[0001] L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de maladies trouvant leur
origine dans des anomalies lysozomiales (ou lysozomales), la fibrose kystique, la
dystrophie musculaire et/ou les aberrations chromosomiques, un procédé dérivé du précédent
permettant la détermination in vitro de la possibilité d'action de médicaments à l'étude
sur ces maladies, ainsi que des réactifs susceptibles d'être mis en oeuvre dans ces
procédés.
[0002] Il est à ce jour pratiquement établi que de nombreuses maladies lysozomiales trouvent
leur origine dans une nodification d'origine génétique des équilibres enzymatiques
au sein des cellules de l'organisme.
[0003] A titre d'un premier type d'exemple de ces maladies lysozomales, on peut citer les
maladies classiques dites de stockage ou d'accumulation dues à l'incapacité des cellules
de l'hôte de synthétiser des enzymes déterminées aptes à métaboliser ou cataboliser
des substrats déterminés, plus particulièrement certains types d'hydrolases. Il est
ainsi connu par exemple que la maladie de Pompe est due à une déficience en a-glucosidase,
d'où l'impossibilité pour les cellules atteintes de digérer ou d'hydrolyser le substrat
correspondant, le glycogène, lequel tend alors à s'accumuler dans l'organisme de l'hôte.
Il en est encore de même des maladies du type gM
1-gangliosidose, qui sont dues à une déficience en β-galactosidase. Les cellules de
l'individu affectées ne sont alors pas aptes à hydrolyser les gM
1-gangliosides .
[0004] Une autre catégorie de maladies .lysozomiales se manifeste au contraire par des libérations
d'hydrolases dans les espaces extracellulaires et par conséquent en des déficiences
intracellulaires multiples en ces hydrolases.
[0005] L'hypothèse a été formulée que ces libérations incontrôlées trouvaient leur origine
dans un défaut génétique affectant certains marqueurs portés par ces hydrolases, marqueurs
qui servent normalement à ancrer ces hydrolases sur des récepteurs de membranes lysozomaux
spécifiques. Ces marqueurs paraissent devoir être constitués par des oligosaccha-
rides phosphorylés fixés sur les protéines enzymatiques à l'occasion d'un processus
secondaire intervenant lors de leur passage à travers les cavités du réticulum endoplas-
mique.
[0006] La conséquence de modifications du système lyso- zomal est là encore une accumulation
dans l'organisme de différents substrats macromoléculaires non hydrolysés. Un certain
nombre de mucolipidoses se rattachent à cette catégorie de maladies. Il semble ainsi
établi que la maladie des "cellules-I" ("I-cell disease") est due à une phosphorylation
anormale d'un groupe mannose, d'où des libérations incontrôlées d'hydrolases dans
les espaces extracellulaires ou - lorsque ces cellules sont cultivées in vitro - dans
le milieu de culture.
[0007] A cette catégorie de maladies se rattache la fibrose kystique (souvent visée ci-après
par les initiales "CF"), également dénommée mucoviscidose, qui est une maladie génétique
récessive autosomale extrêmement grave, particulièrement fréquente dans les populations
d'origine européenne. En France un nouveau-né sur 2.000 à 2.500 en est affecté. Cette
maladie se manifeste en général aussitôt après la naissance. Les syndromes les plus
caractéristiques consistent dans le développement d'obstructions pulmonaires chroniques,
d'insuffisances pancréatiques, un défaut de mé- tabolisation des graisses et une sensibilité
extrême aux infections, notamment au niveau des régions respiratoires. La mort s'ensuit
habituellement au cours des toutes premières années de la vie de l'enfant. Au niveau
cellulaire, on constate des déficiences intracellulaires partielles multiples en hydrolases,
des fuites excessives de ces mêmes hydrolases dans les fluides extracellulaires (plasma
sanguin, milieux de cultures). Certaines des enzymes concernées sont encore affectées
d'une thermolabilité, qui peut être mise à profit pour un-diagnostic différentiel
in vitro de la fibrose kystique.
[0008] A l'inverse, ce sont, dans une autre catégorie de maladies, les récepteurs lysozomiaux
de membranes eux-mêmes qui peuvent être défectueux (maladie de Chediak-Higashi), d'où
encore la conséquence d'une libération incontrôlée d'hydrolases dans le milieu extracellulaire'et
la métaboli- sation insuffisante, sinon inexistante de divers substrats.
[0009] De nombreuses autres maladies, plus particulièrement celles dues à des anomalies
chromosomiques, se manifestent par des modifications au niveau de la synthèse des
enzymes qui s'avèrent pouvoir être dépistées au niveau cellulaire. Il a été par ailleurs
constaté, dans le cadre de la présente invention, qu'une maladie mettant en jeu une
anomalie au niveau du chromosome X (mutation ponctuelle sur ce chromosome) et qui
est particulièrement répandue - la dystrophie musculaire -, peut se manifester dans
les conditions qui seront décrites plus loin par une libération dans les milieux extracellulaires
d'enzymes spécifiques. Il a cependant été constaté qu'elles ne présentent pas de thermolabilité
différentielle vis-à-vis des enzymes correspondantes produites par les cellules d'individus
sains. Plus généralement, on constate que les cultures de cellules présentant des
anomalies chromosomiques sont susceptibles d'engendrer , dans les conditions qui seront
décrites plus loin, des variations importantes vis-à-vis de la normale des quantités
d'enzymes, notamment d'hydrolases, produites par rapport aux cellules normales. Ce
phénomène se concrétise par des excédents intracellulaires, extracellulaires ou les
deux à la fois,d'enzymes hydrolytiques.
[0010] En raison du caractère particulièrement grave de la plupart de ces maladies, il est
souhaitable de pouvoir dépister ces anomalies génétiques aussitôt que possible. Les
chances de survie d'un nouveau-né potentiellement affecté de l'une de ces maladies
seront d'autant meilleures qu'il pourra sans tarder être soumis à une thérapie intensive.
Il serait mieux encore de dépister cette anomalie dans la phase néonatale, éventuellement
même dans la toute première phase de la grossesse, à un moment où une interruption
de grossesse thérapeutique pourrait éventuellement encore être indiquée.
[0011] Certes, il existe déjà à ce jour des techniques permettant d'apprécier sur des prélèvements
de liquide amniotique des anomalies chromosomiques, lorsqu'elles se manifestent par
des modifications d'ordre structurel. On conçoit cependant la difficulté d'effectuer
des caryotypes systématiques sur un grand nombre de prélèvements cellulaires. Les
techniques de dépistage s'avèrent cependant encore plus difficiles à ce jour lorsque
les anomalies en question sont invisibles à l'oeil et sont l'expression d'erreurs
futures de contrôle ou de régulation du métabolisme cellulaire. Les procédés proposés
jusqu'à ce jour pour les dépistages néonataux n'ont donc guère été développés, tant
en raison des résultats ambigus auxquels ils conduisent que de la difficulté technique
de leur mise en oeuvre.
