Procédé de préparation d'alpha aminoacides optiquement actifs et leurs dérivés

Abstract

 Ce procédé est caractérisé par le fait que l'on utilise comme produit de départ l'antipode optique correspondant pur ou en mélange avec ledit aminoacide chiral, que l'on soumet le produit de départ à l'action d'une base forte, puis que l'on fait réagir sur le produit obtenu un agent de protonation chiral stériquement encombré.
Application à la décracémisation des alpha-aminoacides et de leurs dérivés.

Description

[0001] La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation d'alpha-aminoacides optiquement actifs, ou de leurs dérivés.

[0002] On sait que la préparation d'aminoacides optiquement actifs est intéressante car ceux-ci sont utilisés notamment dans les industries alimentaire et pharmaceutique.

[0003] On connaissait déjà la préparation d'aminoacides optiquement actifs par synthèse asymétrique. Ces procédés ont notamment fait l'objet d'une revue par K. WEINGES et B.STEMMLE, Recent Dev. Chem. Nat. Carbon Compd. 1976, 7, 89.

[0004] Le procédé de la présente demande est fondé sur un principe différent et consiste à réaliser une déracémisation par protonation énantiosélective.

[0005] Le procédé de la présente demande est simple et rapide à mettre en oeuvre. Il ne nécessite pas l'emploi de catalyseurs coûteux ou difficiles d'accès, et n'est pas limité aux substances présentant le phénomène de cristallisation isomé- risante.

[0006] La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un alpha-aminoacide chiral ou d'un de ses dérivés, possédant un substituant hydrogène en a de la fonction carboxylique ou du dérivé de celle-ci, au départ de l'antipode optique correspondant ou d'un mélange dudit antipode optique avec ledit aminoacide chiral ou son dérivé, caractérisé par le fait que l'on soumet ledit produit de départ à l'action d'une base forte, afin d'éliminer le proton en a de la fonction carboxylique ou du dérivé de celle-ci, de façon connue en soi, puis que l'on fait agir sur le produit obtenu un agent de protonation chiral stériquement encombré.

[0007] On obtient ainsi, uniquement ou de façon prépondérante, un aminoacide ou son dérivé ayant une activité optique différente de celle du produit de départ. L'originalité de cette méthode réside donc essentiellement dans la possibilité théorique d'obtention d'un énantiomère pur à partir du mélange racémique ou même de son inverse optique, avec un rendement maximum pouvant atteindre 100 % alors qu'il est limité à 50 % dans le cas de la résolution.

[0008] Le produit de départ peut être par exemple un aminoacide (ou un de ses dérivés), généralement sous forme d'un mélange d'énantiomères, que l'on veut transformer, ou enrichir, en l'un des énantiomères. Parmi les aminoacides ou leurs dérivés utilisables comme produits de départ, on citera la phénylglycine, l'alanine, la.phénylalanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la sérine, la thréonine, la méthionine, le tryptophane, l'arginine, la lysine, l'histidine, etc..., et leurs dérivés.

[0009] Parmi les dérivés des aminoacides ou des mélanges d'énantiomères d'aminoacides de départ, on citera notamment les dérivés énolisables de la fonction carboxylique, tels que les esters, les thioesters, les nitriles, les amidines, les amides, etc..., ainsi que les dérivés de la fonction amine, tels que les bases de Schiff, les dérivés d'acylation, et plus généralement les dérivés d'aminoacides dans lesquels le groupement amine est transformé à l'aide d'un groupement protecteur pouvant être éliminé pour redonner l'amine non protégée.

[0010] De tels groupements protecteurs sont bien connus et sont décrits notamment par R.A. BOISSONNAS, Advances In Organic Chemistry, Methods and Results, Vol.3, Interscience Publishers, 1963, pages 159 et suivantes, ainsi que par J.F.W. McOmie, idem, pages 191 et suivantes.

