Mikroorganismen mit reduzierter Enzymaktivität

Abstract

 Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismen mit einer reduzierten Enzymaktivität sowie deren Einsatz zur Herstellung von Aldehyden.

Beschreibung

Gebiet der Erfindung

[0001] Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismen mit einer reduzierten Enzymaktivität sowie deren Einsatz zur Herstellung von Aldehyden.

Stand der Technik

[0002] Aldehyde sind wichtige Produkte und Intermediate in der Chemie. Ein wichtiger Einsatzbereich für kurzkettige Aldehyde ist z.B. die Herstellung von Weichmacheralkoholen, wie Butanol oder 2-Ethylhexanol aus Butyraldehyd. Aldehyde werden heutzutage primär aus petrochemischen Rohstoffen chemisch hergestellt. Butyraldehyd wird z.B. aus Propylen und Synthesegas gewonnen.

[0003] Die Aufgabe dieser Erfindung bestand darin ein neues biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Aldehyden zu entwickeln. Dabei wurde überraschend festgestellt, dass Organismen, die in der Lage sind die Alkane terminal zu oxidieren, vermehrt die entsprechenden Aldehyde bilden, wenn die Aktivität von einzelnen oder mehreren ausgewählten Aldehyd-Dehydrogenasen gezielt reduziert wurde.

[0004] Alkangase sind dabei eine alternative attraktive Rohstoffquelle. Chemisch sind diese nur sehr schwer nutzbar zu machen, daher steht heutzutage lediglich die energetische Nutzung im Vordergrund. Biologisch gibt es jedoch eine Vielzahl von Enzymen und Organismen, die auch kurzkettige Alkane C2-C9 selektiv aktivieren können. In der Literatur beschriebene Enzymsysteme bzw. Organismen sind z.B. alkB Monooxygenase aus P. putida, P450 Monooxygenasen oder Butane Monooxygenasen aus Thauera butanivorans (Shennen, 2006, J Chem, Technol. Biotechnol., 81, 237-256; Beilen, Funhoff, Curr. Op. Biotech. 2005, 16,308-314).

[0005] Die biotechnologische Herstellung von Butyraldehyd wurde bisher in zwei Patentanmeldungen beschrieben (WO2013/067325 - Microbial production of n-butyraldehyde; WO2012/112416-Method for producing butyraldehyde). In WO2013/067325 wurde die die Bildung von Butyraldehyd durch die heterologe Expression geeigneter Enzyme (atoB, crt, hdb, bldh) in Kombination mit knock-out mindestens eines natürlichen Genes (IdhA, adhE, frdBC, pta and yqhD) erzielt. WO2012/112416 beschriebt die Bildung von Butyraldehyd durch Reduktion oder knock-out von Enzymen des Butyraldehyd-Abbaus (z.B. Butanol (oder Alkohol) Dehydrogenase, Butyraldehyde Dehydrogenase, Lactate Dehydrogenase, hydrogen-evolving Hydrogenase oder Format Dehydrogenase und der möglichen Erhöhung einer Butyraldehyd dehydrogenase Aktivität. Der Einsatz bzw. die Kombination mit Alkan-oxidierenden Organismen ist hier jedoch nicht aufgeführt.

[0006] In dieser Erfindung wurde die Bildung von Aldehyden (C2-C9) aus Alkanen (C2-C9) durch eine reduzierte Aktivität oder knock-out einer oder mehrerer bisher unbekannter Aldehyd Dehydrogenasen des Organismus Thauera butanivorans ermöglicht:

[0007] Für den Organismus Thauera butanivorans sind zwei Alkohol Dehydrogenasen des Butan Metabolismus untersucht (Vangnai and Arp, 2001, 147, 745-756; Vangnai et al., 2002, J. Bacteriol. 184, 1916-1924), BOH (Accession Nummer AF326086) und BDH (Accession Nummer 355798). Wenn eine der beiden Gene ausgeschaltet wurde, konnte auf Butan ein verringertes Wachstum beobachtet werden. Wenn beide Gene ausgeschaltet wurden, war kein Wachstum mehr auf Butan festzustellen. Bei Zellen der Doppelmutante, die zunächst auf Citrat angezogen und dann mit Butan inkubiert wurden, könnten Spuren von Butanol gefunden werden (<< 1 ppm). Eine Butyraldehyd Bildung wurde nicht beschrieben. In-vitro wurde für beide Enzyme neben der primären Butanol Dehydrogenase Aktivität auch eine verringerte Butyraldehyd Dehydrogenase Aktivität gemessen.

[0008] Aufgabe der Erfindung war es, Organismen bereitzustellen, die hervorragende Biokatalysatoren zur Herstellung von kurzkettigen Aldehyden darstellen.