[0012] Il serait encore mieux de pouvoir évaluer préventivement les risques de transmission
d'un défaut génétique par des parents apparemment sains à leur descendance. A titre
d'exemple, on peut mentionner que certaines de ces maladies, telles que la mucoviscidose,
sont des affections familiales se transmettant selon le mode autosomal récessif. Il
semble à ce jour établi que sont susceptibles d'être affectés de la mucoviscidose
les enfants dont le patrimoine génétique résulte de la recombinaison chromosomique
au moment de la fécondation des patrimoines génétiques du père et de la mère, lorsque
tous deux sont porteurs d'une mutation spécifique, sans pour autant être eux-mêmes
affectés de cette maladie. Ces parents seront ci-après dits "CF-hétérozygotes". Bien
entendu, cette expression s'étend également à leurs cellules et, d'une façon générale,
à leur patrimoine génétique propre. Sont donc susceptibles d'être affectés de la maladie,
les enfants qui reçoivent en partage ces défauts génétiques de leurs deux parents
, eux-mêmes étant dits par la suite "CF-homozygotes". Par extension, on utilisera
aussi ces expressions "hétérozygotes" et "homozygotes", à l'égard de parents et enfants
respectivement porteurs d'une anomalie génétique quelconque.
[0013] L'invention a pour but de remédier aux inconvénients susmentionnés, plus particulièrement
de fournir un procédé permettant tant le dépistage global in vitro chez un individu
de l'existence éventuelle ou potentielle de l'une quelconque d'une pluralité de maladies
prédéterminées du genre en question, que le diagnostic à la fois plus sûr et plus
aisé qu'il n'était possible jusqu'à ce jour de l'existence éventuelle ou-potentielle
de l'une d'entre elles.
[0014] Le procédé selon l'invention a encore pour but la réalisation du test de dépistage,
non seulement chez les nouveau-nés ou d'une façon plus générale les enfants, mais
aussi chez l'embryon et de préférence même dans les toutes premières semaines de la
grossesse.
[0015] La demande de brevet n° 79 14234 déposée le 1er juin 1979 au nom du demandeur décrivait
pour la fibrose kystique l'obtention d'un procédé permettant le dépistage systématique
au niveau des populations de ceux des individus éventuellement porteurs d'un défaut
génétique "hétérozygote". Un tel test de diagnostic systématique peut, par exemple,
être mis en oeuvre à l'occasion des visites médicales prénuptiales de plus en plus
couramment prescrites par les législations nationales.
[0016] La présente invention vise l'obtention d'un procédé permettant de tester la valeur
potentielle d'un médicament à l'étude contre une ou plusieurs des maladies du genre
en question.
[0017] L'invention met à profit un certain nombre de constatations et d'hypothèses qui s'appuient
sur un support expérimental étendu concernant la régulation génétique. C'est ainsi
que l'on peut à ce jour penser que le signal primaire susceptible d'activer les gènes
qui codent pour la synthèse des différentes hydrolases nécessaires à la digestion
intracellulaire des espèces macromoléculaires correspondantes est induit par ces espèces
macromoléculaires elles-mêmes, telles que divers polysaccharides, le glycogène, les
gangliosides, etc., lorsque celles-ci entrent dans les cellules. Ce signal s.erait
normalement faible et de courte durée dans des cellules qui sont pourvues d'un équipement
enzymatique normal, qui est alors capable d'hydrolyser lesdites macromolécules. Il
serait cependant beaucoup plus fort et de longue durée dans des cellules qui ne sont
pas capables de digérer l'une au moins desdites macromolécules. Il semble que l'acide
adénylique cyclique (AMP cyclique ou CAMP) intervient dans ces processus en tant que
messager hormonal secondaire, en tant qu'il coordonne l'induction des hydrolases par
activation des gènes correspondants, lorsque s'accroît sa concentration cellulaire.
[0018] C'est l'ensemble de ces phénomènes physiologiques qu'exploite l'invention en vue
du diagnostic in vitro de l'existence éventuelle ou potentielle d'anomalies lysozomiales,
de fibrose kystique, de la dystrophie musculaire et des anomalies chromosomiques ;
plus particulièrement :
a) des maladies génétiques du dispositif de digestion intracellulaire, notamment les
maladies lysozomiales classiques d'accumulation, le syndrome de Chédiak-Higashi, la
fibrose cystique,la dystrophie musculaire de Duchenne, etc..
b) des maladies génétiques mettant en eu sous l'effet de stimuli hormonaux des réactions
excessives accompagnées d'une induction coordonnée d'hydrolases dans les cellules
affectées d'aberrations chromosomiques, telles que trisomies, monosomies, trisomies
partielles (duplications), monosomies partielles (délétions), etc..
[0019] Le procédé selon l'invention est, dans l'une de ses premières variantes, caractérisé
par la mise en contact d'une culture de cellules de l'hôte avec un "cocktail" contenant
les réactifs suivants :
- 1) au moins un inducteur d'au moins une enzyme, plus particulièrement d'une hydrolase
corrélable à une maladie déterminée et dont le comportement doit être apprécié, ou
alternativement une hormone stimulant l'adénylcy- clase, ou encore les deux à la fois
;
- 2) un inhibiteur des phosphodiestérases, du type de celles qui peuvent dégrader
l'AMP cyclique, tel que la théophylline ;
- 3) un inhibiteur de la synthèse des protéines ; les concentrations relatives de
ces constituants dans le milieu de culture étant réglées de façon à permettre un comportement
nettement différencié de cellules saines et de cellules porteuses de l'anomalie recherchée
(notamment dans le cas de cellules homozygotes), à ne pas affecter sensiblement le
développement de cellules saines, mais à entraîner l'interruption du développement,
voire la mort desdites cellules homozygotes ou hétérozygotes.
[0020] On appréciera que ce cocktail de réactifs - qui fait également partie de l'invention
en tant que tel - semble avoir pour effets combinés, d'une part, une induction d'un
signal primaire renforcé et de longue durée, lorsque la cellule est affectée par fibrose
kystique, dystrophie musculaire ou une anomalie lysozomiale, une aberration chromosomique,
d'autre part, la stabilisation d'un signal secondaire (par hypothèse celui de l'AMP
cyclique) également renforcé du fait de l'inhibition des phosphodiestérases qui tendent
normalement à la dégradation de l'AMP cyclique en adénosine 5'-monophosphate et, d'autre
part encore,l,'incapacité de la cellule de répondre à ces stimuli. , faute de pouvoir
synthétiser des protéines sous l'action de l'inhibiteur de la synthèse des protéines.
