[0001] La présente invention est relative au traitement de maladies impliquant une dégénérescence
des neurones ganglionnaires rétiniens (RGCs), et notamment du glaucome.
[0002] La rétine est le feuillet cellulaire tapissant le fond de l'oeil. Elle contient différents
types de neurones dont le rôle est de capter l'énergie lumineuse et de la transformer
en signal nerveux, ainsi que des cellules gliales.
[0003] Schématiquement, la rétine comprend trois couches principales de neurones : les neurones
photorécepteurs (cônes et bâtonnets), les neurones bipolaires, et les neurones ganglionnaires
; d'autres neurones, les neurones amacrines et les neurones horizontaux, jouent un
rôle régulateur. Les neurones photorécepteurs réagissent à la lumière, et le signal
qu'ils génèrent est transmis par l'intermédiaire des neurones bipolaires, aux neurones
ganglionnaires, dont les axones constituent les fibres nerveuses du nerf optique,
assurant l'envoi de l'information au cerveau.
[0004] La dégénérescence des neurones rétiniens est impliquée dans diverses rétinopathies.
Ainsi, la dégénérescence des neurones photorécepteurs est impliquée dans certaines
pathologies, telles que la rétinite pigmentaire ou la dégénérescence maculaire. Dans
d'autres pathologies, ce sont les neurones ganglionnaires qui sont atteints. Des atteintes
des neurones ganglionnaires rétiniens peuvent être observées dans diverses neuropathies
optiques, génétiques ou vasculaires, mais aussi plus largement dans le cadre de maladies
neurodégénératives (telle que par exemple la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques
ou la maladie de Parkinson).
[0005] L'une des pathologies dans lesquelles le rôle prépondérant de l'atteinte des neurones
ganglionnaires rétiniens a été démontré est le glaucome. Dans cette pathologie, la
dégénérescence de ces neurones et de leurs axones aboutit à une détérioration lente
du nerf optique, qui peut conduire à la cécité totale. La cause la plus fréquente
du glaucome est une hyperpression intraoculaire. Bien que les mécanismes aboutissant
à la destruction des neurones ganglionnaires soient encore mal élucidés, son implication
dans la survenue de la pathologie a été montrée (
NICKELLS, 2007, Can. J. Ophthalmol. , 42, 278-87). En outre, chez les patients atteints de glaucome, des concentrations excessives
en glutamate, un neurotransmetteur normalement présent dans l'humeur vitrée, ont été
observées (
DREYER et al., Arch Ophthalmol, 114, 299-305, 1996) (
MORRISON et al., Prog Retin Eye Res, 24, 217-240, 2005). A ces concentrations, le glutamate a une activité neurotoxique sur les neurones
ganglionnaires en culture ou
in vivo (
HAHN et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 85, 6556-6560, 1988;
LI et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 40, 1004-1008, 1999) (
SHEN and SLAUGHTER, J Neurophysiol, 87, 1629-1634, 2002). Le TNF-alpha est également surexprimé dans la rétine et le nerf optique des patients
atteints de glaucome (
YUAN and NEUFELD, Glia, 32, 42-50, 2000;
TEZEL et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 42, 1787-1794, 2001). La toxicité de cette cytokine, associée à la présence de récepteurs sur les neurones
ganglionnaires, a été démontrée
in vitro (
FUCHS et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 46, 2983-2991, 2005) et
in vivo (
FONTAINE et al., J Neurosci, 22, RC216, 2002).
[0007] Les homéoprotéines, ou protéines à homéodomaine sont des facteurs de transcription
jouant une rôle majeur dans les phénomènes de migration et différenciation cellulaires
impliqués dans la morphogénèse de l'organisme. Elles se caractérisent par la présence
d'une séquence de 60 acides aminés, l'homéodomaine, qui est un domaine de liaison
à l'ADN, possédant une structure particulière (hélice/tour/hélice). Il a été montré
que l'homéodomaine isolé de la protéine Antennapedia de Drosophile peut d'une part
traverser la membrane de neurones en culture, et d'autre part s'accumuler dans le
noyau et promouvoir la croissance des neurites (Demande
EP0485578 (
JOLIOT et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 88, 1864-1868, 1991). Les propriétés de pénétration de l'homéodomaine d'Antennapedia sont conférées par
sa troisième hélice, et apparaissent très conservées entre les homéoprotéines ; ses
propriétés sur la croissance des neurites apparaissent corrélées à ses propriétés
de liaison à l'ADN, au niveau de sites de liaison définis par la séquence consensus
ANNNNCATTA (Demande
EP0485578 (
JOLIOT et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 88, 1864-1868, 1991).