Beschreibung der Erfindung

[0009] Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebenen Mikroorganismen einen Beitrag zur Lösung der gestellten Aufgabe leisten können.

[0010] Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Mikroorganismen mit einer ersten genetischen Modifikation, die zur Reduktion einer Butyraldehyd-Dehydrogenase-Aktivität einer oder mehrerer bestimmter Proteinsequenzen führt.

[0011] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von kurzkettigen Aldehyden unter Einsatz vorgenannter Organismen.

[0012] Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Raum-Zeit-Ausbeute und Kohlenstoffausbeute des Verfahrens erhöht ist, verglichen zu Mikroorganismen, die keine erste genetischen Modifikation enthalten, welche zur Reduktion einer Butyraldehyd-Dehydrogenase-Aktivität einer oder mehrerer bestimmter Proteinsequenzen führt.

[0013] Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Produktkonzentration im Kulturüberstand erhöht wird, so dass eine effiziente Aufarbeitung erleichtert wird.

[0014] Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Mikroorganismus aufweisend eine erste genetische Modifikation, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine erniedrigte Aktivität eines Enzymes E₁ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Gruppe der Proteine aufweisend die, bevorzugt bestehend aus den, Polypeptidsequenzen Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 und Seq ID Nr. 28,
sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 5%, bevorzugt bis zu 4%, insbesondere bis zu 3%, besonders bevorzugt bis zu 2%, insbesondere besonders bevorzugt bis zu 1%, der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, und Seq ID Nr. 28,
sowie bei denen bis zu 2%, bevorzugt bis zu 1%, der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16 und Seq ID Nr. 26 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind
und die noch mindestens 50%, bevorzugt noch mindestens 65%, besonders bevorzugt noch mindestens 80%, insbesondere noch mindestens 90%, der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 und Seq ID Nr. 28, besitzen,
wobei unter enzymatische Aktivität für ein Enzym E₁ die Fähigkeit verstanden wird, Butanal, Wasser und NAD+, NADP+, FAD oder oxidiertes PQQ zu n-Butansäure und NADH, NADPH, FADH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

[0015] Unter einem "Wildtyp" einer Zelle wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt der Ausgangsstamm verstanden, aus dem die erfindungsgemäße Zelle durch gentechnische Manipulation an den genetischen Elementen, die für die Aktivitäten der Enzyme der genannten Seq ID Nr. verantwortlich sind, hervorgegangen ist.

[0016] Der Begriff "erniedrigte Aktivität eines Enzyms" ist vorzugsweise als erniedrigte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.

[0017] Es ist trivial und nur der Vollständigkeit halber erwähnt, dass, um eine verglichen zum Wildtyp einer Zelle gesteigerte oder erniedrigte Aktivität zu bestimmen, eine Wildtyp-Referenz-Kultur eingesetzt wird, die denselben Bedingungen ausgesetzt wurde, wie die der zu bestimmende Probe.

[0018] Änderungen von Aminosäureresten einer gegebenen Polypeptidsequenz, die zu keinen wesentlichen Änderungen der Eigenschaften und Funktion des gegebenen Polypeptides führen, sind dem Fachmann bekannt. So können beispielsweise sogenannte konservierte Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden; Beispiele für solche geeigneten Aminosäuresubstitutionen sind: Ala gegen Ser; Arg gegen Lys; Asn gegen Gin oder His; Asp gegen Glu; Cys gegen Ser; Gin gegen Asn; Glu gegen Asp; Gly gegen Pro; His gegen Asn oder Gin; Ile gegen Leu oder Val; Leu gegen Met oder Val; Lys gegen Arg oder Gin oder Glu; Met gegen Leu oder Ile; Phe gegen Met oder Leu oder Tyr; Ser gegen Thr; Thr gegen Ser; Trp gegen Tyr; Tyr gegen Trp oder Phe; Val gegen Ile oder Leu. Ebenso ist bekannt, dass Änderungen besonders am N- oder C-Terminus eines Polypeptides in Form von beispielsweise Aminosäureinsertionen oder -deletionen oft keinen wesentlichen Einfluss auf die Funktion des Polypeptides ausüben.

[0019] Die "Aminosäure-Identität" im Zusammenhang mit den im Rahmen der Erfindung genutzten Enzyme wird mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich

[0020] GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410. Das BLAST-Programm kann erhalten werden vom National Center For Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., vorstehend).

[0021] Der bekannte Smith-Waterman Algorithmus kann ebenso zur Bestimmung der von Identitäten verwendet werden.