[0021] A titre d'exemple l'inducteur est constitué par au moins l'un de ceux qui sont propres
à normalement induire la modification de la synthèse enzymatique dans la maladie à
étudier. Il s'agit par exemple des macromolécules naturelles que les cellules - lorsqu'elles
sont affectées par la maladie en cause - ne peuvent pas cataboliser (par exemple le
glycogène dans le cas de la maladie de Pompe, des gangliosides, notamment des gM
L-gangliosides dans le cas des maladies du type gangliosidoses, des glycoprotéines
ou mucopolysaccharides, dans le cas de celles des autres maladies qui sont attribuées
à l'incapacité des cellules de l'hôte à cataboliser ces substrats, etc.). Les inducteurs
du genre en question peuvent également être différents des substrats naturels correspondant
à la maladie étudiée, pour autant qu'ils soient capables d'induire des effets semblables
au niveau des cellules affectées par les maladies en question. A titre d'exemple particulièrement
avantageux d'inducteurs naturels, on citera le mélange héparine-immunoglobulines,
celles-ci étant de préférence d'origine humaine, et notamment constituées par des
y-globulines humaines, ce mélange étant - conformément à un aspect particulier de
l'invention - propre à servir à la caractérisation de cellules affectées par l'anomalie
caractéristique de la fibrose kystique (cellules homozygotes ou hétérozygotes) ou
de la dystrophie musculaire (cellules homozygotes).
[0022] A titre d'exemples préférés d'hormones stimulant l'adénylcyclase, on mentionnera
essentiellement les prostaglandines, notamment les prostaglandines E
l, ou mieux encore les prostaglandines E 2*
[0023] En ce qui concerne l'inhibiteur des phosphodiestérases entrant dans le cocktail de
l'invention, on peut naturellement remplacer la théophylline par toute autre substance
ayant une action semblable. On peut citer à titre d'exemple la 4-(4,3-diméthoxybenzyl)-2-imidazoline
ou encore ceux mentionnés dans l'article intitulé "Inhibitors and Activators of Cyclic
Nucleotide Phosphodiestérases" de M. Chasin et D.N. Harris, dans le 7ème tome de l'ouvrage
intitulé "Advances in Cyclic Nucléotide Research" de Greengard et Robinson, Raven
Press, 1976.
[0024] En ce qui concerne enfin l'inhibiteur de la synthèse des protéines on peut avoir
recours à tout composé actif à une étape quelconque de la synthèse protéique, par
exemple d'un inhibiteur agissant au niveau de l'activation du gène, tel que l'actinomycine
D,ou d'un inhibiteur direct de la synthèse des protéines, tel que l'émétine, notamment
le dichlorhydrate d'émétine, ou, de préférence, le cycloheximide.
[0025] Dans ce qui précède, on a essentiellement considéré le cas d'un cocktail pouvant
ne contenir qu'un seul inducteur caractéristique d'une anomalie recherchée, ou seulement
une hormone stimulatrice de l'adénylcyclase. Il est cependant particulièrement intéressant
d'avoir recours à un cocktail comprenant un grand nombre de ces inducteurs et, le
cas échéant en outre, l'hormone stimulante de l'adényl- cyclase, d'où la possibilité
de réaliser des "dépistages globaux" de l'existence éventuelle de l'une quelconque
des différentes maladies auxquelles correspondent respectivement les différents inducteurs
du cocktail en question et, le cas échéant en outre, de toute aberration chromosomique
ré- vélable par l'hormone stimulante de l'adénylcyclase.
[0026] Dans cette dernière hypothèse, les épreuves de diagnostics pourront comporter plusieurs
phases, par exemple :
- une première phase dans laquelle sera déterminée l'existence ou la potentialité
d'une maladie génétique déterminée à l'aide d'un tel "cocktail global" (celui-ci ne
permettra cependant pas d'identifier de façon immédiate la maladie en cause) ;
- une ou plusieurs phases supplémentaires mettant en jeu des sous-cocktails, notamment
ne contenant, au titre du premier (ou des premiers) des constituants définis plus
haut de façon générale, que des inducteurs de maladies lysozomiales, à l'exclusion
de l'hormone stimulant l'adénylcy- clase, ou vice versa.
[0027] Une réponse positive au sous-cocktail ne contenant que des inducteurs des maladies
lysozomales incitera le spécialiste à répéter l'expérience de culture des cellules
originaires du même hôte, mais avec des cocktails spécifiques, ne contenant qu'un
seul inducteur, lui-même spécifique d'une ou d'un nombre réduit de maladies, quitte
à achever l'identification de la maladie spécifique par d'autres méthodes analytiques
.
[0028] Au contraire, une réponse positive avec le cocktail ne contenant que l'hormone stimulatrice
de l'adénylcyclase, à l'exclusion de tout inducteur de maladie lysozomiale, incitera
le chercheur à rechercher la nature de l'anomalie chromosomique alors révélée elle-même
dans sa globalité, par toute autre méthode connue en soi, telle qu'une technique d'analyse
de structure des chromosomes susceptibles d'être affectés.
[0029] A titre d'exemple de "cocktail global", on peut mentionner ceux contenant, en sus
de l'inhibiteur de phosphodiestérases, notamment la théophylline, et de l'inhibiteur
de la synthèse de protéines, notamment le cycloheximide :
- une prostaglandine, notamment une prostaglandine E2,
- de l'héparine, des immunoglobulines, du glycogène, les différents gangliosides mis
en jeu dans les différentes gangliosidoses, les différents mucopolysaccharides mis
en jeu dans les mucopolysaccharidoses, etc..
[0030] Les cocktails plus spécifiques ou sous-cocktails ne contiendront plus alors, en sus
de la théophylline et du cycloheximide, que des groupes réduits de ces inducteurs,
voire un seul de ces inducteurs.
[0031] L'invention concerne plus particulièrement des cocktails dans lesquels sont associés
à la théophylline et au cycloheximide (ou autres composés ayant des fonctions ana-
i logues), d'une part, une prostaglandine, notamment une prostaglandine E
1, ou de préférence une prostaglandine E
2, et, d'autre part, de l'héparine et une globuline, notamment une y-globuline humaine.
[0032] L'association héparine-globuline constitue elle-même un inducteur particulier conforme
à l'invention, apte à permettre le diagnostic in vitro de la présence ou de la potentialité
d'une fibrose kystique ou d'une dystrophie musculaire. Il a en effet été constaté,
conformément à l'invention, que la mise en présence de cellules affectées de l'anomalie
correspondant à la dystrophie musculaire avec l'association héparine-globuline avait
pour effet l'induction d'une libération d'hydrolases par lesdites cellules.
[0033] Le susdit cocktail permettra donc la détection de la présence soit d'une anomalie
chromosomique, soit d'une fibrose kystique, soit d'une dystrophie musculaire.
[0034] Avantageusement, les proportions des divers constituants dans le cocktail de l'invention
seront telles qu'après mise en contact de ces cocktails avec le milieu de culture
contenant les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives
suivantes (exprimées par rapport au ml de milieu de culture contenant ces constituants)
:
- de 180 µg à 1000 µg, notamment de l'ordre de 600 µg par ml pour l'héparine,
- de 180 µg à 600 µg, notamment de l'ordre de 400 µg par ml pour la y-globuline,
- de 0,8 µg à 10 ug, notamment de l'ordre de 1 µg par
. ml pour la prostaglandine E2,
- de 10-5 à 10-2, notamment 10-3M de théophylline,
- de 8 µg à 25 ug, notamment 10 µg par ml pour le cycloheximide (concentration finale).
