactéries osmo - adaptées à 0,5 M re-suspendues dans le l'eau distillée (~ 0 mM) ; le deux dernières comprennent des bactéries osmo - adaptées à 0,7 M re-suspendues dans une solution dites de Ringer diluée (~ 75 mM). A noter donc un diminution du taux de mortalité avec osmo - adaptation, mais aussi l'effet bénéfique sur la survie desdites bactéries d'une certaine osmolarité (~ 75 mM) de la suspension (bouillie).
Figure 2 :
Résumé graphique des données de Bonaterra et al. 2005 et 2007 ayant servit à établir les coefficients exponentiels à la Figure 1 ; les deux expérimentations comprenant des bactéries osmo - adaptées à 0,5 M-NaCl sont regroupées (figure du haut ; data Bonaterra 2005), ainsi que les celles comprenant des bactéries osmo - adaptées à 0,7 M-NaCl (figure du bas ; data Bonaterra 2007). Il s'agit donc de courbe de survie (%) en fonction du temps de dessèchement (desiccation) de bactéries osmo - adaptées ou non. A titre illustratif j'ai placé une courbe (en pointillé) escomptant la survie de telles bactéries dont l'osmolarité de la suspension (bouillie) aurait été ajusté en fonction de leurs l'osmolarités de croissance (OSMc) au sens de la présente invention.
Figure 3 :
Milli-osrmolarité (mOSM) des bouillies (eg. 15 L-produit / ha) selon le poids moléculaire (PM) des sels constituants, le volume préconisé de la bouillie, ainsi que la concentration (g/L) du produit. A noter que bon nombre de ces mOSM sont inférieurs à 500 mOSM ; le bouillies concernées devront - au sens de la présente invention, être concentrées par un facteur. C'est ce facteur de concentration qui devra être aboli au moment de l'utilisation de la bouillie.
Figure 4 :
Facteur de concentration appliqué à la pré-bouillie et à abolir au moment de l'utilisation de la bouillie ; c'est ce facteur de concentration qui permet d'assurer une mOSM de 500 propice à l'induction statique de l'osmotolérance des souches bactériennes (eg. PM = 90 (urée formaldéhyde ; Azo-Speed™, AzoFol SR™).
Figure 5 :
Modélisation du volume cellulaire des bactéries selon les osmolarités de plasmolyses (OSMp). Ces osmolarités de plasmolyses sont établies par titrage osmotique selon Cayley et al. (1991, 2000). A noter que cette décroissance de Vc est de plus en plus abrupte pour les osmolarités de croissance (OSMc) plus importantes, dénotant ainsi une certaine osmoadaptation associée de facto à un encombrement moléculaire grandissant ; cette encombrement moléculaire permets à la cellule de maintenir son activité métabolique - ou du moins adénique, malgré de forte concentration cytoplasmique de cations (voir texte).
Figure 6 :
Osmolarités minima de la bouillie telles qu'inférée de la variable paramétrique α2 pour le calcul de l'osmolarité de plasmolyses (OSMp) selon l'osmolarité de croissance (OSMc) de bactéries osmotolérantes Gram- ; Tableau 6. A mesure que progresse cette OSMc effective lors de la production des biomasses bactériennes de l'inoculum, l'osmolarité minimale de la bouillie doit être égale à OSMp. Les osmolarités minima de la bouillie de bactéries osmotolérantes Gram+, en principe plus halophiles, sont elles décrites par une fonction dont la courbe (pointillée) est légèrement déplacée vers le haut (+10%). Idem pour ce qui concernerait des bactéries osmotolérantes moins halophiles, les osmolarités minima de la bouillie serait elles décrites par une courbe (pointillée) déplacée vers le bas (-10%).
Figure 7 :
Représentation graphique de la relation entre les volumes des bouillies (Vbouillie ; L/kg-sel) pulvérisables contenant des sels fertilisants et dont l'osmolarité est adaptée à celles des cytosols bactériens quelles contiennent, et les volumes osmoactifs (Vosmoactif ; uL/mg-protéine microbienne) desdits cytosols microbiens, et plus particulièrement bactériens. Trois courbes sont proposées pour trois poids moléculaires (PM ; g/mol) desdits sels. A noter que ces relations sont foncièrement linéaires et indépendantes de la concentration en sel (g-sel/L) et de la dose-hectare de tels produits solubles (L de concentré / ha). A noter aussi que le caractère osmogène des sels est donc de ~33 à ~50 fois plus important que celui des soluté des cytosols microbiens rapporté ici sur la base de leurs teneurs en protéines bactériennes.

MODE DE REALISATION PREFERE DE L'INVENTION



[0025] Les bactéries sont avantageusement destinées aux feuillages de cultures viticoles, arboricoles, céréalières et/ou herbacées. Elles sont mélangées en milieux aqueux à des sels fertilisants osmogènes, avantageusement au sein d'un bac d'un pulvérisateur. La milli-osmolarité (mOSM) de la pré-bouillie concentrée ainsi obtenue est avantageusement ~500 mOSM. Le stress osmotique ainsi provoqué permettra aux bactéries, avantageusement des BFCP, d'activer leurs osmotolérance préalablement acquises lors de leurs en présence d'osmolarité de croissance (OSMc) particulières. Ces bactéries peuvent ainsi être mises en contacte avec des feuillages, mais aussi avec des racines, des semences, voire des résidus de culture au sol.

[0026] Au Tableau 3, les concentrations en g par litre des bouillies pulvérisables selon la teneur en sel et la dose-hectare de différents produits fertilisant pour application foliaire (eg. Azo-Speed™, AzoFol-SR™, Fertigofol 313™; Agronutrition SAS, 31390, Carbonne France), ainsi que les différents volumes de la bouillie pulvérisable tels que préconisés par le fabricant. En fonction des poids moléculaire (PM ; g/mol) des principaux constituants de tels produits, nous pouvons calculer la millio-smolarité (mOSM) de ces bouillies (Figure 3), ainsi que le volume d'une éventuelle pré - bouillie elle nécessairement ~500 mOSM tel que préconisé ici (Tableau 4).

[0027] A noter qu'il s'agit ici de d'osmolarité théorique et non de l'osmolaité mesurée ; cette dernière étant généralement inférieure du fait de l'interaction intermoléculaire au sein de tels mélanges. A noter aussi que pour une concentration donnée, les valeurs mOSM vont décroître en fonction de la diminution du PM en raison de la plus grande activité osmotique des plus petites molécules.