[0008] Otx2 (Orthodenticle homolog 2) est une homéoprotéine contenant un homéodomaine de
type bicoïd (
SIMEONE et al., Embo J, 12, 2735-2747, 1993). Elle appartient à la famille d'homéoprotéines Otx, qui joue un rôle fondamental
dans le développement du cerveau au cours de l'embryogenèse (
ACAMPORA et al., Prog Neurobiol, 64, 69-95, 2001;
SIMEONE et al., Curr Opin Genet Dev, 12, 409-415, 2002). Il a également été montré qu'Otx2 intervenait dans la formation de la rétine, en
favorisant la différenciation de cellules souches rétiniennes en neurones photorécepteurs.
La Demande
EP1591127 rapporte ainsi que la transformation de cellules souches rétiniennes par un vecteur
recombinant exprimant Otx2, induit la différenciation de ces cellules en neurones
photorécepteurs, au détriment des autres types de neurones rétiniens, et propose l'utilisation
d'Otx2 pour traiter diverses pathologies rétiniennes impliquant une dégénérescence
des neurones photorécepteurs.
[0009] Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence un nouvel effet d'Otx2, qui ne se manifeste
pas au niveau de la différenciation des neurones rétiniens, mais à celui de la survie
des neurones adultes déjà différenciés, et qui concerne les neurones ganglionnaires.
Ils ont en effet observé que l'addition d'Otx2 à des cultures de neurones ganglionnaires
adultes axotomisés (qui habituellement meurent très rapidement), permettait leur survie.
[0010] Cette nouvelle propriété d'Otx2 permet de proposer son utilisation pour améliorer
la survie des neurones ganglionnaires adultes en culture
in vitro, ainsi que pour la prévenir ou traiter
in vivo la dégénérescence des neurones ganglionnaires.
[0011] On définit par « homéoprotéine Otx2 » toute homéoprotéine dont l'homéodomaine possède
au moins 98% d'identité de séquence avec celui de la protéine Otx2 humaine (résidus
38-97 de la séquence SEQ ID NO: 1), et qui contient un résidu lysine en position 50
dudit homéodomaine, et dont la séquence polypeptidique globale possède au moins 90%,
de préférence au moins 95% d'identité avec la protéine SEQ ID NO: 1 (correspondant
à l'isoforme 1 de la protéine Otx2 humaine, référencée sur SwissProt sous le numéro
P32243), ou avec la protéine SEQ ID NO: 2 (correspondant à l'isoforme 2 de la protéine
Otx2 humaine, référencée sur SwissProt sous le numéro P32243-2).
[0012] Ladite homéoprotéine Otx2 peut être facilement obtenue par des méthodes bien connues
en elles-mêmes. Elle peut par exemple être produite sous forme recombinante par les
méthodes classiques de génie génétique.
[0013] Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une homéoprotéine
Otx2, ou d'une composition comprenant ladite homéoprotéine Otx2 comme médicament pour
la prévention ou le traitement de la dégénérescence des neurones ganglionnaires, et
plus particulièrement d'une telle dégénérescence intervenant au cours du glaucome.
[0014] La présente invention peut en particulier être mise en oeuvre chez des patients ne
présentant pas de dégénérescence des neurones photorécepteurs.
[0015] La présente Invention a également pour objet l'utilisation d'une homéoprotéine Otx2,
ou d'une composition comprenant ladite homéoprotéine pour augmenter la survie de neurones
ganglionnaires rétiniens en culture.
[0016] Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il suffit de mettre ladite homéoprotéine
en contact avec les neurones ganglionnaires ; elle pénètre en effet dans ceux-ci grâce
à la séquence d'internalisation présente dans sa troisième hélice. De manière préférée
ladite mise en contact est effectuée à une concentration de ladite homéoprotéine de
0,5 à 10 nM, avantageusement de 1 à 5 nM, et de manière particulièrement avantageuse
de 1,5 à 3 nM.