[0035] L'invention concerne également les cocktails préférés eux-mêmes, tels qu'ils ont
été définis ci-dessus, contenant les différents constituants dans des proportions
telles qu'ils puissent donner les concentrations relatives indiquées plus haut vis-à-vis
de 1 ml de milieu de culture.
[0036] L'invention concerne également les sous-cocKtails du genre en question dans lesquels
manquent soit l'héparine et les y-globulines, soit la prostaglandine E 2. Ces deux
derniers cocktails permettront par conséquent une première différenciation entre les
cellules atteintes d'une anomalie chromosomique (réponse positive au cocktail à base
de prostaglandine E
2) et des cellules atteintes d'une anomalie correspondant soit à la fibrose kystique,
soit à la dystrophie musculaire. Ces dernières cellules devront alors faire l'objet
d'un essai complémentaire, notamment selon d'autres méthodes de diagnostic.
[0037] Avantageusement, on mettra à profit le fait que certaines des enzymes affectées par
la fibrose kystique, présentent une thermolabilité plus grande que lorsqu'elles sont
originaires de cellules saines, différence qui n'existe pas dans le cas des enzymes
mises en jeu dans la dystrophie musculaire.
[0038] En particulier, on peut mettre à profit,pour détecter la présence ou la potentialité
d'une fibrose kystique, le fait que les a-mannosidases ou phosphatases acides produites
par les cellules concernées tendent à subir une inactivation beaucoup plus rapide
à 40°,5Cpour Jes premières, à 36°,5C pour les secondes, lorsqu'elles proviennent de
cellules d'individus "CF-homozygotes" ou "CF-hétérozygotes" que lorsqu'elles proviennent
d'individus normaux. Ce même type d'inactivation totale ou partielle à ces températures
n'est pas observable lorsque les cellules proviennent d'individus souffrant de dystrophies
musculaires ou menacées par cette maladie, d'où par conséquent la possibilité de différencier
les deux maladies dans un tel test final.
[0039] Dans la forme de mise en oeuvre la plus accessible du procédé qui a été défini ci-dessus,
la différenciation entre cellules saines et cellules malades met essentiellement en
jeu la capacité des cellules en question à survivre en présence des cocktails du genre
en question, dans le cas de cellules saines, et à mourir au bout d'un certain temps
de culture en présence de ces cocktails, comme cela sera illustré dans l'exemple plus
loin, dans le cas de cellules malades.
[0040] Conformément à un développement supplémentaire de l'invention, ce test peut encore
être mis en oeuvre pour déterminer la potentialité que possède un médicament déterminé
d'exercer une activité favorable à l'égard de cellules malades qui ne survivent normalement
pas aux conditions de mise en oeuvre du test qui vient d'être décrit. Ce développement
consiste à réaliser une culture de cellules malades en présence du cocktail contenant
soit l'inducteur spécifique (ou les inducteurs spécifiques) de la maladie dont sont
atteintes les cellules et de doses du médicament à étudier. L'action favorable du
médicament est alors susceptible de permettre la survie desdites cellules malades
au bout d'un temps de culture pour lequel elles auraient autrement cessé de se développer
ou seraient mortes, en l'absence du médicament en question.
[0041] L'invention fournit donc un premier procédé de "screening" ou recherche systématique
du médicament susceptible d'agir au niveau cellulaire.
[0042] On décrit ci-après un exemple de mise en oeuvre pratique d'un essai mettant en jeu
les cocktails et sous-cocktails préférés de l'invention, à l'égard de fibroblastes
humains (type de cellules qui n'est ici pris qu'à titre d'exemple).
[0043] Les cellules à étudier, prélevées chez des patients et suspectées de présenter soit
une anomalie chromosomique, soit l'une des deux maladies que sont la fibrose kystique
ou la dystrophie musculaire, sont mises en culture, à 37°C, dans des boites de pétri
ou dans des boîtes Nunclon de 24 alvéoles. Le milieu de culture est du Ham F 10 supplémenté
avec 15 % de sérum de veau foetal.
[0044] 16 heures plus tard, on ajoute aux cultures la composition selon l'invention dans
laquelle les différents réactifs sont dans les proportions adéquates permettant l'ajustement
final suivant des concentrations relatives en ses constituants essentiels vis-à-vis
de 1 ml de culture :
- héparine ................ 600 µg/ml,
- y-globuline humaine ...... 400 µg/ml,
- prostaglandine E2 ........ 1 pg/ml
- théophylline ............. 10-3 M,
- cycloheximide ............ 10 µg/ml.
[0045] On laisse 3 jours à incuber à 37°C. On lave trois fois chaque boite de pétri ou chaque
alvéole avec une solution tamponnée et on ajoute ensuite 1 ml de méthanol à 70 % pour
fixer les cellules. On laisse 5 minutes en contact. On sèche. On colore ensuite avec
du giemsa, colorant qui ne peut colorer que des cellules vivantes.
[0046] Les alvéoles des boîtes Nunclon colorées, révèlent donc les cellules normales ; les
cellules mutées, elles, n'ont pas résisté à l'action de la composition inductrice
de la synthèse d'enzymes hydrolytiques.
[0047] Les alvéoles ou boites de pétri non colorées, dans lesquelles les cultures cellulaires
ont donc été tuées, témoignent de ce qu'elles présentaient l'une des anomalies sus-mentionriées.
[0048] Des cellules provenant des mêmes patients peuvent alors être remises en culture dans
les mêmes conditions en présence de sous-cocktails, identiques au cocktail global
précédent, sauf qu'ils ne contiennent pas, soit la prostaglandine E
2' soit l'héparine et la y-globuline humaine, de façon à procéder au premier type de
différenciation décrit plus haut, entre anomalies chromosomiques de structure, d'une
part, une fibrose kystique ou dystrophie musculaire, d'autre part.
[0049] Ces deux dernières maladies pourront d'ailleurs être également ensuite différenciées
entre elles, notamment en ayant recours à la méthode qui a également été rappelée
plus haut mettant en jeu l'existence ou non de thermolabi- lités de certaines des
enzymes impliquées dans ces maladies.
[0050] Les tests qui viennent d'être décrits peuvent être aisément adaptés à l'étude d'un
médicament susceptible d'agir au niveau cellulaire. Dans le cas où l'on souhaite par
exemple étudier l'action d'une nouvelle substance vis-à-vis de la fibrose kystique,
on prépare une gamme de doses croissantes du médicament, et on procède à une série
de cultures des cellules connues pour être atteintes par la maladie, en présence,
d'une part, du sous-cocktail spécifique à cette maladie et, d'autre part, de concentrations
croissantes du médicament étudié. Le même procédé est appliqué à des cultures de cellules
normales servant de témoins.
[0051] Les médicaments inactifs n'altéreront évidemment pas le résultat observé, à savoir
la non-coloration finale des cultures étudiées. Par contre, les doses de médicaments
aptes à au moins retarder l'effet nocif de la maladie pourront être repérées par la
coloration retrouvée des cultures de cellules correspondantes par le giemsa.