[0022] Bevorzugte Parameter für die Bestimmung der "Aminosäure-Identität" sind bei Verwendung des BLASTP-Programms (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410:

Expect Threshold:	10
Word size:	3
Matrix:	BLOSUM62
Gap costs:	Existence: 11; Extension: 1
Compositional adjustments:	Conditional compositional score matrix adjustment

[0023] Die vorstehenden Parameter sind die default-Parameter im Aminosäuresequenzvergleich. Das GAP-Programm ist ebenso zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Eine Identität von 60% gemäß dem vorstehenden Algorithmus bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 60% Identität. Das gleiche gilt für höhere Identitäten.

[0024] Unter der verwendeten Formulierung "verringerte Aktivität eines Enzyms E_x" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verringerte Aktivität verstanden. Die Formulierung "verringerte Aktivität" beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität ("Aktivität von null"). Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen.

[0025] Verfahren zur Verringerung von enzymatischen Aktivitäten in Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere molekularbiologische Techniken bieten sich hier an. Enzymaktivitätsverringerung speziell für Thauera, insbesondere zum Unterbrechen spezieller Gene findet der Fachmann beispielsweise in Vangnai and Arp, 2001, 147, 745-756.

[0026] Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Begriff n-Butanal, n-Butyraldehyd, Butanal und Butyraldehyd synonym verwendet.

[0027] Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.

[0028] Erfindungsgemäß bevorzugte Mikroorganismen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung der enzymatischen Aktivität erreicht wird durch Modifikation eines Genes umfassend eine der Nukleinsäuresequenzen, die für die Polypeptidsequenzen Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 und Seq ID Nr. 28 sowie die oben genannten Sequenzen mit entsprechenden Sequenzidentitäten kodieren, insbesondere Seq ID Nr. 1, Seq ID Nr. 3, Seq ID Nr. 5, Seq ID Nr. 7, Seq ID Nr. 9, Seq ID Nr. 11, Seq ID Nr. 13, Seq ID Nr. 15, Seq ID Nr. 17, Seq ID Nr. 19, Seq ID Nr. 21, Seq ID Nr. 23, Seq ID Nr. 25 und Seq ID Nr. 27, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Insertion von Fremd-DNA in das Gen, Deletion mindestens von Teilen des Gens, Punktmutationen in der Gensequenz, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-RNA oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, wie etwa Promotoren und Terminatoren oder von Ribosomenbindestellen, welche das Gen flankieren.

[0029] Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehen, die dem Gen (und nicht dem Organismus) "fremd" ist, d.h. auch endogene DNA-Sequenzen können in diesem Zusammenhang als "Fremd-DNA" fungieren.

[0030] In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Gen durch Insertion eines Selektionsmarkergens unterbrochen wird, somit die Fremd-DNA ein Selektionsmarkergen ist, wobei bevorzugt die Insertion durch homologe Rekombination in den Genlocus erfolgte.

[0031] Unter der enzymatischen Aktivität für ein Enzym E₁ wird insbesondere die Fähigkeit verstanden, Butanal, Wasser und NAD+, NADP+, FAD oder oxidiertes PQQ zu n-Butansäure und NADH, NADPH, FADH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

[0032] Die Bestimmung der Enzymaktivität des Enzyms E₁ wird basierend auf dem Prinzip des optischenzymatischen Tests nach Warburg und Christian, welche vom Lambert-Beerschen-Gesetz abgeleitet ist, berechnet. Dabei wird 1 Unit (U) als die Menge Enzym definiert, durch die 1 µmol Substrat in einer Minute umgesetzt wird. Ein Ansatz zur Messung der Aktivität eines NAD(P)⁺-abhängigen Enzyms E₁ kann beispielsweise ein Volumen von 1 mL besitzen und enthält 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8, 1 mM DTT, 2 mM Butyraldehyd und 4 mM NAD⁺ oder NADP⁺. Die Messung der Extinktionszunahme bei 340 nm erfolgt nach Zugabe der Enzymlösung über einen Zeitraum von 60 s bei einer Temperatur von 37 °C. Ein Ansatz zur Messung der Aktivität eines FAD- oder PQQ-abhängigen Enzyms E₁ kann beispielsweise ein Volumen von 1 mL besitzen und enthält 10 µmol Kaliumferricyanid, 0,5 mL Mcllvaine-Puffer, pH 4,5, 1 mM DTT und 2 mM Butyraldehyd. Die Reaktion wird durch Zugabe der Enzymlösung gestartet, 10 min bei 25°C inkubiert und durch Zugabe von 0,5 mL Eisen-Dupanol-Reagenz gestoppt. Dann werden 3,5 mL Wasser zugegeben und für weitere 30 min bei 25°C inkubiert. Anschließend wird die Extinktion bei 660 nm gemessen.