[0017] In vitro, il suffit d'ajouter ladite homéoprotéine au milieu de culture des neurones.
In vivo, elle peut être administrée par différentes voies, localement, notamment par injection
ou infusion dans l'humeur vitrée, ou dans l'espace sous-orbital, ou sous forme de
collyre, ou de pommade ophtalmique. Elle peut également être administrée à l'aide
d'un dispositif de libération contrôlée, par exemple sous forme d'implant intra-oculaire.
Le cas échéant, elle peut être administrée de manière systémique, par exemple par
injection intraveineuse.
[0018] Les doses d'homéoprotéine à administrer
in vivo pour obtenir la concentration souhaitée au contact des neurones ganglionnaires, peuvent
aisément être déterminées et adaptées par l'homme de l'art en fonction notamment des
modalités d'administration envisagées.
[0019] On peut également effectuer cette mise en contact en mettant les neurones ganglionnaires
en présence de cellules transformées pour exprimer ou surexprimer, et sécréter ladite
homéoprotéine.
In vitro, ceci peut s'effectuer par co-culture de ces cellules transformées avec des neurones
ganglionnaires.
In vivo, on peut par exemple greffer dans la rétine des cellules transformées pour exprimer
ou surexprimer, et sécréter ladite homéoprotéine.
[0020] On peut également, le cas échéant, associer ladite homéoprotéine avec un ou plusieurs
autres principes actifs thérapeutiques, en administration conjointe ou séparée. Par
exemple, dans le cadre du traitement du glaucome, on peut l'associer à une molécule
ou une combinaison de molécules utilisée dans ce traitement, telles par exemple que
celles décrites par WOODWARD & CHEN (2007, précité), et notamment une molécule ou
une combinaison de molécules capables de diminuer la pression intra-oculaire.
[0021] La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui
va suivre, qui se réfère à des exemples démontrant l'activité d'une homéoprotéine
Otx2 sur la survie des neurones ganglionnaires.
EXEMPLE 1 : PRODUCTION ET PURIFICATION D'OTX2 RECOMBINANTE
[0022] La séquence codant pour l'isoforme-1 (SwissProt P32243) de l'homéoprotéine Otx2 humaine
a été clonée, sous contrôle du promoteur
trc inductible par l'isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG), dans le plasmide pTchTEV2
(dérivé d'un plasmide pTrcHis2 (Invitrogen), par remplacement du segment NcoI-HindIII
par un linker permettant l'insertion d'un produit de PCR contenant la séquence codante
d'Otx2 en amont et en phase avec le site de clivage pour la protéase rTEV, suivi de
l'étiquette myc-his6 en position C-terminale, pour produire le plasmide pTrOtx2hTev.)
La protéine recombinante exprimée par pTrOtx2hTev contient la séquence d'Otx2 fusionnée
en C-terminal à une étiquette Myc et une étiquette 6xHis. Elle a été produite dans
la souche d'
E.
Coli BL21 CodonPlus-RP (Novagen) plus RP » transformée par choc thermique. Après sélection
des bactéries transformées sur boites de Pétri agar-LB-ampicilline à 37°C sur la nuit,
l'expression de la protéine recombinante est induite par incubation une nuit à 37°C
dans le milieu de culture auto-inducteur (IPTGlike) OverNight Express Instant TB Médium
(Novagen). Après centrifugation, les bactéries sont reprises sur glace, dans un tampon
de lyse (Tp : NaPO
4 20mM, NaCl 0,5mM, avec inhibiteurs de protéases et sans EDTA), à 3 ml de Tp par gramme
de culot bactérien) et lysées par 3 passages à la French Press à 1000 psi. Le lysat
bactérien est centrifugé et le surnageant récupéré et filtré à 0,45 µm. Les protéines
sont purifiées sur colonne Hitrap Chelating HP (Amersham) 1 ml chargée avec du NiSO
4 0,1M, et le surnageant est passé à 0,5ml/min. Deux lavages sont effectués avec le
Tp contenant de l'imidazole à 10mM, puis à 50mM. L'élution est faite par 10 fractions
de 1 ml de Tp avec imidazole à 250mM. Une élution finale est faite avec le Tp et imidazole
à 1M. La pureté des fractions d'élution a été contrôlée par électrophorèse SDS-Page,
puis coloration au bleu de Coommassie.