[0052] Il va de soi que l'on peut utiliser, pour repérer les cellules non endommagées et
les cellules endommagées, toute autre procédure ou technique que la coloration avec
le giemsa (ou avec un autre colorant) pour différencier des cultures cellulaires encore
vivantes et des cultures cellulaires qui ont cessé de se développer, voire même qui
sont mortes.
[0053] La composition selon l'invention peut être préparée au moment de l'emploi. Elle peut
aussi être préparée à l'avance, notamment se présenter sous forme d'une solution contenant
:
- de 1.800 µg à 10.000µg, notamment de 6.000 µg d'héparine par ml,
- de 1.800 µg à 6.000µg, notamment de 4.000 µg par ml de γ-globulineshumaines,
- de 8 µg à 100 µg, notamment de 10 µg par ml de prostaglandine E2,
- de 10-4 à 10 -1 notamment de 10 M-2 de théophylline,
- de 80µg à 250µg, notamment de 100 µg par ml d'une solution à 10 % en poids de cycloheximide,
notamment dans une solution tamponnée au citrate pH 5,4.
[0054] Bien entendu, l'invention concerne également les sous-cocktails contenant les mêmes
substances aux mêmes concentrations, à l'exception soit de l'héparine et des y-globulines
humaines, soit de la prostaglandine E
2.
[0055] D'une façon générale, on pourra constituer tout autre type de cocktail inducteur,
apte à permettre le dépistage d'autres types de maladies lysozomales selon le même
principe, les inducteurs précédents étant remplacés par ceux correspondant à la maladie
que l'on désire dépister. Ces derniers peuvent également venir s'ajouter aux précédents
dans le cas où l'on souhaiterait réaliser des cocktails permettant un dépistage global
en une seule fois d'un plus grand nombre de maladies. D'une façon générale, les inducteurs,
notamment les substrats que les cellules atteintes desdites maladies ne sont pas capables
de cataboliser, pourront être utilisés dans des gammes de concentra- tions généralement
situées entre 300 µg a 2000 g par ml de la composition. Leurs doses peuvent également
être exprimées par leur titre final vis-à-vis du milieu de culture des cellules soumises
à l'essai, notamment de 300 µg à 2000 µg par ml de milieu de culture.
[0056] Selon une seconde variante du procédé selon l'invention, on met en oeuvre, pour le
diagnostic in vitro d'éventuelles maladies du genre en question, les susdits cocktails,
cependant limités aux inducteurs et/ou à l'hormone stimulant l'adénylcyclase, plus
particulièrement à l'exclusion des inhibiteurs des phosphodiestérases et de la synthèse
des protéines, et on dose les niveaux d'activité enzymatique induits par lesdits cocktails
dans les cellules (milieux intracellulaires) ou dans un milieu extracellulaire, tel
qu'un milieu de culture. Les niveaux d'activité mesurés s'avèrent nettement plus élevés
dans les cellules malades que dans les cellules saines. Ces niveaux d'activité seront
globalement plus élevés dans le cas des cellules caractérisées par une aberration
chromosomique repérable par l'hormone stimulant les adénylcyclases (en raison d'une
hyper- réaction de la synthèse enzymatique de ces cellules sous l'effet de cette stimulation)
ou affectées d'une maladie lysozomiale ou de la fibrose kystique ou de la dystrophie
musculaire.
[0057] La lecture de l'activité enzymatique de l'enzyme de référence peut être faite par
fluorescence, par colorimétrie, par dosage spécifique de l'enzyme hydrolytique choisie
par l'expérimentateur (parmi toutes les enzymes hydrolytiques, certaines conviennent
mieux pour le dosage intracellulaire et d'autres pour le dosage dans le milieu de
culture).
[0058] Il s'est avéré que la phosphatase alcaline, qui est l'une des enzymes hydrolytiques
induites après l'action d'un inducteur, est choisie lorsqu'on veut faire une mesure
de l'activité enzymatique intracellulaire.
[0059] Par contre, lorsque l'on veut mesurer l'activité enzymatique dans le milieu de culture,
on choisit plutôt l'hexosaminidase.
[0060] Avantageusement, le diagnostic de cellules normales ou cellules mutées est basé sur
la mesure de taux de production des enzymes concernées, mettant en jeu soit des différences
substantielles mesurables de niveaux d'activité enzymatique, soit des variations des
propriétés de l'enzyme de référence, notamment de thermolabilité ou de cinétique d'activation
ou d'inactivation de cette enzyme (par exemple cas de la fibrose kystique), selon
que ces niveaux différents d'activité enzymatique ou ces propriétés différentes de
l'enzyme peuvent être mis en évidence entre cellules saines et cellules atteintes
de l'une des maladies recherchées.
[0061] Ces différences de propriétés prennent une importance toute particulière lorsque
l'on distingue non seulement les cellules malades ou homozygotes des cellules "normales",
mais aussi - dans le cas de la fibrose kystique - les cellules homozygotes des cellules
hétérozygotes provenant d'individus apparemment sains.
[0062] Il a en effet été mis en évidence que les enzymes telles que l'a-mannosidase ou la
phosphatase acide peuvent subir , à une température supérieure à 40°,5 C pour la première
et à 36°,5 C pour la seconde, une inactivation plus rapide lorsqu'elles proviennent
d'individus "CF-homozygotes" que lorsqu'elles proviennent d'individus "CF-hétérozygotes",
la même différence s'observant à nouveau entre individus hétérozygotes et individus
normaux. Ces variations de propriétés n'apparaissent pas sur les mêmes enzymes, lorsqu'elles
proviennent de cellules saines ou de cellules atteintes par l'anomalie lysozomale
caractéristique de la dystrophie musculaire, d'où la possibilité de différencier les
cellules atteintes de fibrose kystique et celles atteintes de dystrophie musculaire.
[0063] La mise en évidence,par exemple, de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire
peut donc se faire directement sur culture de cellules après induction enzymatique.
Bien entendu on peut avoir recours dans ce cas, comme d'ailleurs dans celui de la
première variante envisagée plus haut, à toute autre méthode de diagnostic permettant
de différencier entre la fibrose kystique et la dystrophie musculaire.
[0064] Bien entendu, cette variante de procédé selon l'invention peut être étendue à la
détection de l'existence ou de la potentialité d'autres maladies encore, plus particulièrement
des maladies lysozomiales qui ont déjà été évoquées plus haut. Dans ce cas, la susdite
composition d'induction destinée à être mise en contact avec la culture de cellules
à étudier contient en outre au moins un inducteur caractéristique des susdites autres
maladies et ayant pour effet d'induire des niveaux d'activité excédentaires des enzymes
corrélables à ces maladies dans celles des cultures de cellules originaires d'un individu
qui en serait affecté.
[0065] De préférence, la proportion relative dudit inducteur est ajustée de façon à ce que
la concentration finale de la culture en cet inducteur soit comprise entre 300 et
2.000 pg par ml de culture.