[0028] Du coup, on peut aussi calculer le facteur de concentration à appliquer à cette bouillie pulvérisable pour obtenir la pré-bouillie plus osmogène à hauteur d'environ 500 mOSM (Figure 4). Concrètement, il s'agit simplement de placer dans le bac du pulvérisateur les volumes d'eau préconisés au Tableau 4. Ces volumes sont fonction de la teneur en g-sel par L du produit, la dose-hectare de ce produit par hectare et le poids moléculaire de l'ensemble des constituants osmogène dudit produit, y compris le cas échéant d'éventuel co-formulants (infra). En complétant, avantageusement le lendemain matin, le volume de la bouillie pulvérisable - soit généralement de l'ordre de 200 à 500 L par hectare, le facteur de concentration sera aboli, et la pulvérisation pourra aller de l'avant.
Tableau 3 : Concentration (g / L) de bouillie pulvérisable au champ selon le nombre de L-bouillie / ha préconisés, la concentration du produit en g-sel / L ainsi que le volume (L) de la bouillie par hectare. Selon le poids moléculaire (PM ; g/mole) des principaux constituant du produit, la mili - osmolarité (mOSM) de la bouillie sera plus ou moins importante (Voir à la Figure 1 pour une illustration de ce fait pour le cas de 15 L-produit / ha, le même schéma étant applicable aux autres cas avec plus ou moins de L-produit par hectare).
L-produit/ha = 5   L-bouillie/ha
  g-sel/L 100 150 200 250 300 350 400 450 500
                     
  50 2,50 1,67 1,25 1,00 0,83 0,71 0,63 0,56 0,50
  100 5,00 3,33 2,50 2,00 1,67 1,43 1,25 1,11 1,00
  150 7,50 5,00 3,75 3,00 2,50 2,14 1,88 1,67 1,50
  200 10,00 6,67 5,00 4,00 3,33 2,86 2,50 2,22 2,00
  250 12,50 8,33 6,25 5,00 4,17 3,57 3,13 2,78 2,50
  300 15,00 10,00 7,50 6,00 5,00 4,29 3,75 3,33 3,00
  350 17,50 11,67 8,75 7,00 5,83 5,00 4,38 3,89 3,50
                     
L-produit/ha = 10   L-bouillie/ha
  g-sel/L 100 150 200 250 300 350 400 450 500
                     
  50 5,00 3,33 2,50 2,00 1,67 1,43 1,25 1,11 1,00
  100 10,00 6,67 5,00 4,00 3,33 2,86 2,50 2,22 2,00
  150 15,00 10,00 7,50 6,00 5,00 4,29 3,75 3,33 3,00
  200 20,00 13,33 10,00 8,00 6,67 5,71 5,00 4,44 4,00
  250 25,00 16,67 12,50 10,00 8,33 7,14 6,25 5,56 5,00
  300 30,00 20,00 15,00 12,00 10,00 8,57 7,50 6,67 6,00
  350 35,00 23,33 17,50 14,00 11,67 10,00 8,75 7,78 7,00
                     
L-produit/ha = 15   L-bouillie/ha
  g-sel/L 100 150 200 250 300 350 400 450 500
                     
  50 7,50 5,00 3,75 3,00 2,50 2,14 1,88 1,67 1,50
  100 15,00 10,00 7,50 6,00 5,00 4,29 3,75 3,33 3,00
  150 22,50 15,00 11,25 9,00 7,50 6,43 5,63 5,00 4,50
  200 30,00 20,00 15,00 12,00 10,00 8,57 7,50 6,67 6,00
  250 37,50 25,00 18,75 15,00 12,50 10,71 9,38 8,33 7,50
  300 45,00 30,00 22,50 18,00 15,00 12,86 11,25 10,00 9,00
  350 52,50 35,00 26,25 21,00 17,50 15,00 13,13 11,67 10,50
                     


[0029] Cette abolition du facteur de concentration le lendemain (12 heures) n'est pas arbitraire ; ce délais s'appui sur une revue de la littérature (Tableau 2). Les volumes au Tableau 4 sont à réaliser in baco environs 12 heures - la veille, avant la pulvérisation de la bouillie au champ.

[0030] Par rapport à la bouillie pulvérisable, cette pré - bouillie est donc plus concentrée par un certain facteur de concentration. Les volumes de la bouillie, par opposition à ceux de la pré - bouillie au Tableau 4, à ne pas dépasser au moment de l'abolition dudit facteur de concentration peu avant sa pulvérisation liquide sont rapportés aux Tableaux 5-a, 5b et 5c selon les différents poids moléculaire des produits à base de sels fertilisants choisis ici à titre d'exemple. Il s'agit ainsi d'éviter des conditions hypo - osmotiques aptes à faire exploser les bactéries expressément induites à être osmotolérantes en présence d'OSMc relativement élevées.
Tableau 4 : Volume (L) de la pré-bouillie permettant d'assurer une milli-osmolarité (mOSM) d'approximativement 500 mMole / L (500 mOSM) facteur d'induction statique de l'osmotolérance des bactéries osmotolérantes concernées.
L de produit / hectare = 5 Poids moléculaire (PM ; g/mole) des principaux sels
g-sel / L de produit 113 90 80
       
50 4,4 5,6 6,3
100 8,8 11,1 12,5
150 13,3 16,7 18,8
200 17,7 22,2 25,0
250 22,1 27,8 31,3
300 26,5 33,3 37,5
350 31,0 38,9 43,8
       
L de produit / hectare = 10 Poids moléculaire (PM ; g/mole) des principaux sels
g-sel / L de produit 113 90 80
       
50 8,8 11,1 12,5
100 17,7 22,2 25,0
150 26,5 33,3 37,5
200 35,4 44,4 50,0
250 44,2 55,6 62,5
300 53,1 66,7 75,0
350 61,9 77,8 87,5
       
L de produit / hectare = 15 Poids moléculaire (PM ; g/mole) des principaux sels
g-sel / L de produit 113 90 80
       
50 13,3 16,7 18,8
100 26,5 33,3 37,5
150 39,8 50,0 56,3
200 53,1 66,7 75,0
250 66,4 83,3 93,8
300 79,6 100,0 112,5
350 92,9 116,7 131,3