[0011] Parmi les groupements de protection temporaire de la fonction amine, on peut citer notamment les groupements carbo-tert-butyloxy, formyle, phtaloyle, etc... Bien entendu, les groupements réactifs, éventuellement présents, autres que le groupement a-amino, peuvent être également protégés ; c'est le cas par exemple du groupement amine latérale de la lysine ou de l'ornithine, du groupe guanidino de l'arginine, des groupements hydroxyle de la sérine, de la thréonine, et de la tyrosine, du groupement thiol de la cystéine, etc...

[0012] Le produit de départ peut être par exemple une base de Schiff d'un ester d'un alpha-aminoacide. Ces bases de Schiff peuvent être obtenues selon des procédés connus, par exemple par l'action sur l'aminoacide du chlorure de thionyle, en présence d'un alcool, pour former le chlorhydrate d'aminoester correspondant, puis par l'action d'un dérivé carbonylé sur ledit chlorhydrate d'aminoester, dans les conditions usuelles de préparation des bases de Schiff.

[0013] Comme dérivé carbonylé, on utilise notamment ceux de formule R₄-CO-R₃, dans laquelle R₃ et R₄ peuvent représenter un groupement hydrocarboné éventuellement substitué, l'un d'entre eux pouvant en outre représenter un atome d'hydrogène.

[0014] Il convient de remarquer que l'expression "base de Schiff" s'étend ici, non seulement aux dérivés des aldéhydes aromatiques, mais plus généralement aux dérivés des cétones ou des aldéhydes aliphatiques ou aromatiques. Les substituants R₃ et R₄ peuvent représenter notamment des groupements aryle, alkyle linéaire ou ramifié, ou cycloalkyle, éventuellement substitués, cette dernière expression englobant les groupements comportant des hétéroatomes.

[0015] Généralement, les groupements hydrocarbonés que représentent R₃ et R₄ possèdent jusqu'à 20 atomes de carbone. Les substituants R₃ et R₄, lorsqu'ils représentent un groupement aryle, sont notamment un groupement phényle éventuellement substitué par un groupement alcoxy (tel que méthoxy ou éthoxy), alkyle (tel qu'isopropyle ou méthyle), etc...

[0016] Le produit de départ peut être soit un produit racémique, soit un mélange d'énantiomères en proportions quelconques. Par le choix d'un acide chiral de configuration appropriée, il est possible soit d'obtenir un mélange enrichi en l'un des énantiomères dudit produit de départ, soit de transformer l'un des énantiomères en son antipode optique.

[0017] Il convient de noter que l'on utilise ici les expressions "énantiomères" et "antipode optique" par commodité, en faisant référence uniquement au carbone asymétrique en position a par rapport au carboxyle. Mais il est bien entendu que le procédé de la présente demande est applicable à des aminoacides possédant d'autres carbones asymétriques, en plus du carbone a.

[0018] Le procédé de l'invention est applicable notamment aux aminoacides, et à leurs dérivés, présentant le groupement caractéristique de formule I:

[0019] Les produits de formule I englobent notamment les dérivés de formule IA :

[0020] dans laquelle R₁ est un groupement hydrocarboné, tel qu'un groupement alkyle, aryle ou aralkyle, éventuellement substitué et comportant éventuellement des hétéroatomes, et notamment un groupement phényle, benzyle, indole-3-yl méthyle, isopropyle, méthyle et 2-méthylpropyle.

[0021] La base forte utilisée dans le procédé défini ci-dessus est notamment une base permettant de transformer le groupement de formule I, par élimination d'un proton, en un énolate de formule II :

[0022] Parmi les bases fortes utilisables, on citera notamment les hydrures, les alcoolates, les amidures, notamment les hydrures, alcoolates ou amiduresalcalins, par exemple les hydrures de sodium, de potassium ou'de lithium, le terbutylate de lithium ou de potassium, le di-isopropylamidure de lithium, etc... On utilise généralement cette base forte à raison d'au moins un équivalent par mole de dérivé de formule I.