[0033] Ein erfindungsgemäß bevorzugter Mikroorganismus ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine zweite genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine erniedrigte Aktivität eines Enzymes E₁ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Proteine aufweisend die Polypeptidsequenzen Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32,
sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 10%, bevorzugt bis zu 5%, insbesondere bis zu 3%, besonders bevorzugt bis zu 2%, insbesondere besonders bevorzugt bis zu 1%, der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind
und die noch mindestens 50%, bevorzugt noch mindestens 65%, besonders bevorzugt noch mindestens 80%, insbesondere noch mindestens 90 %, der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32 besitzen,
Dies hat den technischen Effekt, dass die Ausbeute an Aldehyd gesteigert werden kann. Erfindungsgemäß ist ein Mikroorganismus bevorzugt, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Hefen und Bakterien, bevorzugt gram negativen Bakterien, insbesondere ausgewählt aus der Gattung Thauera, wobei Thauera butanivorans besonders bevorzugt ist..

[0034] Zur weiteren Ausbeutesteigerung kann es vorteilhaft sein und ist daher bevorzugt, wenn der erfindungsgemäße Mikroorganismus eine dritte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzymes E₂ aufweist, ausgewählt aus der Gruppe der Alkanmonooxygenasen der EC 1.14.15.3, wobei unter der enzymatischen Aktivität für ein Enzym E₂ insbesondere die Fähigkeit verstanden wird, Butan, Wasser und NAD+, NADP+ oder oxidiertes PQQ zu Butanol und NADH, NADPH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

[0035] Der Begriff "gesteigerte Aktivität eines Enzyms" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.

[0036] Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopiezahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor oder eine verbesserte Ribosomenbindungsstelle verwendet, eine negative Regulation der Genexpression, beispielsweise durch Transkriptionsregulatoren, abschwächt, oder eine positive Regulation der Genexpression, beispielsweise durch Transkriptionsregulatoren, verstärkt, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Mikroorganismen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und gegebenenfalls einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.

[0037] Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.

[0038] Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschliessende optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedback-, produkt- oder substrat-inhibierbar sind.
Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Synthese eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopiezahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopiezahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Bevorzugte erfindungsgemäße Mikroorganismen erreichen demnach eine "verglichen zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x" durch eine Überexpression des Enzyms E_x. Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung "eine verglichen zum Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x" ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E_x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche "verglichen zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff "Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung "Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Synthese des Enzyms E_x induziert wird.

[0039] Bevorzugte Alkanmonooxygenasen der EC 1.14.15.3, deren Aktivität verglichen zum Wildtyp erfindungsgemäß bevorzugt gesteigert ist, sind ausgewählt aus der Gruppe der Oxidoreduktasen vom AlkB-Typ, die insbesondere in der EP2788493 offenbart werden. Die in der EP2788493 als bevorzugt ausgewiesenen Oxidoreduktasen vom AlkB-Typ werden auch vorliegend erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzt.

[0040] Zur weiteren Ausbeutesteigerung kann es vorteilhaft sein und ist daher bevorzugt, wenn der erfindungsgemäße Mikroorganismus eine vierte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzymes E₃ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Proteine aufweisend die Polypeptidsequenzen WP_010966572.1, AAA23206.1, WP_034583347.1, WP_010966571.1, WP_034583350.1, WP_015616006.1, WP_026881898.1, WP_021655913.1, WP_010235517.1, WP_004455109.1, WP_026881497.1, WP_003486653.1, KG012652.1, WP_030034651.1, WP_003491005.1, WP_021106349.1, WP_012342913.1, WP_003362274.1, WP_003358614.1, WP_003401772.1, WP_014520521.1, WP_029452360.1, WP_007063868.1, WP_011949005.1, WP_011988245.1, WP_021284504.1, WP_025775882.1, WP_031369326.1, WP_031368191.1, WP_032077777.1, WP_023437247.1, WP_011098713.1, WP_033064364.1, WP_017415560.1, WP_017752786.1, WP_039657965.1, WP_007785525.1, WP_027638413.1, WP_014554180.1, WP_039636789.1, WP_009167516.1, WP_035786301.1, WP_027098116.1, WP_017352673.1, WP_012424272.1, WP_039769752.1, WP_035285659.1, WP_017213095.1, EEH98657.1, WP_026886109.1, WP_012058635.1, WP_041084633.1, WP_012449920.1, AHF06812.1, WP_040191544.1, WP_003371527.1, WP_021135040.1, WP_039231326.1, WP_008689032.1, WP_039221935.1, WP_003380845.1, WP_003375593.1, WP_008978928.1, WP_039229275.1, WP_039281897.1, WP_003363691.1, WP_039238494.1, WP_039256218.1, WP_039250085.1, WP_011721631.1, WP_013724912.1, WP_029169607.1, WP_039257472.1, WP_022420904.1, WP_009274567.1, WP_004798344.1, WP_039310701.1, WP_039277494.1, WP_039259348.1, WP_002596985.1, WP_022156508.1, WP_009269781.1, WP_008818561.1, WP_002607351.1, WP_006440315.1, WP_003500280.1, WP_021640844.1, WP_003509166.1, WP_024739697.1, WP_009298920.1, WP_007788299.1, WP_007049187.1, WP_035146363.1, WP_038322630.1, WP_006189666.1, WP_016518391.1, WP_012200477.1, WP_016524303.1, WP_010076251.1 und AIW89961.1, sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 10%, bevorzugt bis zu 5%, insbesondere bis zu 3%, besonders bevorzugt bis zu 2%, insbesondere besonders bevorzugt bis zu 1%, der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannter Accession Nummern durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind
und die noch mindestens 50%, bevorzugt noch mindestens 65%, besonders bevorzugt noch mindestens 80%, insbesondere noch mindestens 90 %, der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen vorgenannten Accession Nummer besitzen,
Unter der enzymatischen Aktivität für ein Enzym E₃ wird insbesondere die Fähigkeit verstanden, Butanol, Wasser und NAD+, NADP+ oder oxidiertes PQQ zu Butanal und NADH, NADPH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