[0066] Comme dans le cas précédent, le diagnostic peut être fait en plusieurs étapes, en
mettant en jeu des compositions ou cocktails d'induction de plus en plus spécifiques,le
procédé étant alors plus particulièrement caractérisé en ce que :
- dans une première phase, on met en contact une culture desdites cellules avec une
composition d'induction ou "cocktail global" contenant une pluralité des inducteurs
ou groupes d'inducteurs en vue de détecter l'existence ou la potentialité de l'une
des maladies ou anomalies comprises parmi le groupe de maladies auquel correspondent
lesdits inducteurs ou groupes d'inducteurs et, si l'activité de l'enzyme dosée atteint
un niveau attestant de la présence de l'une des susdites maladies ou anomalies,
- dans une ou plusieurs phases supplémentaires, on met en contact des cultures de
cellules provenant du même individu ou embryon avec des compositions ou "sous-cocktails"
plus spécifiques contenant des inducteurs ou groupes de maladies plus spécifiques,
en vue de la répétition du susdit dosage.
[0067] L'invention est encore relative aux compositions inductrices elles-mêmes contenant
des proportions relatives d'héparine et de y-globulines,telles qu'elles permettent
par mélange avec un milieu distinct, tel qu'un milieu de culture, l'obtention de concentrations
relatives finales telles qu'indiquées ci-après à propos du premier test pour le diagnostic
de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire.
[0068] Bien entendu, elles peuvent en outre contenir d'autres inducteurs ou agents de stimulation
des adénylcyclases, telles que la prostaglandine E
2' celle-ci se trouvant alors contenue dans la composition dont question ci-dessus,
dans des proportions telles qu'elles permettent notamment l'obtention finale, dans
les mêmes conditions, des intervalles de concentrations relatives en héparine, en
y-globuline et en prostaglandine E
2 correspondant à celles du "cocktail global" mentionné ci-après à propos du deuxième
test pour le diagnostic de la fibrose kystique, de la dystrophie musculaire ou des
anomalies chromosomiques.
[0069] Les conditions expérimentales des tests sont alors avantageusement les suivantes
:
1°) Pour le diagnostic de la fibrose kystique ou de la dystrophie musculaire, la composition
du cocktail inducteur est ajustée, pour obtenir des concentrations finales en héparine
et y-globuline humaine, vis-à-vis de 1 ml de culture :
- de 150 à 400, notamment 200 pg par ml de milieu de culture pour l'héparine,
- de 150 à 400, notamment 200 µg par ml de milieu de culture pour la y-globuline.
2°) Pour le diagnostic des anomalies chromosomiques, la teneur de la composition en
prostaglandine E2 est ajustée de façon à obtenir une concentration finale de 0,8 à 10, notamment 1
pg/ml.
[0070] Les cellules normales soumises à ce cocktail ne présentent pas une synthèse d'enzymes
hydrolytiques très sensiblement différente de celle des cellules normales témoins.
[0071] Par contre, les cellules mutées présentent une augmentation du taux d'enzymes hydrolytiques
que ce soit au niveau intracellulaire ou dans le milieu de culture.
[0072] Généralement, le test pour le diagnostic utilise une composition regroupant les constituants
définis sous 1° et 2°ci-dessus qu'en une seule opération, on peut diagnostiquer une
cellule anormale (qu'ils'agisse de la fibrose kystique, de la dystrophie musculaire
ou d'anomalie chromosomique) et en une seconde étape on peut par exemple en utilisant
le cocktail n° 2 identifier la nature de la mutation des cellules mises en culture
(dans ce cas, il s'agit du diagnostic des anomalies chromosomiques).
. Le cocktail global a donc la composition suivante :

[0073] A titre d'exemple, on indique ci-après un protocole de traitement des cultures qui
peuvent être mises en oeuvre en vue de la réalisation des susdits dosages:
1°) Cultiver les cellules en flacon corning 75 cm2, milieu HAM F10 (fibroblastes humains) jusqu'à ce qu'il y ait inhibition de contact.
2°) Eliminer le milieu de culture, laver trois fois avec une solution tamponnée pH
7,4, entre chaque lavage, laisser les cellules à 5 minutes en contact avec cette solution.
3°) Préparer du milieu HAM F10 dépourvu de sérum de veau foetal mais contenant 0,01
% d'albumine bovine (Sigma Lab.).
4°) Eliminer la solution de lavage. Rincer une fois avec le milieu défini sous 3°),puis
remplir avec 5 ml du même milieu.
5°) Incuber pendant 10-12 heures à 37°C, en agitant très doucement.
6°) Renouveler le milieu et laisser pendant trois jours toujours à 37°C et avec agitation.
7°) Effectuer un premier prélèvement de 100 µl de milieu de culture à la fin du troisième
jour (vers 19 h environ) et un second prélèvement le lendemain matin (vers 9 h environ)
.
[0074] Congeler immédiatement dans l'azote liquide les aliquotes prélevées.
8°) Après le deuxième prélèvement, ajouter à la culture cellulaire 500 µl du cocktail
inducteur.
9°) A la fin de ce quatrième jour (toujours vers 19 h) et les matins suivants (cinquième
jour et sixième jour, vers 9 heures), prélever chaque fois des nouvelles aliquotes
de 100 µl à congeler immédiatement dans l'azote liquide.
10°) Faire les dosages de l'enzyme choisie dans tous les tubes en même temps (hexosaminidase)
et comparer les résultats entre les tubes contenant des cultures induites et les tubes
contenant les cultures non induites.
11°) Le cas échéant, faire en parallèle les opérations 1°) à 10°) sur des cellules
provenant d'individus témoins sains et comparer.
[0075] Dans ce qui précède les concentrations des différents constituants du cocktail inducteur
sont respectivement sensiblement égales à dix fois les concentrations finales correspondantes
désirées dans le milieu de culture final.
[0076] Les cultures de cellules qui, dans les séquences qui précèdent, répondent "positivement"
à la composition inductrice peuvent alors être suspectées de porter l'une des anomalies
recherchées.
[0077] Les cultures de cellules qui répondent "positivement" sont celles pour lesquelles
les dosages de l'enzyme choisie font apparaître une production de l'enzyme étudiée
beaucoup plus importante sur les aliquotes qui ont été prélevées au terme de l'étape
9°) ci-dessus que sur les aliquotes prélevées au terme de l'étape 7°) ci-dessus. Lorsque
les mêmes opérations sont réalisées sur des cellules provenant d'individus témoins
sains, une telle différence n'est pas observée.
[0078] Comme dans le cas de la première variante du procédé selon l'invention, on peut mettre
à profit cette technique pour étudier les effets de médicaments à étudier sur une
maladie déterminée, en associant des gammes de doses croissantes de ce médicament
à la composition inductrice appropriée, qui est mise en contact avec la culture de
cellules affectées de ladite maladie déterminée.