[0023] De plus, on a découvert que, de façon surprenante, le rendement optique augmente lorsque la base forte est elle-même porteuse d'une activité optique. Les bases fortes optiquement actives utilisables sont par exemple les hydrures, alcoolates et amidures (notamment les hydrures, alcoolates et amidures de métal alcalin), tels que ces bases portent un ou plusieurs atomes de carbone ou hétéroatomes asymétriques, ces groupements asymétriques conférant à la base utilisée une activité optique. Comme exemple de base optiquement active utilisable, on citera notamment un amidure, tel qu'un amidure alcalin, et en particulier l'amidure de lithium, de la (+) N-méthyl phénylèthylamine.

[0024] La réaction d'énolisation est effectuée généralement dans un solvant, de préférence anhydre. Le solvant peut être notamment un éther tel que le tétrahydrofuranne ou l'éther éthylique, un alcool tel t-butanol, etc ...

[0025] Les acides chiraux utilisables dans le procédé ci-dessus sont de préférence ceux qui possèdent un groupement stériquement encombrant.

[0026] Grâce à l'utilisation d'un tel acide, il est possible de fixer un proton de façon énantiosélective, sur le carbone a de l'énolate de formule II.

[0027] L'utilisation d'un acide chiral donné, stériquement encombré, permet la fixation préférentielle, sur l'une des faces du plan de la double liaison énolique, d'un proton, et l'utilisation de l'antipode optique de cet acide stériquement encombré, permet la fixation préférentielle d'un proton sur l'autre face du plan de la double liaison énolique.

[0028] Les acides chiraux stériquement encombrés sont ceux possédant au moins un substituant cyclique (saturé ou insaturé) ou un groupement ramifié. Les acides chiraux stériquement encombrés peuvent posséder notamment au moins un substituant alkyle, de préférence ramifié, éventuellement substitué ou insaturé, cycloalkyle ou aryle, éventuellement substitué, ou un substituant hydrocarboné ponté, ou encore porter au moins un groupement alkyle en ramification.

[0029] Parmi les acides utilisables on citera notamment les acides diacyltartriques et leurs monoesters, l'acide camphanique, l'acide mandélique, l'acide 2-phtalimido 3-phényl propionique, l'acide 2-trifluorométhyl 2-méthoxy phénylacétique, etc...

[0030] Parmi les acides chiraux utilisables, on citera notamment les acides diacyl-tartriques de formule IV :

dans laquelle R₅ est un reste d'un acide carboxylique, de préférence encombré, et les monoesters des diacides de formule IV.

[0031] Le substituant R5'peut être notamment un alkyle, de préférence ramifié, éventuellement substitué ou insaturé, un groupement cycloalkyle, un groupement aryle, notamment phényle ou naphtyle, éventuellement substitué, un groupement hydrocarboné ponté comme par exemple un groupement adamantyle, etc...

[0032] Parmi les acides diacyl-tartriques de formule IV, on citera notamment ceux qui sont mentionnés dans la partie expérimentale ci-après.

[0033] Tous ces acides encombrés sont connus ou peuvent être préparés selon les méthodes générales décrites dans la littérature.

[0034] Par exemple, pour préparer le di-adamantylcarboxylate de l'acide tartrique, on mélange 3 moles du chlorure de l'acide adamantylcarboxylique avec une mole d'acide tartrique. On chauffe à 140°C pendant 2-3 heures, refroidit, et reprend par le benzène. On sépare l'anhydride qui cristallise, le reprend par l'acétone et ajoute la quantité stoechiométrique d'eau. On chauffe'au reflux, puis évapore l'acétone. On obtient l'acide de formule IV (avec R₅=adamantyle).

[0035] On utilise ces acides chiraux à raison d'au moins un équivalent. On utilise généralement un excès d'acide chiral, de préférence à raison de deux équivalents d'acide chiral pour une mole du dérivé de formule I.

[0036] On fait agir l'acide chiral en solution dans un solvant, ce solvant étant de préférence le même que celui utilisé dans la réaction d'énolisation.