[0031] C'est à l'aide de modélisations du volume cellulaire de ce type de bactéries (Vc ; ul / mg de protéines bactériennes) qu'il est possible d'établir les mOSM nécessaires pour éviter de telles explosions cellulaires. Elles sont ici au minimum d'environ 200 mM pour les bactéries produites à des OSMc d'à peine 50, et d'environ 330 pour celles produites à des OSMc de 1,00 (Tableau 6). Ces molarités minimales impliquent qu'il faut non seulement fixer a priori le volume de la pré - bouillie (Tableau 4), mais aussi celui de la bouillie une fois le facteur de concentration (Figure 2) aboli. Il fallut calculer les volumes d'eau à ajouter aux pré - bouillies de manière à ne pas dépasser ces seuils de mOSM minimales (Tableaux 5a, 5b et 5c) fonction eux de l'OSMc (osmolarité de croissance) imposées aux bactéries leurs de leurs production (Tableau 6 ; infra), faute de quoi les bactéries seront en situation d'hypo - osmolarité et sujette à explosion (i.e. expansion exponentielle et très rapide de leurs Vc en fonction d'une diminution de OSMp (Figure 5).

[0032] L'osmo-tolérance des souches bactériennes ne sera qu'induite par ce passage transitoire au sein de la pré-bouillie. En ce sens, il est avantageux de faire appel à différents modes d'obtention de souches osmo-tolérantes, voire ici plus particulièrement du genre Stenotrophomonas (Bollet et al. 1995, Juhnke et Des Jardin 1989, ou encore Palleroni et Bradbury 1993). Pour obtenir des souches osmotolérantes de familles taxonomiques choisies parmi un groupe comprenant les Xanthomonadaceae et les Pseudomonadaceae, il est utile d'impose une certaine pression osmotique environnement pendant leur croissance in vitro ; on parle alors encore une fois d'osmolarité de croissance (OSMc). En effet, selon Cayley et al. (1991, 2000) des osmolarité allant de 50 à plus de 1 000 mOSM vont progressivement réduire le volume cellulaire (Vc ; uL/mg de protéine) des cellules bactériennes de manière à en augmenter leurs éventuelles osmo-tolérance. L'augmentation progressive de OSMc va aussi augmenter progressivement l'osmolarité minimale à maintenir dans la bouillie in baco, faute de quoi ces cellules osmotolérantes plus petites vont exploser en raison d'une augmentation soudaine de leur Vc en réponse à choc hypo-osmotique.

[0033] D'éventuelles Stenotrophomonas ne seront pas résistantes aux antibiotiques de types imipenem et/ou beta-lactam, ceux-ci pouvant produire des imipenemases et/ou surproduire des beta-lactamases notoires pour leur rôle dans certaines infections nosocomiales. Il est aussi utile de rechercher des Stenotrophomonas chitionolytiques, les Stenotrophomonas étant particulièrement abondantes au sein de tels contingents (Metcalfe et al. 2002a, 2002b).

[0034] Une fois la prébouillie constituée, un délai d'induction statique est respecté, soit ici de l'ordre de 8 à 12 heures à titre d'exemple. Le facteur de concentration appliqué lors de la constitution de ces prébouillies (Tableau 4) peut maintenant être aboli en apportant un volume d'eau (Tableaux 5a, 5b et 5c) de manière à ce que la mOSM de ces bouillies pulvérisables respectent les mOSM minima correspondant aux mOSM intracellulaires des bactéries produites à des mOSM de croissance (OSMc) plus ou moins importantes (Tableau 6). A noter enfin que ces mOSM minimales à respecter lors de la dilution de la prébouillie augmentent en fonction des susdits OSMc. L'induction statique de l'osmotolérance des BFCP, et plus particulièrement ici appartenant au genre Stenotrophomomas, peut être observé au sein d'une simple solution saline à un moment donné après induction statique au sens de la présente invention, soit avantageusement après une période de conditionnement au sein d'une pré-bouillie d'environs 500 mOSM de 10 à 12 heures, soit une période équivalente à une nuit dès la veille de la pulvérisation au champ par l'agriculteur.
Tableau 5 a : Volume d'eau à ajouter aux volumes des pré - bouillies indiquées au Tableau 4 en fonction de la dose hectare (Uha) du produit, du poids moléculaire des sels fertilisant constituant le constituant (g/mole), leur concentration dans le produit (g-sel/L) afin de respecter une mini-osmolarité (mOSM) minimale. A noter que cette mOSM minimale (α2 ; Tableau 6) est elle fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc ; Tableau 6). Il s'agit ici d'un produit dont le poids moléculaire est des 113.
Volume de la prébouillie Volume à ajouter si PM = 113
                     
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
Uha = 5 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50 4     7 6 5 4 3 3 2
100 9     14 12 10 8 7 6 5
150 13     22 18 16 11 10 8 7
200 18     29 24 21 15 14 11 9
250 22     36 31 26 19 17 14 11
300 27     43 37 31 23 21 17 14
350 31     51 43 36 26 24 20 16
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
L/ha=10 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50 9     14 12 10 8 7 6 5
100 18     29 24 21 15 14 11 9
150 27     43 37 31 23 21 17 14
200 35     58 49 42 30 28 23 18
250 44     72 61 52 38 35 28 23
300 53     87 73 62 45 42 34 27
350 62     101 86 73 53 49 40 32
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
L/ha = 15 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50 13     22 18 16 11 10 8 7
100 27     43 37 31 23 21 17 14
150 40     65 55 47 34 31 25 21
200 53     87 73 62 45 42 34 27
250 66     108 92 78 57 52 42 34
300 80     130 110 93 68 63 51 41
350 93     152 128 109 79 73 59 48
Tableau 5 b : Volume d'eau à ajouter aux volumes des pré - bouillies indiquées au Tableau 4 en fonction de la dose hectare (Uha) du produit, du poids moléculaire des sels fertilisant constituant le constituant (g/mole), leur concentration dans le produit (g-sel/L) afin de respecter une mini-osmolarité (mOSM) minimale. A noter que cette mOSM minimale (α2 ; Tableau 6) est elle fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc ; Tableau 6). Il s'agit ici d'un produit dont le poids moléculaire est des 90.
Volume de la prébouillie Volume à ajouter si PM = 90
                     