[0079] Selon une troisième variante enfin du procédé
^elon l'invention, notamment pour effectuer le diagnostic in vitro de maladies caractérisées
par l'incapacité du sujet de synthétiser certaines enzymes spécifiques (par exemple
une a-glucosidase dans la maladie de Pompe, une β-galactosidase dans le cas de la
gM
1-gangliosidose, etc.), on réalise une culture des cellules à étudier en présence d'un
dérivé stabilisé de l'AMP cyclique, qui soit de plus apte à traverser facilement les
membranes cellulaires, et on recherche et on dose l'enzyme spécifique éventuellement
produite. Le dosage de l'enzyme se fait soit dans le milieu intracellulaire, soit
dans le milieu de culture.
[0080] Il apparaît en effet que ces dérivés de l'AMP cyclique, tout comme l'AMP cyclique
naturel, conduisent à une induction coordonnée de la totalité des hydrolases susceptibles
d'être produites par la cellule, à l'exclusion bien entendu de celles qu'elle n'est
pas capable de synthétiser, d'où un procédé différentiel particulièrement efficace
pour dépister le dernier type d'anomalies envisagées.
[0081] De tels dérivés d'AMP cyclique "stabilisés" sont disponibles dans le commerce : à
titre d'exemple, on mentionne le complexe N
6, D
2'-dibutyryl-adénosyl 3';5'- cyclique, acide monophosphorique et le complexe 8-(4-chlo-
rophénylthio)-adénosine-3',5' cyclique, monophosphate de sodium.
[0082] On peut notamment procéder selon le protocole expérimental de culture susmentionné.
On règle avantageusement la concentration du dérivé de l'AMP cyclique à une concentration
finale de 5.10
-6 à 5.10
-9 M/l, par exemple de 5.10
8 M/1 de milieu de culture, et on procède ensuite au dosage des enzymes concernées
selon les méthodes, par exemple colorimétriques, déjà indiquées plus haut, en rapport
avec la seconde variante du procédé de l'invention, plus particulièrement dans son
application aux diagnostics des maladies lysozomiales, de la fibrose kystique ou de
la dystrophie musculaire.
[0083] Cette troisième variante de procédé est avantageusement mise en oeuvre sur des cellules
possédant une anomalie vraisemblable qui aura de préférence été révélée par l'application
à des cultures cellulaires provenant du même individu de la première ou seconde variante
de procédé sus- défini. L'anomalie spécifique sera alors plus particulièrement révélée
par l'absence de production de l'enzyme déficiente (par exemple de l'a-glucosidase
ou de la β-galacto- sidase). Cette déficience sera d'autant plus marquée que l'on
observera une production maximum de toutes les autres enzymes étudiées.
[0084] Les cellules qui peuvent être mises en oeuvre dans chacun des procédés décrits dans
ce qui précède Y peuvent être constituées par toutes cellules originaires d'un malade,
d'un nouveau-né ou encore d'un embryon.
[0085] L'invention concerne enfin plus particulièrement le procédé d'induction visant à
diagnostiquer le défaut génétique pouvant conduire à la fibrose kystique ou à la dystrophie
musculaire, ce procédé consistant à produire des cultures des cellules provenant d'individus
ou d'embryons étudiés, en présence de la composition d'induction formées par l'association
héparine-globulines, notamment y-globulines humaines, et à doser l'une au moins des
enzymes induites dont les caractéristiques sont susceptibles de donner lieu aux différences
de comportement permettant la différenciation des cellules atteintes de fibrose kystique
et celles atteintes de dystrophie musculaire, dans les conditions qui ont été rappelées
plus haut.
[0086] Comme il va de.soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention
ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont
été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes.
[0087] En particulier, l'invention concerne toutes les méthodes équivalentes permettant
d'atteindre les mêmes buts. En particulier, on mentionnera parmi ces méthodes équivalentes
celles mettant en jeu un dosage de toute enzyme ou autre constituant susceptible d'être
synthétisé en proportions relativement plus importantes par les cellules, lorsque
celles-ci sont affectées par l'une des maladies définies plus haut,que par des cellules
originaires d'individus sains. En particulier, on peut avoir recours au dosage du
CAMP qui se trouve lui-même synthétisé en quantités plus importantes par les cellules
malades que par les cellules saines, dès qu'elles sont mises en contact avec tout
inducteur du genre de ceux que les cellules malades ne sont plus capables de cataboliser
ou, le cas échéant, avec un agent stimulant de l'adénylcyclase. En conséquence, le
dosage du CAMP ou de tout autre composant synthétisé de façon globale en excès peut
servir à la détection de l'existence ou de la potentialité de l'une des affections,
en tout cas au niveau de la première étape mettant en jeu le susdit "cocktail global".
[0088] L'invention n'est pas davantage limitée à l'utilisation des constituants plus particulièrement
nommés dans les exemples. Il en est particulièrement ainsi des agents de stimulation
de l'adénylcyclase. Les hormones indiquées plus haut à titre d'exemple peuvent être
remplacées par tout autre agent exerçant la même fonction, notamment par l'isoprotérénol.
Celui-ci peut être utilisé en lieu et place des prostaglandines rappelées plus haut
dans toutes les compositions qui ont été définies. Avantageusement, la teneur des
solutions initiales en isoprotérénol sera telle que l'on puisse atteindre dans le
milieu de culture final des concentrations de 10 6M à 10
-4M, de préférence de l'ordre de 10
5M, les concentrations relatives des autres constituants de ces solutions ou mélanges
étant par ailleurs sensiblement les mêmes.
[0089] De même, on peut avoir recours à d'autres inhibiteurs de phosphodiestérases ou encore
à d'autres inhibiteurs de la synthèse de protéines. L'expression "inhibiteurs de synthèse
de protéines", telle qu'elle est définie dans la présente demande, s'étend aussi à
tous composés capables de retarder ou de n'inhiber que temporairement la synthèse
des protéines.
1 - Procédé de diagnostic in vitro de la potentialité ou de l'existence de la fibrose
kystique, de la dystrophie musculaire, d'une maladie lysozomiale ou d'une anomalie
chromosomique, caractérisé par le fait que l'on met en contact une culture de cellules
provenant d'un individu ou d'un embryon étudiés avec une composition "cocktail" contenant
les réactifs suivants :
- 1) au moins un inducteur d'au moins une enzyme, plus particulièrement d'une hydrolase
corrélable à une maladie déterminéeou un agent stimulant l'adénylcyclase, ou encore
les deux à la fois ;
- 2) un inhibiteur des phosphodiestérases, du type de celles qui peuvent dégrader
l'AMP cyclique ;
- 3) un inhibiteur de la synthèse des protéines ; les concentrations relatives de
ces constituants dans le milieu de culture étant réglées de façon à ne pas affecter
sensiblement le développement de cellules saines, mais à entraîner l'interruption
du développement, voire la mort desdites cellules, dans le cas de l'existence ou de
la potentialité de l'une desdites maladies ou anomalies.