[0037] De préférence on fait agir l'acide chiral à des températures pouvant varier de 0 à -100°C, et en particulier vers -70°_C, pendant un temps pouvant varier de quelques minutes à quelques heures. Par exemple, la réaction de protonation est généralement terminée au bout de 15 minutes à -70°C.

[0038] On isole le dérivé d'aminoacide optiquement actif selon les méthodes connues. Par exemple, on sépare l'agent de protonation par formation quantitative d'un sel insoluble dans l'éther dans lequel la base de Schiff reste en solution.

[0039] Après la réaction de protonation, on peut transformer le produit obtenu en tout autre dérivé correspondant à la formule I, par les réactions connues de transformation, par exemple de déprotection, sans racémisation. Par exemple, on transforme une base de Schiff obtenue, de formule III :

en aminoester ou en aminoacide correspondant selon les méthodes connues, par hydrolyse acide. L'aminoester peut être transformé en aminoacide par hydrolyse alcaline, etc

[0040] En outre, il est possible de récupérer, avec un bon rendement, et sans racémisation, l'acide chiral tel que IV utilisé, dans la réaction de protonation. Un exemple détaillé est donné dans la partie expérimentale.

[0041] Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Dans tous ces exemples, les manipulations sont effectuées sous atmosphère inerte, par exemple sous azote.

EXEMPLE 1 : PROTONATION ENANTIOSELECTIVE DU N-BENZYLIDENE PHENYLGLYCINATE DE METHYLE PAR L'ACIDE L-DIPIVALOYLTARTRIQUE (FORMULE IV, R₅ = t-butyle)

[0042] On dissout 0,5 g (5.10^-3M) de diisopropylamine dans 15 cm3 de tétrahydrofuranne sec. On refroidit à -5°C et ajoute à cette température 3,12 cm3 de n-butyllithium 1,6 M, en solution dans l'hexane (5.10^-3M).

[0043] On agite la solution pendant 1/4 heure à une température comprise entre -5°C et 0°C. On refroidit alors à -70°C et ajoute à cette température 0,885 g (3,5.10^-3M) de la base de Schiff de l'ester méthylique de la phénylglycine racémique, en solution dans 6 cm3 de tétrahydrofuranne sec. On agite 1/4 heure à -70°C, puis ajoute 3,18 g (1.10^-2M) d'acide _L- dipivaloyltartrique en solution dans 10cm3 de tétrahydrofuranne sec. Après 1/4 heure d'agitation à -70°C, on laisse revenir à température ambiante. La solution est traitée par 30cm3 d'une solution aqueuse saturée de NaHCO₃; la phase organique est lavée par 30cm3 d'eau, séchée au sulfate de magnésium et concentrée sous pression réduite. L'huile jaune obtenue (base de Schiff correspondante optiquement active de la série L)est cristallisée dans l'hexane; on filtre et sèche les cristaux. 0,75 g ; Rdt : 85 %.

[0044] Le rendement optique est de 50 %.

RECUPERATION DE L'ACIDE L-DIPIVALOYL TARTRIQUE

[0045] La phase aqueuse est lavée 3 fois par 30 cm3 d'éther, acidifiée jusqu'à pH 1 par une solution aqueuse à 10 % d'HCl. On extrait 3 fois par 30 cm3 d'éther. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et le solvant est évaporé sous le vide de la trompe à eau. L'huile incolore obtenue est cristallisée dans le pentane. On filtre et sèche les cristaux dans un dessicateur.

[0046] (poids obtenu = 3,05 g ; Rdt : 96 %.)

EXEMPLE 2 : PROTONATIONS ENANTIOSELECTIVES DE LA BASE DE SHIFF DE L'ESTER METHYLIQUE DU TRYPTOPHANE, DE FORMULE III ,

[0047] avec

On procède de même que précédemment dans l'exemple 1, mais en ajoutant seulement 1,7.10^-3M de la base de Schiff racémique (0,52 g).

[0048] On obtient la base de Schiff optiquement active (Série L) avec un rendement optique de 30,5 %.