[0023] Leur spécificité a été analysée par transfert de Western : deux µL de chaque fraction
d'élution ont été mélangés avec du tampon de Laemmli et bouillis pendant 5 minutes.
La séparation protéique a été effectuée par électrophorèse SDS-PAGE sur des gels d'acrylamide
12%. Les protéines sont électro-transférées sur membrane de nitro-cellulose. Après
saturation dans un tampon contenant 5% de lait et 0.1% de Tween-20 dans du PBS 1X,
la membrane est incubée avec l'anticorps primaire (anti-Otx2 polyclonal de rat au
1/200 ou anti-Myc monoclonal de souris au 1/1000) pendant la nuit à 4°C. Après rinçage,
le filtre est incubé avec l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase (HRP) pendant
1h. L'activité enzymatique de la peroxydase est révélée par chimioluminescence.
[0024] L'analyse en Western-Blot avec l'anticorps primaire anti-HPX, ou antiMyc permet de
révéler une seule forte bande de migration au poids moléculaire attendu (environ 40kDa)
pour la protéine HPX avec les étiquettes Myc et 6XHis.
[0025] Les 3 fractions les plus riches en Otx2 sont réunies : leur concentration en Otx2
est d'environ 200µg/ml. La préparation ainsi obtenue est dialysée contre un tampon
Tris 50 mM/EDTA 0,5 mM/NaCl 200 mM, et stockées à -20°C dans ce même tampon contenant
45% de glycérol. Le glycérol est éliminé avant chaque expérience par dialyse contre
le milieu de culture.
EXEMPLE 2 : EFFET D'OTX2 SUR LA SURVIE DES NEURONES GANGLIONNAIRES RETINIENS AXOTOMISES.
Cultures de cellules rétiniennes
[0026] L'effet de la protéine a été testé sur des neurones de rétine après dissociation
et mise en culture. Deux protocoles ont été utilisés : d'une part des cultures mixtes
comprenant tous les types de cellules rétiniennes, de l'autre des cultures de neurones
ganglionnaires purifiés.
[0027] Toutes les expériences de cultures mixtes ont été réalisées sur des souris C57B16
adultes (de 6 à 10 semaines), et toutes les expériences de cultures purifiées de cellules
ganglionnaires rétiniennes sur des rats adultes Long Evans de 8 semaines. Les souris
et les rats ont été euthanasiés par dislocation cervicale. Les yeux ont été prélevés
dans un délai de moins de 15 minutes, après désinfection périorbitaire au Mucocit
(Biobloc), par dissection intra-orbitaire du globe oculaire. Les procédures utilisées
sont en accord avec les recommandations de la CEE (86/609/EEC) et le Comité National
Français pour l'utilisation des animaux du laboratoire.
Cultures mixtes de cellules rétiniennes adultes dissociées
[0029] Des lamelles de verre stériles sont prétraitées avec de la Poly-D-Lysine (Sigma P-6407)
à 2 µg/cm2 sur la nuit à 37°C puis de la laminine (Sigma L-2020) à 1 µg/cm2, 3 heures
à 37°C. La dissection des rétines se fait dans le milieu CO2-indépendant et sans L-Glutamine
(Gibco 18045-054). Les rétines sont morcelées aux ciseaux, rincées au PBS sans Ca2+,
Mg2+ (Invitrogen 14190-185) avec glucose 0,6%, et EDTA à 0,5 mM, et incubées en présence
de 0,2% papaïne (Worthington Biochemicals, 1 unité pour un tube contenant 10 rétines),
pendant 15 minutes, à 37°C. La papaïne a été activée (30 minutes à 37°C) en ajoutant
1 unité de papaïne à 24 µL de solution activatrice de papaïne contenant 1,1 mM d'EDTA,
0,067 mM de β-mercaptoéthanol et 5,5 mM de L-Cystéine. L'hydrolyse est arrêtée par
addition de 1 ml de milieu stop (Neurobasal A médium [Invitrogen 10888-022] et Sérum
de Veau Foetal (SVF) 10% [Invitrogen 10270-098]), après addition de Dnase I (Sigma,
5 µg/ml). Les cellules sont dissociées, à la pipette pasteur rodée, dans le milieu
stop, comptées avec le bleu de Trypan pour exclure les cellules mortes, ensemencées
à différentes densités cellulaires, (de 75,000 à 400,000 cellules par puits) et maintenues
en culture 6 jours. La protéine Otx2 recombinante est dialysée, prédiluée dans le
milieu de culture et répartie dans les puits à différentes concentrations juste avant
l'ensemencement cellulaire. Le milieu de culture, sans sérum, est composé de Neurobasal
A médium (NBA) (Gibco 10888) supplémenté par : L-glutamine 5µM (Sigma G-6392), B27
complément 2,5µM (Gibco 17504-044), Glutamate-Aspartate 2,5µM (Gibco), AntibioticAntimycotic
(Gibco 15240-096). Les cultures sont effectuées à 37°C dans des étuves à 95% d'air
et 5% de CO2. Au 6ème jour de culture, les cellules sont fixées dans du paraformaldéhyde
(PAF) 4% pendant 15 minutes puis rincées 3 fois avec du PBS et conservées à 4°C jusqu'à
la réalisation de l'immunocytochimie.