[0041] Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angeführten Accession-Nummern entsprechen den ProteinBank Datenbank-Einträgen des NCBI mit Datum vom 10.02.2015; in der Regel wird vorliegend die Versionsnummer des Eintrages durch ".Ziffer" wie beispielsweise ".1", kenntlich gemacht.

[0042] Zur weiteren Ausbeutesteigerung kann es vorteilhaft sein und ist daher bevorzugt, wenn der erfindungsgemäße Mikroorganismus eine fünfte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität eines mindestens Enzymes E₄ aufweist, welches den Import eines Alkans mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen, insbesondere Butan, in den Mikroorganismus hinein katalysiert. Bevorzugte Enzyme E₄ sind ausgewählt aus der Gruppe der Polypeptidsequenzen kodiert durch ein alkl Gen.

[0043] Unter dem Begriff "alkL-Gen" werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Gene verstanden, die für Proteine kodieren, die mindestens eine der nachfolgenden beiden Bedingungen erfüllen:

1.) Das Protein wird als ein Mitglied der Superfamilie der OmpW-Proteine (Proteinfamilie 3922 in der "Conserved Domain Database" (CDD) des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI)) identifiziert, wobei diese Zuordnung durch ein Alignment der Aminosäuresequenz des Proteins mit den in der CDD des NCBI vorhandenen Datenbankeinträgen, die bis zum 22.03.2010 hinterlegt wurden, unter Nutzung der Standardsuchparameter, einem E-Wert (englisch "e-value") kleiner 0,01 und unter Verwendung des Algorithmus "blastp 2.2.23+", erfolgt,

2.) bei einer Suche nach in der betreffenden Aminosäuresequenz enthaltenen konservierten Proteindomänen in der NCBI CDD (Version 2.20) mittels RPS-BLAST wird die Präsenz der konservierten Domäne "OmpW, Outer membrane protein W" (COG3047) mit einem E-Wert (englisch "e-value") kleiner 1 x 10^-5 festgestellt (englisch "domain hit").

[0044] Besonders bevorzugte Enzyme E₄ sind ausgewählt aus der Gruppe der Polypeptidsequenzen kodiert von einem alkL-Gen aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe der gram-negativen Bakterien, insbesondere der Gruppe enthaltend, bevorzugt bestehend aus Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Desulfitobacterium sp., Burkholderia sp., bevorzugt Burkholderia cepacia, Xanthomonas sp., Rhodobacter sp., Ralstonia sp., Delftia sp.und Rickettsia sp., Oceanicaulis sp., Caulobacter sp., Marinobacter sp. und Rhodopseudomonas sp., bevorzugt Pseudomonas putida, Oceanicaulis alexandrii, Marinobacter aquaeolei, insbesondere Pseudomonas putida GPo1 und P1, Oceanicaulis alexandrii HTCC2633, Caulobacter sp. K31 und Marinobacter aquaeolei VT8, ganz besonders bevorzugt aus Pseudomonas putida GPo1 und P1 und aus Proteinen aufweisend die Polypeptidsequenzen YP_009076010.1, WP_032489564.1, WP_022963140.1, CAB69081.1, WP_020798869.1, WP_040110242.1, AJA11745.1, EXS68633.1, AHI32885.1, WP_022991857.1, WP_011783980.1, WP_040613339.1, EAP90277.1, WP_008170303.1, WP_012275116.1, WP_023008031.1, WP_036784183.1, WP_037483133.1 und WP_023010670.1, sowie den Polypeptidsequenzen bei der bis zu 25%, bevorzugt bis zu 20%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannter Accession Nummern durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 10%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 80%, insbesondere mehr als 90% der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der vorgenannter Accession Nummer besitzen, wobei unter enzymatischer Aktivität für ein Enzym E₄ die Fähigkeit verstanden wird, ein Alkan mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen, insbesondere Butan, in den Mikroorganismus zu importieren.