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
Uha = 5 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50   6   9 8 7 5 4 4 3
100   11   18 15 13 9 9 7 6
150   17   27 23 20 14 13 11 9
200   22   36 31 26 19 17 14 11
250   28   45 38 33 24 22 18 14
300   33   54 46 39 28 26 21 17
350   39   63 54 46 33 31 25 20
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
L/ha=10 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50   11   18 15 13 9 9 7 6
100   22   36 31 26 19 17 14 11
150   33   54 46 39 28 26 21 17
200   44   73 61 52 38 35 28 23
250   56   91 77 65 47 44 36 29
300   67   109 92 78 57 52 43 34
350   78   127 107 91 66 61 50 40
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
L/ha=15 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50   17   27 23 20 14 13 11 9
100   33   54 46 39 28 26 21 17
150   50   82 69 59 43 39 32 26
200   67   109 92 78 57 52 43 34
250   83   136 115 98 71 65 53 43
300   100   163 138 117 85 79 64 52
350   117   190 161 137 99 92 75 60
Tableau 5 c : Volume d'eau à ajouter aux volumes des pré - bouillies indiquées au Tableau 4 en fonction de la dose hectare (Uha) du produit, du poids moléculaire des sels fertilisant constituant le constituant (g/mole), leur concentration dans le produit (g-sel/L) afin de respecter une mini-osmolarité (mOSM) minimale. A noter que cette mOSM minimale (α2 ; Tableau 6) est elle fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc ; Tableau 6). Il s'agit ici d'un produit dont le poids moléculaire est des 80.
Volume de la prébouillie Volume à ajouter si PM = 80
                     
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) ; Tableau 6
Uha = 5 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50     6 10 9 7 5 5 4 3
100     13 20 17 15 11 10 8 6
150     19 31 26 22 16 15 12 10
200     25 41 35 29 21 20 16 13
250     31 51 43 37 27 25 20 16
300     38 61 52 44 32 29 24 19
350     44 71 60 51 37 34 28 23
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2); Tableau 6
L/ha=10 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50     13 20 17 15 11 10 8 6
100     25 41 35 29 21 20 16 13
150     38 61 52 44 32 29 24 19
200     50 82 69 59 43 39 32 26
250     63 102 86 73 53 49 40 32
300     75 122 104 88 64 59 48 39
350     88 143 121 103 75 69 56 45
  Poids Moléculaire (PM) mOSM minimal à respecter (OSMp ; α2) Tableau 6
L/ha=15 113 90 80 190 210 230 270 280 305 330
g-sel/L                    
50     19 31 26 22 16 15 12 10
100     38 61 52 44 32 29 24 19
150     56 92 78 66 48 44 36 29
200     75 122 104 88 64 59 48 39
250     94 153 129 110 80 74 60 48
300     113 184 155 132 96 88 72 58
350     131 214 181 154 112 103 84 68

APPLICATION BIOINDUSTRIELLE ET AGRONOMIQUE


Production des biomasses bactériennes a priori osmotolérantes



[0035] La production de biomasses bactériennes a priori osmotolérantes est bien connu de l'homme du métier. L'approche la plus simple est d'appliquer (de réaliser) une osmolarité appréciable au cours de la production par fermentation, liquide ou solide, desdites population bactériennes. Les bactéries ainsi produites en masse seront nécessairement plus résistantes, non seulement aux stresses osmotiques, mais aussi parfois aussi aux stresses thermiques (Besten et al. 2006), voire oxydatifs, acido-basiques, etc. (Bonaterra et al. 2007) Une des caractéristique des bactéries osmotolérantes ainsi isolées et produites en masses en présence d'osmolarités grandissantes est une réduction de leurs volumes cellulaire, Vc, et du coup de leur encombrement moléculaire (Cayley et al. 2000, Zimmerman et Trach 1991, Ellis 2001, Spitzer 2011, Spitzer et Poolman 2005) La mesure de cette osmotolérance et de ces caractéristiques morphocellulaire telles que le susdit encombrement moléculaire est connue de l'homme du métier.

[0036] Les notions d'osmolarité de croissance (OSMc) et d'osmolarité de plasmolyse (OSMp) évoquées plus bas préciseront d'autant plus les conditions de culture et de production des BFCP a priori osmotolérantes. En effet, c'est l'osmolarité vécue par les bactéries pendant leur croissance (OSM de croissance ; OSMc au sens de Cayley et al. 2000) qui détermine leurs omolarité de plasmolyse (OSMp ; op. cit.). Or, cette OSMp reflète précisément le degré d'osmotolérance ad'une bactérie lui permettant de contracter (concentrer) au maximum son volume cellulaire (Vc ; uL / mg-MS) avant d'imploser (plasmolyse ; op. cit., figure 1). Ce lien entre OSMc et OSMp permet donc de connaître a priori le degré d'osmotolérance des bactéries ainsi produites, et du coup d'ajuster l'osmolarité de la pré - bouillie en conséquence (voir infra).

[0037] A ce stade de développement de l'invention il est loisible d'utiliser les valeurs paramétriques applicables à une simple bactérie Gram- telle qu'E. coli; elles pourront toujours être précisées spécifiquement pour diverses espèces bactériennes le moment venu par titrage NaCl au sens de Cayley et al. 2000, ou encore plus simplement Pilizota et Shaevitz 2012. Voir aussi une revue de certaines de ces méthodes de titrage pour la détermination de Vc en annexe de Wood 1999 (op. cit. pp. 254-255).

[0038] Cela dit, c'est surtout ici OSMc qui dictera la valeurs de OSMp (α2 ; Tableau 6), et rien ne laisse croire à ce stade les coefficients (variables paramétriques) de courbes telles que celles ici à la Figure 6 mais pour des espèces autres qu'E. coli donneraient des OSMp appréciablement différents des ceux rapportés ici au Tableau 6. En effet et par exemple, les osmolarités imposées à des Pseudomonas syringae variant ici de 128 à 385 mOSM (Tableaux 1 et 2) sont très comparables à celles imposées à E. coli qui elles varient de 182 à 463, et du coup parfaitement dans la moyenne (430 mM ; Tableau 1). De plus, la valeur de l'activité de l'eau (aw) limitant la croissance d'une bactérie est essentiellement la même (~0,95) pour E. coli, Pseudomonas et Salmonella, voire la plupart des bactéries Gram-, soit entre 0,94 et 0,96 (par opposition à ~0,80 pour les champignons par exemple).