2 - Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que l'inhibiteur des phosphodiestérases
est constitué par la théophylline ou la 4-(4,3-diméthoxybenzyl)-2-imidazolinee et
l'inhibiteur de la synthèse des protéines est constitué de tout composé actif à une
étape quelconque de la synthèse protéique, notamment un inhibiteur agissant au niveau
de l'activation du gène, tel que l'actinomycine D, ou d'un inhibiteur direct de la
synthèse des protéines, tel que l'émétine, notamment le dichlorhydrate d'émétine,
ou, de préférence, le cycloheximide.
3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que :
- l'inhibiteur de phosphodiestérases est constitué par la théophylline et
- l'inhibiteur de protéines est constitué par le cycloheximide.
4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les proportions relatives
de la théophilline et du cycloheximide sont ajustées de façon telle que, après mise
en contact de la composition d'induction avec le milieu de culture contenant les cellules
à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives suivantes (exprimées
par rapport au ml de milieu de culture) :
- de 10-5 . à 10 2, notamment 10-3 M de théophylline,
- de 8 µg à 25 ug, notamment 10 µg par ml de . cycloheximide.
5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inducteur est constitué
par une association d'héparine de d'immunoglobulines, de préférence d'origine humaine.
6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les proportions relatives
de l'héparine et de la y-globuline sont ajustées de façon telle qu'après mise en contact
de la composition d'induction avec le milieu de culture contenant les cellules à étudier,
on obtienne les concentrations finales respectives suivantes (exprimées par rapport
au ml de milieu de culture) :
- de 180 µg à 1.000 µg, notamment de l'ordre de 600 µg par ml pour l'héparine,
- de 180 µg à 600 µg, notamment de l'ordre de 400 µg par ml pour la y-globuline.
7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que
l'agent stimulant l'adénylcyclase est constituée par une prostaglandine, notamment
prostaglandine E1 ou, de préférence, prostaglandine E2.
8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la proportion de prostaglandine
est ajustée de façon telle que, après mise en contact de la composition d'induction
avec le milieu de culture contenant les cellules à étudier, on obtienne une concentration
finale, exprimée par rapport au ml de milieu de culture, de 0,8 µg à 10 µg, notamment
de l'ordre de 1 µg par ml pour la prostaglandine.
9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que
la composition d'induction contient les constituants identifiés ci-après en des proportions
relatives telles, qu'après mise en contact de cette composition avec le milieu de
culture contenant les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives
suivantes, exprimées par rapport au ml de milieu de culture :
- de 180 µg à 1.000 µg, notamment de l'ordre de 600 µg par ml pour l'héparine,
- de 180 µg à 600 µg, notamment de l'ordre de 400 µg par ml pour la y-globuline,
- de 0,8 µg à 10 µg, notamment de l'ordre de 1 µg par ml pour la prostaglandine,
- de 10-5 à 10-2, notamment 10-3M de théophylline,
- de 8 µg à 25 µg, notamment 10 µg par ml pour le cycloheximide.
10 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que
l'agent stimulant l'adénylcyclase est constitué par l'isoprotérénol.
11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la composition d'induction
contient les constituants identifiés ci-après en des proportions relatives telles,
qu'après mise en contact de cette composition avec le milieu de culture contenant
les cellules à étudier, on obtienne les concentrations finales respectives suivantes,
exprimées par rapport au ml de milieu de culture :
- de 180 µg à 1.000 µg, notamment de l'ordre de 600 µg par ml pour l'héparine,
- de 180 µg à 600 µg, notamment de l'ordre de 400 µg par ml pour la y-globuline,
- de 10 6M à 10 4M, de préférence de l'ordre de 10-5M, d'isoprôtérénol,
- de 10-5 à 10 2, notamment 10-3M de théophylline,
- de 8 µg à 25 µg, notamment 10 µg par ml pour le cycloheximide.
12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que
la composition d'induction contient en outre au moins l'un des composés choisis dans
le groupe comprenant le glycogène, les différents gangliosides mis en jeu dans les
différentes gangliosidoses et les mucopolysaccharides du type de ceux qui sont mis
en jeu dans les mucopolysaccharidoses.
13 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que
:
- dans une première phase, on met en contact une culture desdites cellules avec une
composition d'induction ou "cocktail global" contenant une pluralité des inducteurs
ou groupes d'inducteurs en vue de détecter l'existence ou la potentialité de l'une
des maladies ou anomalies comprises parmi le groupe de maladies auquel correspondent
lesdits inducteurs ou groupes d'in-. ducteurs et, si l'on a observé une interruption
du développement, voire la mort desdites cellules,.
- dans une ou plusieurs phases supplémentaires, on met en contact des cultures de
cellules provenant du même individu ou embryon avec des compositions ou "sous-cocktails"
plus spécifiques contenant des inducteurs ou groupes d'inducteurs correspondant à
des maladies ou groupes de maladies plus spécifiques, en vue de la détermination de
ceux des inducteurs plus spécifiques qui entraînent l'interruption du développement,
voire la mort desdites cellules.
14 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 étendu à l'étude des
effets d'un médicament à étudier sur la maladie ou l'anomalie révé- lable par l'inducteur
ou le groupe d'inducteurs contenu dans la composition utilisée, caractérisé en ce
que l'on procède à une série de cultures de cellules en cause en présence, d'une part,
de ladite composition d'induction et, d'autre part, de concentrations croissantes
du médicament étudié.
15 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5, 6, 9 et 11,caractérisé en
ce que, lorsque l'on a observé l'interruption du développement, voire même la mort
desdites cellules, lorsque celles-ci ont été mises en contact de la susdite composition,
on soumet un milieu, au contact duquel avaient antérieurement été placées ou cultivées
des cellules provenant du même individu, à un traitement thermique tel que l'une des
enzymes parmi celles qui sont susceptibles d'être affectées par la fibrose kystique
soit de nature à subir une cinétique d'inactivation plus rapide que lorsqu'elle provient
de cellules saines, l'observation d'une cinétique d'inactivation plus rapide pouvant
alors être corrélée à la fibrose kystique, et l'absence de cinétique d'inactivation,
tout au plus une cinétique d'inactivation réduite, pouvant alors être corrélée à une
dystrophie musculaire.
16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'enzyme étudiée est
constituée par l'a-mannosidase ou la phosphatase acide,et que la température du susdit
traitement thermique est de l'ordre de 40,5°C, lorsqu'il s'agit de la phosphatase
acide.
17 - Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications
1 à 16, caractérisée en ce qu'elle consiste en une solution contenant les constituants
identifiés ci-après dans des proportions leur permettant d'obtenir, lorsque ladite
composition est mélangée avec un autre milieu, tel qu'un milieu de culture, des concentrations
relatives :
- de 10-5 à 10 2, notamment 10 3M de théophylline,
- de 8 µg à 25 µg, notamment 10 µg par ml pour le cycloheximide,
- de 180 µg à 1.000 µg, notamment de l'ordre de 600 µg par ml d'héparine et de 180
µg à 600 µg, notamment de l'ordre de 400 µg par ml d'y-globuline,
- soit de 0,8 µg à 10 µg, notamment de l'ordre de 1 µg par ml pour la prostaglandine,
soit de 10-4M à 10-6M, notamment de 10-5M d'isoprotérénol.