[0045] Ein weiterer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen umfassend die Verfahrensschritte.

A) In Kontakt Bringen der erfindungsgemäßen Mikroorganismen mit einem Medium enthaltend ein Substrat mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen unter Umwandlung des Substrates zu Aldehyd und gegebenenfalls

B) Aufreinigen des Aldehyds.

[0046] Bevorzugt eingesetzte Substrate sind Alkane mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen.

[0047] Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere zur Herstellung von n-Butanal eingesetzt. In diesem Zusammenhang wird als Substrat bevorzugt Butan, insbesondere wenn der eingesetzte Mikroorganismus über die dritte erfindungsgemäße genetische Modifikation verfügt, und/oder Butanol eingesetzt.

[0048] Die erfindungsgemäße Verfahren kann hinsichtlich des in Kontakt Bringens kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von Aldehyden durchgeführt werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas

("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.

[0049] Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Medium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenerMikroorganismen sind im Handbuch " Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

[0050] Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide, wie dies in US 6,01,494 und US 6,136,576 beschrieben ist, von C5-Zuckern oder von Glycerin.

[0051] Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

[0052] Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

[0053] Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden.

[0054] Das erfindungsgemäßen Verfahrens kann bei Atmosphärendruck durchgeführt. Im Falle des Einsatzes gasförmiger Substrate kann es jedoch vorteilhaft sein, Verfahrensschritt A) bei erhöhtem Druck durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Druck in Verfahrensschritt A) mehr als 1,5, 2, 3 oder 4 bar. In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Druck in Verfahrensschritt A) 2 bis 20, bevorzugt 1,5 bis 5, am bevorzugtesten 1,2 bis 2 bar.

[0055] Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn Verfahrensschritt A) in einem Temperaturbereich von 20 °C bis 50 °C, bevorzugt von30 °C bis 37 °C, durchgeführt wird.

[0056] Es kann vorteilhaft sein, in dem erfindungsgemäß Verfahren dem Medium ein weiteres organisches Lösungsmittel zuzusetzen. Dieses kann in Verfahrensschritt B) vorteilhaft dazu eingesetzt werden, das Aldehyd zu extrahieren. Eine Führung als in-situ Extraktion ist ebenfalls möglich und erfindungsgemäß bevorzugt. Bevorzugte organische Lösungsmittel in diesem Zusammenhang sind Hexadekan, 1-Octanol, 5-Methylfurfural und Furfural.

[0057] Verfahrensschritt B) erfolgt vorzugsweise kontinuierlich, wobei es in diesem Zusammenhang weiterhin bevorzugt ist, auch Verfahrensschritt A) kontinuierlich durchzuführen, so dass der gesamte Prozess von der Herstellung des Aldehyds bis zur deren Aufreinigung aus dem Medium kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zur kontinuierlichen Aufreinigung der Aldehyde aus dem Medium wird dieses kontinuierlich über eine Vorrichtung zur Abtrennung der im Verfahren eingesetzten Mikroorganismen, vorzugsweise über einen Filter mit einer Ausschlussgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt, in dem eine Fest/Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreites Medium einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.

[0058] Das hinsichtlich des Aldehyds angereicherte Erzeugnis wird nach der Abtrennung der Mikroorganismen einer vorzugsweise mehrstufigen Trennanlage zugeführt. In dieser Trennanlage sind mehrere hintereinander geschaltete Trennstufen vorgesehen, aus denen bevorzugt jeweils Rückführleitungen ausmünden, die zum Fermentationstank zurückgeführt sind. Weiterhin bevorzugt führen aus den jeweiligen Trennstufen Ableitungen heraus. Die einzelnen Trennstufen können nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten. In der Regel handelt es sich um Membran-Trenneinrichtungen in den einzelnen Trennstufen. Die Auswahl der einzelnen Trennstufen ergibt sich aus Art und Umfang der Gärungsnebenprodukte und Substratreste.