[0039] Une fois produite en masse, les bactéries peuvent être formulées et conditionnées selon l'état de l'art, soit sous forme solide, voir par lyophilisation, soit en formulation liquide en présence de PVPP, CMC, glycerol, etc.

Pré-application des BFCP (« pré-bouillie »)



[0040] L'utilisateur peut réaliser la pré - bouillie permettant l'induction statique des bactéries osmotolérantes en remplissant que partiellement la cuve (in baco) du pulvérisateur, laisser « incuber » pendant 12 heures, soit usuellement depuis la veille, et compléter par la suite le volume de la bouillie au moment ou peu avant l'application de la préparation au champ, et cela en fonction des volumes préconisés ici aux Tableau 5-a, b et c. Selon la concentration (g/L) des produites fertilisants appliqués conjointement, le poids moléculaire (g/mole) de leurs principales composantes, et le volume de la bouillie préconisé, les volumes de la pré - bouillie sont indiquées au Tableau 4. Expérimentalement, nous n'aurons qu'à simuler la formation de cette pré - bouillie concentrée par un facteur (de concentration) donnée à l'aide de solutions.

Application in situ des BFCP



[0041] Les préparations bactériennes au sens de la présente invention peuvent avantageusement être appliqués aux feuillages, et cela conjointement à certains agents azoto-nutritionnels (ANN), voire à certains fongicides, régulateurs de croissance et/ou toutes autres matières fertilisantes et/ou phytosanitaires applicables aux feuillages. Plus particulièrement il pourrait ici être question d'engrais foliaires types Azofol™, Fertigofol™ et AzoSpeed™ commercialisés par Agronutrition SAS (France). Il peut aussi être question d'ANN tel que Optéine™, Phyléas™, voir plus avantageusement au sens de FR0900867/EP10366001.5 ; cette dernière technologie permet en effet une « fenêtre d'application » beaucoup plus large et donc plus opportune.

Modélisations des Vc,mini et des osmolarité minimale à respecter



[0042] Modélisons l'effet de la création des pré - bouillies, notamment ici au sens de Cayley et al. 2000 (op. cit., figures 1 et 6), et Dötsch et al. 2008 (op. cit., éq. 7). Il faut aussi tenir compte des notions d'enzymes bactériennes halophiles et halotolérantes (Sleator et Hill 2001). En effet, il existe vraisemblablement un gradient entre une halophilie stricte nécessitant de très fortes osmolarités à hauteurs de 5 à 7 molaire (Wood 1999, tableau 1), et une certaine halotolérance en présence d'osmolarité d'au plus équivalentes à 0,5 molaire. Les bactéries au sens de la présente invention sont avantageusement intermédiaires ; leurs enzymes pouvant bénéficier de la stabilisation que procure des cations à forte concentration - un peu à la façon des bactéries halophiles, tout en accumulant des osmolytes comme le font les bactéries halotolérantes.

[0043] Selon l'équation apparaissant dans Dötsch et al. 2008 ;

Vc = volume cellulaire aqueux (uL / mg-matière sèche (MS))

α1 = paramètre empirique (ul / mg-protéine)

OSMp = milli - osmolarité de plasmolyse (via titrage NaCl ; Cayley et al. 2000)

α2 = paramètre empirique (mol / L)

Vc,min = volume cellulaire aqueuse minia (uL / mg-MS)

... et à partir de données numériques telles que celles présentées par Cayley et al. 2000 pour E. coli (op. cit. tableau 1), il est maintenant possible de déterminer les paramètres α1, α2 et Vc,min pour une gamme de valeurs mOSM de croissance (OSMc). Il est donc possible de recalculer les valeurs d'osmolarité minimales à prévoir dans la pré - bouillie afin d'éviter l'explosion des BFCP.

[0044] Cette modélisation peut s'effectuer via un algorithme stochastique compris dans une pack statistique aussi banale que XLStat™; voir en ce sens les valeurs paramétriques au Tableau 6. Cette modélisation de Vc selon OSMp et OSMc est représentée à la Figure 4. Non seulement les bactéries les plus osmotolérantes ont les Vc les plus réduits (i.e. une compression favorisant un plus grand encombrement moléculaire propice à une activité métabolique plus soutenue à omolarités élevées), mais elles nécessitent aussi des osmolarités minimales plus élevées que des bactéries moins osmotolérantes produite à des osmolarité de croissance (OSMc) plus faibles, faute de quoi les Vc augmenteront très rapidement, les cellules bactériennes devant ainsi nécessairement exploser si l'osmolarité ambiante n'est pas suffisante (i.e. d'au moins 190 à 330 mOSM, selon le cas). Des bactéries croissant en présence d'OSMc d'environs 0,5 à 0,8 molaire devront impérativement être mises en présence d'au moins 250 à 300 mOSM.

[0045] A noter ici que la variable α2 mesure approximativement de la molarité minimale à respecter dans la pré - bouille afin d'éviter l'explosion des BFCP plus ou moins osmotolérante selon leur OSMc. En effet, la valeur paramétrique de cette variable coïncide avec le point d'inflexion de la susdite équation non - linéaire rationnelle. Une population de BFCP produite à un OSMc donnée placée dans une une pré - bouillie dont l'osmolarité n'est pas d'au moins α2 explosera à plus ou moins brève échéance, vraisemblablement avant d'avoir été pulvérisée au feuillage. A noter aussi que les valeurs α2 sont ici, pour des OSMc correspondant aux alentours de 0,500 (de 0,300 à 0,600 ; Tableau 6), d'environ la moitié de la milli - osmolarité en principe la plus avantageuse préconisée pour la pré - bouillie, i.e. approximativement 500 milli - molaire. Or, selon la Figure 5, des bactéries produites à de telles OMSc peuvent résister à des OSMp bien au delà de 0,500. C'est pourquoi nous avons proposé pour les pré - bouillie une gamme de milli-osmolarités (mOSM) comprise entre 250 et 1 250 milli - molaire.
Tableau 6 : Valeurs des variables paramétriques α1, α2 et Vc,min pour le calcul de l'osmolarité de plasmolyses (OSMp) de la pré - bouillie selon l'osmolarité de croissance (OSMc) lors de la production des bactéries. (cf. représentation graphique, ici Figure 6).
Osmolarité croissance (OSM-c) α1 Osmolarité de plasmolyse (OSMp ; α2) Volumes cellulaires minima (Vc,mini)
mol/L uL / mg-protéine mol/L uL / mg-protéine
0,05 0,241 0,190 1,858
0,10 0,260 0,210 1,800
0,30 0,350 0,230 1,680
0,60 0,500 0,270 1,530
0,70 0,550 0,280 1,480
0,90 0,650 0,305 1,384
1,00 0,740 0,330 1,260