EXEMPLE 3

[0049] On opère comme précédemment au départ des bases de Schiff (racémiques) de formule III :

dans laquelle R₁ est le reste d'un a-aminoacide de formule : R₁-CH(NH₂)-CO₂H, R₁ étant un groupement hydrocarboné, tel qu'un groupement alkyle, aryle, aralkyle, éventuellement substitué et comportant éventuellement des hétéroatomes, et notamment un groupement phényle, benzyle, indole-3-yl méthyle, isopropyle, méthyle et 2-méthylpropyle, R₂ est le reste d'un alcool R₂-OH, par exemple un reste alkyle, aralkyle, etc...

[0050] Les formules de quelques bases de Schiff utilisées dans cet exemple sont résumées dans le tableau 1 suivant (R3=H, R₄=^phényle, R₂=méthyle).

[0051] Les bases de Schiff précédentes ont été énolisées, puis protonées à l'aide des acides diacyltartriques (série L) suivants de formule IV (Bu signifie : butyle) :

[0052] Les résultats obtenus avec ces acides sont résumés dans le tableau 3 suivant :

EXEMPLE 4

[0053] Les bases de Schiff racémiques III₁-III₄ (voir exemple précédent) ont été énolisées, puis protonées comme précédemment avec divers acides optiquement actifs encombrés. Les résultats sont résumés dans le tableau 4 suivant :

EXEMPLE 5

[0054] La base de Schiff racémique de formule :

C₆H₅-CH (-N=CH-t-Bu)-COOCH₃ a été énolisée, puis protonée comme précédemment avec les acides IV₁, IV₃ et IV₄.

[0055] Par hydrolyse chlorhydrique de la base de Schiff optiquement active résultante, on a obtenu le chlorhydrate d'aminoester optiquement actif de la série L, de formule :

avec des rendements optiques de 8,5 - 7,5 -4,7 % respectivement.

[0056] (Rdts chimiques : 60-65%).

EXEMPLE 6

[0057] On énolise la base de Schiff de l'ester méthylique de la phénylglycine (Formule III, avec R₃=H et R₄=phényl) par l'amidure de lithium de la (+)phényléthylamine N-méthylée, puis protoné l'énolate de lithium obtenu par l'acide (_L)dipivaloyltartrique. On isole alors la base de Schiff de l'ester méthylique de la phénylglycine avec un rendement de 75 %.

[0058] Après purification par l'hexane, on obtient 60 % de produit dont l'hydrolyse acide conduit au chlorhydrate d'aminoester correspondant de rotation.

[0059] Rendement optique : 70,5 %. Rendement de l'hydrolyse : 95 %. Réf: (D) Hydrochlorure de phénylglycinate de méthyle

Revendications

1. Procédé de préparation d'un alpha-aminoacide chiral ou d'un de ses dérivés, possédant un substituant hydrogène en a de la fonction carboxylique ou du dérivé de celle-ci, au départ de l'antipode optique correspondant ou d'un mélange dudit antipode optique avec ledit aminoacide chiral ou son dérivé, caractérisé par le fait que l'on soumet ledit produit de départ à l'action d'une base forte, afin d'éliminer le proton en a de la fonction carboxylique ou du dérivé de celle-ci, de façon connue en soi, puis que l'on fait agir sur le produit obtenu un agent de protonation chiral stériquement encombré.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit aminoacide ou son dérivé est choisi dans le groupe constitué par : la phénylglycine, l'alanine, la phénylalanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la sérine, la thréonine, la méthionine, le tryptophane, l'arginine, la lysine et l'histidine, ainsi que leurs dérivés.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les dérivés de l'aminoacide ou du mélange d'aminoacides sont choisis dans le groupe constitué par les dérivés énolisables de la fonction carboxylique, tels que les esters, les thioesters, les nitriles, les amidines et les amides, et les dérivés de la fonction amine dans lesquels le groupement amine est transformé à l'aide d'un groupement protecteur, tels que les bases de Schiff et les dérivés d'acylation.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le produit de départ est une base de Schiff de l'alpha-aminoacide ou d'un de ses dérivés.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ladite base de Schiff résulte de l'action sur l'alpha-aminoacide ou de son dérivé d'un composé carbonylé de formule R₄-CO-R₃, dans laquelle R₃ et R₄ représentent un radical hydrocarboné éventuellement substitué, l'un d'entre eux pouvant en outre représenter un atome d'hydrogène.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les substituants R₃ et R_4' lorsqu'ils représentent un radical hydrocarboné, éventuellement substitué, représentent un groupement aryle, alkyle linéaire ou ramifié, ou cycloalkyle, éventuellement substitué, contenant éventuellement des hétéroatomes.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé par le fait que le produit de départ est une base de Schiff de formule :