[0059] Verfahrensschritt B) kann auch in der Form einer Elektrodialyse, Umkehrosmose, Ultrafiltration oder Nano-Filtration, in deren Verlauf als Endprodukt eine wässrige Aldehyd-Lösung erhalten wird, ausgeführt werden.

[0060] Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich vorteilhaft zu einem Verfahren zur Herstellung von verzweigten Alkoholen mit einer Kettenlänge von 4 bis 18, insbesondere 8 bis 12, bevorzugt 8, Kohlenstoffatomen, insbesondere 2-Ethylhexanol, ausbauen, indem es um die Verfahrensschritte umfassend

C) Aldolkondensation des Aldehyds unter Wasserabspaltung

D) katalytischen Hydrierung

ergänzt wird.

[0061] Als Katalysator der Aldolkondensation in Verfahrensschritt C) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bevorzugt wasserlösliche, basische Verbindungen, wie z.B. Hydroxide, Hydrogencarbonate, Carbonate, Carboxylate oder ihre Gemische in Form ihrer Alkali-oder Erdalkaliverbindungen eingesetzt.

[0062] Vorzugsweise kommen Alkalihydroxide, wie NaOH, zum Einsatz. Der Katalysator wird bevorzugt gelöst in Wasser eingesetzt, wobei die wässrige Base neben dem organischen Edukt-/Produktgemisch eine zweite flüssige Phase bildet. Der Volumenanteil der wässrigen Phase in Verfahrensschritt C) des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt zwischen 60% und 90%, bevorzugt zwischen 70- 80%, besonders bevorzugt 75% bezogen auf das Gesamtvolumen des zweiphasigen Reaktionsgemisches im Reaktionsraum . Die Konzentration des Alkalikatalysators in der wässrigen Phase in Verfahrensschritt C) liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1% bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,2 - 5 Gew-%, insbesondere von 1-3 Gew.-% bezogen auf die gesamte wässrige Phase. Das während der Reaktion freigesetzte Reaktionswasser reichert sich in der schwereren, wässrigen Phase an. Die organischen Edukte und Produkte bilden die leichtere, organische Phase. Die Reaktionstemperatur der Aldolkondensation liegt typischerweise im Bereich von 80 bis 180 °C. Die Reaktion erfolgt in der Regel unter erhöhten Druck, der durch die Zusammensetzung der organischen und wässrigen Phase im Reaktor bei vorliegender Temperatur bestimmt wird und liegt im Bereich von 1,5 bis 20 bar. Während der Reaktion wird Wärme frei, die aus dem Prozess abgeführt werden muss. Die Reaktionszeit beträgt bevorzugt zwischen 10 bis 20 Minuten. Nach Ablauf der Reaktion wird die Reaktionsmischung bevorzugt in einem Absetzgefäß in eine wässrige Phase und in eine organische Phase durch Phasentrennung aufgetrennt. Das nach Abtrennung der Katalysatorphase erhaltene Produkt kann durch bekannte Verfahren (z.B. Destillation) gereinigt werden.

[0063] Das gereinigte Produkt wir anschließend in Verfahrensschritt D) des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt in der Flüssigphase hydriert. Die katalytische Hydrierung wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 50 und 200 °C durchgeführt. Als Katalysator können geeignete Hydrierkatalysatoren eingesetzt werden, beispielsweise geträgerte Cr-Cu oder Ni-Cu Katalysatoren. Bevorzugt wird die katalytische Hydrierung in Reaktoren bei Drücken von 1 bis 100 bar durchgeführt.

[0064] In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.

Ansprüche

1. Mikroorganismus aufweisend eine erste genetische Modifikation, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine erniedrigte Aktivität eines Enzymes E₁ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Gruppe der Proteine aufweisend die Polypeptidsequenzen Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 und Seq ID Nr. 28,
sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 5% der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, und Seq ID Nr. 28,
sowie bei denen bis zu 2% der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16 und Seq ID Nr. 26 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind
und die noch mindestens 50% der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 26 und Seq ID Nr. 28 besitzen,
wobei unter enzymatische Aktivität für ein Enzym E₁ die Fähigkeit verstanden wird, Butanal, Wasser und NAD+, NADP+, FAD oder oxidiertes PQQ zu n-Butansäure und NADH, NADPH, FADH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

2. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er eine zweite genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine erniedrigte Aktivität eines Enzymes E₁ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Proteine aufweisend die Polypeptidsequenzen Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32,
sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 10% der Aminosäurereste gegenüber Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32 durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind
und die noch mindestens 50% der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen Bezugssequenz Seq ID Nr. 30 und Seq ID Nr. 32 besitzen,

3. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Hefen und Bakterien, bevorzugt gram negativen Bakterien, insbesondere ausgewählt aus der Gattung Thauera.

4. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine dritte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzymes E₂ aufweist, ausgewählt aus der Gruppe der Alkanmonooxygenasen der EC 1.14.15.3, wobei unter der enzymatischen Aktivität für ein Enzym E₂ insbesondere die Fähigkeit verstanden wird, Butan, Wasser und NAD+, NADP+ oder oxidiertes PQQ zu Butanol und NADH, NADPH oder reduziertem PQQ umzusetzen.

5. Mikroorganismus gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkanmonooxygenase ausgewählt ist aus der Gruppe der Oxidoreduktasen vom AlkB-Typ,

6. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine vierte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität mindestens eines Enzymes E₃ aufweist, ausgewählt aus mindestens einem der Proteine aufweisend die Polypeptidsequenzen WP_010966572.1, AAA23206.1, WP_034583347.1, WP_010966571.1, WP_034583350.1, WP_015616006.1, WP_026881898.1, WP_021655913.1, WP_010235517.1, WP_004455109.1, WP_026881497.1, WP_003486653.1, KGO12652.1, WP_030034651.1, WP_003491005.1, WP_021106349.1, WP_012342913.1, WP_003362274.1, WP_003358614.1, WP_003401772.1, WP_014520521.1, WP_029452360.1, WP_007063868.1, WP_011949005.1, WP_011988245.1, WP_021284504.1, WP_025775882.1, WP_031369326.1, WP_031368191.1, WP_032077777.1, WP_023437247.1, WP_011098713.1, WP_033064364.1, WP_017415560.1, WP_017752786.1, WP_039657965.1, WP_007785525.1, WP_027638413.1, WP_014554180.1, WP_039636789.1, WP_009167516.1, WP_035786301.1, WP_027098116.1, WP_017352673.1, WP_012424272.1, WP_039769752.1, WP_035285659.1, WP_017213095.1, EEH98657.1, WP_026886109.1, WP_012058635.1, WP_041084633.1, WP_012449920.1, AHF06812.1, WP_040191544.1, WP_003371527.1, WP_021135040.1, WP_039231326.1, WP_008689032.1, WP_039221935.1, WP_003380845.1, WP_003375593.1, WP_008978928.1, WP_039229275.1, WP_039281897.1, WP_003363691.1, WP_039238494.1, WP_039256218.1, WP_039250085.1, WP_011721631.1, WP_013724912.1, WP_029169607.1, WP_039257472.1, WP_022420904.1, WP_009274567.1, WP_004798344.1, WP_039310701.1, WP_039277494.1, WP_039259348.1, WP_002596985.1, WP_022156508.1, WP_009269781.1, WP_008818561.1, WP_002607351.1, WP_006440315.1, WP_003500280.1, WP_021640844.1, WP_003509166.1, WP_024739697.1, WP_009298920.1, WP_007788299.1, WP_007049187.1, WP_035146363.1, WP_038322630.1, WP_006189666.1, WP_016518391.1, WP_012200477.1, WP_016524303.1, WP_010076251.1 und AIW89961.1,
sowie Polypeptidsequenzen bei denen bis zu 10% der Aminosäurereste gegenüber den vorgenannter Accession Nummern durch Deletion, Insertion, Substitution oder eine Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50% der enzymatischen Aktivität des Enzyms mit der jeweiligen vorgenannten Accession Nummer besitzen.

7. Mikroorganismus gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine fünfte genetische Modifikation aufweist, so dass er verglichen zu seinem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität eines mindestens Enzymes E₄ aufweist, welches den Import eines Alkans mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen, insbesondere Butan, in den Mikroorganismus hinein katalysiert.

8. Verfahren zur Herstellung von Aldehyden mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen umfassend die Verfahrensschritte.

A) In Kontakt Bringen der Mikroorganismen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einem Medium enthaltend ein Substrat mit einer Kettenlänge von 2 bis 9, insbesondere 4 bis 6, bevorzugt 4, Kohlenstoffatomen unter Umwandlung des Substrates zu Aldehyd und gegebenenfalls
B Aufreinigen des Aldehyds.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat ein Alkan eingesetzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Druck in Verfahrensschritt A) mehr als 1,5, bar beträgt.

11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt A) in einem Temperaturbereich von 20 °C bis 50 °C durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Herstellung von verzweigten Alkoholen mit einer Kettenlänge von 4 bis 18, insbesondere 8 bis 12, bevorzugt 8, Kohlenstoffatomen, insbesondere 2-Ethylhexanol, ausgebaut ist, zusätzlich umfassend die Verfahrensschritte

C) Aldolkondensation des Aldehyds unter Wasserabspaltung

D) katalytischen Hydrierung.