[0046] Concrètement, afin de compléter le Tableau 6, j'ai extrapoler linéairement à entre les osmolarité de croissance (OSMc) de 0,03 et 0,83 osmolaire (OSM) lors de la production des biomasses d'E. coli-une banale bactérie Gram - négative. A noter la différence ici entre les valeurs d'OSMp obtenues par titrage - NaCl (Cayley et al. 2000), et d'OSMc imposées lors des cultures par fermentation liquide desdites E. coli ; c'est donc ici OSMc qui dicte OSMp, et donc le niveau d'osmotolérance a priori de ces bactéries. De plus, E. coli n'est pas en soi une bactérie tellurique et/ou particulièrement robuste. L'application à des bactéries du sols et/ou de la phyllosphère des paramètres ainsi recalculer à partir de ceux d'E. coli est donc une approche conservatrice.

[0047] J'ai représenté graphiquement à la Figure 6 une telle progression quasi linéaire des osmolarités minima des pré - bouillie inférées à partir de OSMp (α2 ; éq. (1)) pour diverses OSMc. Sans être universelle, cette courbe est a priori et à ce stade applicable à la plupart des BFCP Gram-, l'activité de l'eau (aw) limitant la croissance étant essentiellement la même (~0,95) pour des bactéries telles que E. coli, Pseudomonas et Salmonella, voire la plupart des bactéries Gram-. Cela dit, et à ce stade qu'approximativement, les progressions quasi linéaire des OSMp minima pour des bactéries Gram+, en principe plus halophiles les Gram-, seront elles décrites par une fonction dont la courbe (pointillée) est légèrement mais nécessairement déplacée vers le haut (+10% ; pointillé Figure 6). Idem pour ce qui concernerait d'éventuelles bactéries osmotolérantes moins halophiles, les osmolarités minima de la bouillie serait elles décrites par une courbe (pointillée) légèrement mais nécessairement déplacée vers le bas (-10% ; pointillé Figure 6). En effet, cette relative suraccumulation d'osmolytes minéraux et organiques par des bactéries plutôt halophiles telle que Halomonas elongata DSM 2581 est clairement décrit par Dötsch et al. 2008. Des titrages - NaCl tel que décrits dans Cayley et al. 2000 spécifique pourront aussi être effectués pour diverses espèces de BFCP pour confirmer cette applicabilité interspécifique des courbes à la Figure 6.

[0048] A l'aide de ces régressions non - linéaires rationnelles (Cayley et al. 2000, figure 1) de modéliser le volume cellulaire aqueux (Vc) en fonction d'OSMp. Du coup, via la valeur paramétrique α2 nous pouvons aussi estimer la valeur minimale de l'osmolarité en dessus des quelle les BFCP produites à un OSMc particulière risquent d'exploser, Vc tendrant rapidement vers des valeurs extrêmes au delà de 3,0 ul / mg-MS. Ces valeurs minimales de Vc révèlent l'importance de maintenir la molarité de la pré - bouillie à au moins 0,200, voire plus de 0,300 osmolaire. Il est ainsi possible d'assurer l'induction de l'osmotolérance des BFCP, mais aussi la survie dans les bouillies pulvérisables.

[0049] Par exemple, une population bactérienne produite à une mOSMc de 50 devra être toujours en présence d'une mOSMp d'au moins 190 une fois la bouillie pulvérisable restaurée après abolition du facteur de concentration. En ce sens, pour un produit de poids moléculaire (PM) de 80, une concentration du produit de 250 g/L au sein d'une pré - bouillie de 51 L installée pendant 12 heures et préconisant 5 L/ha de produit, il ne faudra pas ajouter plus de 31 L d'eau à la pré - bouillie, créant ainsi une bouillie pulvérisable d'au plus 51 + 31 = 52 L/ha.

Validation via PV = nRT



[0050] L'invention est applicable à toutes les biomasses bactériennes expressément osmotolérantes parce que produites en présence de pression osmogènes de cultue (OSMc) de l'ordre de 0,05 à 1,00 mol/L ; en ce sens ces souches ne sont pas nécessairement halophiles mais plus simplement osmotolérantes. Les volumes qu'occuperont les cytosols de ces microorganismes à diverses OSMc et OSMp (osmolarité de plasmolyses ; Tableau 6) sont fonction du volume osmoactif (Vosmoactif ; ul/mg-protéine microbienne) de ces cellules, en non du volume non-osmoactif (Vnonosmoactif). Or, en raison de l'équation empirique [Vc = α1 / (OSMp + α2) + Vc,min,] applicable au volume cellulaires bactériens (supra, equation (1)), ces volumes peuvent être exprimés en termes de pressions, et cela grossièrement en accord avec la loi universelle régissant le volume d'un gaz (parfait), soit ;

  • p est la pression du gaz (pascal) ;
  • V est le volume occupé par le gaz (mètre cube) ;
  • n est la quantité de matière (mole) ; ne pas confondre avec N est le nombre de particules ;
  • R est la constante universelle des gaz parfaits :R = 8,314 472 J·K-1·mol-1
  • T est la température absolue (en kelvin) ;


[0051] De plus, selon Klipp et al. 2005 et Cayley et al. 1991, 2000 ;





[0052] C'est comme de raison le volume osmoactif (Vosmoactif), i.e. le volume cellulaire affecté par la pression osmotique externe (πe), qui dictera ainsi quel pression cellulaire interne (πi) il faut maintenir pour assurer la turgescence de la bactérie. Il est donc ainsi possible de démontrer que la pression intercellulaire (πi) est égale à ;



[0053] De même, il est aussi possible de démontrer que la pression extracellulaire (πe) à maintenir pour éviter une perte de turgescence cellulaire (bactérienne) est elle égale à ;



[0054] Le volume de la bouillie, Vbouillie, est en effet celui de la solution minérale in baco extérieur à cellule microbienne tel que prescrit à titre d'exemple de mode de réalisation supra aux Tableaux 4, 5a, 5b et 5c. En effet, les volumes des pré - bouillies (Tableau 4) et les volumes d'eau à leur ajouter afin d'obtenir un volume de bouillie respectant OSMp (Tableaux 5a, 5b et 5c) peuvent ainsi être directement obtenus pour une gamme de produits minéraux fertilisants, et cela ici afin d'assurer une mOSM d'environ 500 favorable à l'induction de l'osmotolérance de bactéries moyennement halophiles (cf. Tableaux 1 et 2). Comme de raison, il est aussi loisible de compléter ces tableaux pour d'autre produits aux poids moléculaires (PM) et concentrations différents.