dans laquelle R₁ est le reste d'un a-aminoacide de formule : R₁-CH(NH₂)-CO₂H, R₂ est le reste d'un alcool de formule R₂- _OH, et _R3 et R₄ sont définis comme précédemment.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que R₁ représente un groupement hydrocarboné, tel qu'un groupement alkyle, aryle ou aralkyle, éventuellement substitué et comportant éventuellement des hétéroatomes, et notamment un groupement phényle, benzyle, indole-3-yl méthyle, isopropyle, méthyle et 2-méthylpropyle.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la base forte est choisie dans le groupe constitué par les hydrures, les alcoolates et les amidures.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la base forte est utilisée à raison d'au moins un équivalent par mole d'aminoacide, ou de son dérivé, de départ.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la réaction avec la base forte est effectuée dans un solvant anhydre.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ledit solvant est un éther tel que le tétrahydrofuranne ou l'éther éthylique ou un alcool tel que le t-butanol.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit agent de protonation chiral stériquement encombré est un acide chiral possédant au moins un substituant cyclique ou un groupement en ramification.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que l'acide chiral stériquement encombré possède au moins un substituant alkyle, de préférence ramifié, éventuellement substitué ou insaturé, cycloalkyle ou aryle, éventuellement substitué, ou un substituant hydrocarboné ponté, ou porte au moins un groupement alkyle en ramification.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé par le fait que l'acide chiral est choisi dans le groupe constitué par les acides diacyltartriques et leurs monoesters, l'acide camphanique, l'acide mandélique, l'acide 2-phtalimido 3-phényl propionique, et l'acide 2-trifluorométhyl 2-méthoxy phénylacétique.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que lesdits acides chiraux sont les acides diacyl- tartriques de formule :

dans laquelle R₅ est le reste d'un acide carboxylique, de préférence encombré, ou les monoesters de ces diacides.

₁7. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que R₅ est un groupement alkyle de préférence ramifié, éventuellement substitué ou insaturé, un groupement aryle, tel qu'un groupement phényle ou naphtyle, éventuellement substitué, ou un groupement hydrocarboné ponté tel qu'un groupement adamantyle.

18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que R₅ représente un groupement méthyle, n-propyle, isopropyle, t-butyle, néopentyle, 3,3-diméthylbutyle, phényle, benzyle, phénéthyle, (CH₃)₂-CBr-, cyclohexyle, styryle, adamantyle, (C₂H₅)₃C-, 1,1,3,3-tétraméthyl butyle, 2,4,6-triméthylphényle, a-naphtyle, o-tolyle, m-tolyle ou 2,5-diméthyl phényle.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé par le fait que l'on fait agir l'acide chiral à raison d'au moins un équivalent pour une mole du dérivé d'aminoacide.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé par le fait que l'on fait agir l'acide chiral en solution dans un solvant, tel que le solvant utilisé dans la réaction d'énolisation.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé par le fait que l'on fait agir l'acide chiral à une température pouvant varier de 0 à -100°C.

22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé par le fait que l'on fait agir l'acide chiral à température de -70°C environ.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 22, caractérisé par le fait que ladite base forte est porteuse d'une activité optique.

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait que ladite base forte est un amidure de la (+) N-méthyl phényléthylamine.