[0055] Toujours est-il que pour que la turgescence des cellules microbiennes ne soit pas affectée par leur immersion dans le bac du pulvérisateur contenant les sels fertilisants, il faut donc que πinterne= πexterne (πi = πe), ce qui amène l'équation suivante ;



[0056] Donc, pour valider que le Vosmoactif fonction de OSMc (Tableau 6, Figure 6), et donc la turgescence des cellules microbienne sont effectivement préservés, il suffit de s'assurer que Vosmoactif et Vbouille sont proportionnels, voire dans une relation quasi linéairement (Figure 7). A noter que pour ce faire, il est important d'exprimer Vbouille non pas en L/ha, mais bien en L/kg de sel fertilisant de manière à rendre Vbouillie directement comparable à Vosmoactif exprimé lui aussi pondéralement (uL/mg de protéine protéine). Les unités de Vosmoactif et Vbouillie sont ainsi commensurables ; [uL, L : mg, Kg]. Une fois cette transformation des Vbouille repérés aux Figures 4 et 5 effectuée, cette proportionnalité des Vosmoactif et Vbouillie est reproduite graphiquement à la Figure 7 ; à noter qu'elle ne dépends pas de la concentration et ou des dose-hectare des produits, mais seulement de leurs poids moléculaire (PM ; g/mol), soit ici et à titre d'exemple de 80 à 113.

[0057] Selon la Figure 7, le pouvoir osmogène des sels est de 40 à 60 fois, selon le PM du sel fertilisant, plus important que celui des protéines bactériennes. Or, cela est cohérent avec une PM moyen aux alentours de 5 000 (5 kDa) pour l'ensemble des protéines et/ou peptides bactériens. En effet, bien que le poids usuel d'une protéine bactérienne est plus élevé, de l'ordre de 10 à 12 kDa, cela ne comprend que les protéines complètement assemblées. Le cytosol bactérien est en effet composés non seulement de telles protéines fonctionnelles, mais aussi et surtout de leurs parties nécessairement plus petites.

Impacts agronomiques escomptés (voir aussi data Bonaterrea et al. 2007)



[0058] L'application agronomique de l'invention permettra d'induire en temps utile l'osmotolérance des BFCP expressément isolées et produites à cet effet, et cela tout en préservant l'intégrité des cellules bactériennes ainsi plus osmotolérantes au moment de leur application in situ (in folio). En effet, l'osmotolérance bactérienne est souvent assez transitoire, ou moins non constitutive ; la valorisation agronomique est donc souvent problématique en raison d'un décalage entre le moment d'application foliaire de tels inoculum et l'activation métabolique de la cellule, y compris de son osmotolérance. De plus, cette osmotolérance est particulièrement requise si ladite application foliaire ce fait conjointement à celle de sels fertilisants ; l'évaporation de l'eau à la surface du feuillage va ainsi très rapidement concentrer les sels provoquant une importante pression osmotique subie par les bactéries.

[0059] Ce type de BFCP a priori osmotolérantes, voire encore plus avantageusement chitinolytiques, et maintenant induites statiquement seront d'autant plus efficaces entant qu'agents fongistatiques, stomatoactifs capables par exemple d'augmenter la conductivité stomatique (gs ; mole/m2/sec).

[0060] A titre illustratif à ce stade, voir ici la Figure 2 résumant graphiquement les données de Bonaterra et al. 2005 et 2007. Les deux expérimentations concernent des bactéries osmo - adaptées à 0,5 MNACl (figure du haut ; data Bonaterra 2005) et 0,7 MNaCl (figure du bas ; data Bonaterra 2007). A titre illustratif j'ai donc placé une courbe (en pointillé) escomptant la survie de telles bactéries dont l'osmolarité de la suspension (bouillie) aurait été ajusté en fonction de leurs l'osmolarités de croissance (OSMc) au sens de la présente invention. A noter enfin que ces cinétiques décrivent la mortalité bactérienne due à la dessiccation in vitro ; celle ci est parfaitement corrélée à la survie in vivo (in folio) de telles bactéries (eg. Bonaterra et al. 2007, figs. 3b et 3e ) et sert donc souvent ainsi de mesure de substitution.

SIGLES ET DEFINITIONS



[0061] 
BFCP : bactéries favorisant la croissance des plantes mOSM : milli-osmolarité
SDN : stimulation des défenses naturelles (de la plante) OSMc : osmolarité ce croissance
GG : glucosyl-glycérol OSMp : osmolarité de plasmolyse
GGate : glucosyl-glycérate Vc (Vc,min) : volume cellulaire (aqueux), minimum
GgpS : GG phosphate synthase Vbouillie : volume (L) de la bouillie pulverisable
GgpP : GG phosphate phosphatase Vosmoactif : volume osmoactif du cytosol bactérien
NAGGN : N-acetylglutaminylglutamine amide Vnonosmoactif : volume non-osmoactif du cytosol bactérien
CMC : carboxy-methyl-cellulose    

Facteur de concentration : inverse du rapport entre la (milli-)osmolarité (mOSM) de la bouillie pulvérisable et le seuil critique osmolaire préétabli induisant la production et/ou la suraccumulation d'osmolytes compatibles. Il permet d'établir de facto le volume de la pré-bouillie.

Pré-bouillie : mélange de sels fertilisants osmogènes, et éventuellement d'inocula dans un volume d'eau inférieur par un certain facteur de concentration à celui de la bouillie pulvérisable.

Bouillie pulvérisable : mélange de sels osmogènes dans un volume d'eau préconisé pour leur application foliaire.

in baco : directement dans le bac du pulvérisateur (cf. in vitro, in situ, in planta, in silico, in saco, etc.)

Induction statique : mécanisme d'adaptation des cellules bactériennes à des stresses - osmotique en particulier, par simple exposition, sans croissance des populations. En principe l'induction statique est à opposée à l'induction dynamique à de tels stresses suite à la croissance des population en milieux de culture enrichis.

(milli-)Osmolarité (mOSM) : somme théorique des pressions osmotiques attribuable à l'ensemble des molécules ioniques et/ou ou osmotiquement actives dans une solution. A ne pas confondre avec l'osmolaité, i.e. la pression osmotique de ladite solution telle que mesurée, et ne pouvant être calculée.

Osmola(r)ité de croissance / de plasmolyse : l'osmolarité des milieux de culture lors de la croissance des bactéries est dite osmolarité de croissance (OSMc). Celle-ci dictera l'osmolarité de plasmolyse (OSMp), mesure obtenue par titrage - NaCl (Cayley et al. 2000) indiquant le niveau d'osmo-tolérance d'une bactérie ainsi capable de réduire au maximum son volume cellulaire avant d'imploser définitivement.

Osmotolérance : état induit d'un (micro)organisme, une bactérie non sporulante par exemple, lui permettant survivre, voire activement, à un stress osmotique non bactéricide bien que potentiellement bactériostatique.

Halophilie : état constitutif d'un (micro)organisme, une bactérie non sporulante par exemple, lui permettant survivre, voire activement, à un stress osmotique non bactéricide bien que potentiellement bactériostatique.

Osmolyte compatible : molécule osmotiquement actives mais non ou peu toxique pour la cellule microbienne ou végétale prélevée par celle-ci en réponse à une pression osmotique de façon à permettre l'exclusion d'osmolytes plus toxiques - tel que sodium ou le chlore, tout en maintenant une pression intracellulaire viable.

Phyllosphère : surface et tissus histologiques superficiels des feuilles (feuillage) ; ne pas confondre avec phylloplan désignant que la surface des feuilles.


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[0062] 

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Revendications

1. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes caractérisé en ce que les bouillies sont réalisées en deux temps ;

(i) création dans un premier temps de pré - bouillies plus concentrées en sels fertilisants que les susdites bouillies par un facteur de concentration permettant d'atteindre une milliosmolarité (mOSM) critique responsable de l'induction statique de l'osmotolérance des susdites populations bactériennes a priori osmotolérantes, et

(ii) abolition dans une deuxième temps et après une certaine période d'induction statique de ce facteur de concentration par dilution desdites pré - bouillies jusqu'à un volume correspondant au volume préconisé pour de telles bouillies pulvérisables contenant des populations osmotolérantes.


 
2. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la première revendication caractérisé en ce que les populations bactériennes sont constituées d'espèces bactériennes Gram négatives (Gram-).
 
3. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la première revendication caractérisé en ce que les populations bactériennes sont constituées d'espèces bactériennes Gram positives (Gram+).
 
4. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la milliosmolarité (mOSM) critique de la pré - bouillie concentrée est comprise entre 330 et 1 250, et avantageusement aux alentours de 500.
 
5. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la période d'induction statique est comprise entre 6 et 24 heures, plus particulièrement entre 8 et 18 heures, et plus usuellement d'environs 12 heures.
 
6. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la dilution des pré - bouillies est effectuée par l'apport d'un volume aqueux fonction de la dose hectare (L/ha) du produit, du poids moléculaire des sels fertilisants le constituant (g/mole), et leurs concentrations dans le produit (g-sel/L) respectant une mOSM minimale de la bouillie fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc) appliquée lors production des populations bactériennes en milieux liquides et/ou solide.
 
7. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la revendication précédente caractérisé en ce que la mOSM minimale fonction de l'osmolarité de croissance (OSMc) appliquée lors production des populations bactériennes en milieux liquides et/ou solide est elle fonction de l'osmolarité de plasmolyse (OSMp) de ces populations bactériennes.
 
8. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'osmolarité de plasmolyse (OSMp) de ces populations bactériennes est elle donnée par la le paramètre α2 (mOSM) de la relation décrivant le volume cellulaire, Vc (uL/mg de protéine bactérienne), desdites bactéries en fonction d'OSMPp, à savoir [Vc = α1 / (OSMp + α2) + Vc,min,] où Vc,min et le volume cellulaire minimal atteint en fonction d'OSMp et α1 est un autre paramètre empirique (uL/mg de protéine bactérienne).
 
9. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les populations bactériennes a priori osmotolérantes sont produites par fermentation liquide et/ou solide en présence de milli - osmolarités de croissance (OSMc) comprises entre 50 et 1 000, plus particulièrement entre 200 et 800, et avantageusement entre 300 et 600.
 
10. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le facteur de concentration à abolir est compris entre 3,8 et 113 et cela selon la concentration (g-sel/L) des sels fertilisant, le poids moléculaire (PM) de ceux-ci et la quantité de produit préconisé par hectare (i.e. dose-hectare en g, Kg ou L par hectare), voire - le cas échéant, l'osmolarité de la fraction soluble de la formulation solide et/ou liquide, de ladite préparation bactérienne.
 
11. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la revendication précédente caractérisé en ce que la milliosmolarité (mOSM) de la bouillie une fois ledit facteur de concentration aboli par dilution aqueuse ne doit pas elle être inférieure à des valeurs comprises entre 175 et 360, plus avantageusement entre 190 et 330, notamment dans le cas de bactéries produites en présence d'OSMc (omolarités de croissance) les plus élevées, soit ici de l'ordre de 1,00.
 
12. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les populations bactériennes sont chitinolytiques.
 
13. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les populations bactériennes a priori osmotolérantes proviennent de familles taxonomiques choisies parmi un groupe comprenant les Xanthomonadaceae et les Pseudomonadaceae.
 
14. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon la revendication précédente caractérisé en ce que les populations bactériennes a priori osmotolérantes proviennent du genre Stenotrophomonas.
 
15. Procédé de préparation de bouillies inoculantes pulvérisables comprenant des populations bactériennes osmotolérantes selon une quelconque des deux revendications précédentes caractérisé en ce que les populations bactériennes a priori osmotolérantes produisent comme osmolyte compatible du glucosyl-glycérol (GG) et/ou du glucosyl-glycerate (GGate).
 




Dessins






















Rapport de recherche















Rapport de recherche




Références citées

RÉFÉRENCES CITÉES DANS LA DESCRIPTION



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