[0030] Les RGCs survivant après 6 jours en culture mixte, sont identifiées par leur immunoréactivité
pour deux marqueurs complémentaires: les anticorps anti-neurofilament 200 (NF-200
; Sigma N-0142), et anti-neurofilament 68 (NF-68 ; Sigma N-5 139). Ils ont une spécificité
respective de 91 et 88% (
KONG and CHO, Life Sci, 64, 1773-1778, 1999).Leur sensibilité respective sur les grandes RGCs (taille >21 µm) est de 94 et 100%.
Elle ont une sensibilité de 64 et 84% sur les petites RGCs (taille <14µm)(
RUIZ-EDERRA et al., Mol Vis, 10, 83-92, 2004). Des critères morphologiques sont aussi utilisés : les RGCs ont une taille variable,
et une forme ronde avec un noyau excentré.
[0031] Les procédures sont réalisées à température ambiante. Les cellules (fixées à J6)
sont perméabilisées 5 minutes dans du PBS avec Triton X-100 0,2%, rincées dans du
PBS 3 fois, saturées 30 minutes dans du PBS avec SVF 10% (tampon PBS-SVF), puis incubées
avec le (ou les) anticorps primaire(s) dilués dans le même tampon pendant 2 heures
Les cellules sont ensuite rincées 3 fois dans du PBS et incubées 1 heure avec le (ou
les) anticorps secondaire(s)
[0032] Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 1. On observe une survie maximale
(x3) à 50ng/ml, soit 1,65nM. Un effet est visible dès 0,7nM.
Cultures de cellules ganglionnaires rétiniennes adultes purifiées par immunopanning
sur l'anticorps Thy-1
[0034] Le prétraitement des lamelles et le milieu de culture sans sérum sont les mêmes que
pour les cultures mixtes. Sauf précision, les différentes incubations sont réalisées
à température ambiante.
Préparation de la suspension cellulaire
[0035] La dissection des rétines se fait dans du D-PBS (Invitrogen 14287-080). Les rétines
sont rincées au D-PBS, puis incubées en présence de papaïne (Worthington Biochemicals,
165 unités pour un tube contenant 12 rétines), pendant 30 minutes à 37°C. La papaïne
a été activée 5 minutes à 37°C en ajoutant 165 unités de papaïne à 5 ml de D-PBS et
1000 unités de DNase (Sigma D4527). L'hydrolyse est arrêtée par addition de 4 ml d'ovomucoïd
0,15%. Les cellules sont dissociées à la pipette Pasteur rodée, dans une solution
d'ovomucoïd 0,15%, en présence de DNase et d'anticorps primaire de lapin anti-macrophage
de rat (France Biochem AIA5 1240). La suspension cellulaire ainsi dissociée et préincubée
est centrifugée, reprise dans 15 ml de D-PBS avec 0,02%BSA (Sigma A8806), puis filtrée
sur filtre Nitex 48tm (Dutscher 074011).
Préparation des boîtes de panning et anticorps utilisés
[0036] Pendant la nuit précédant la dissection des rétines, deux boîtes de Pétri dites «
A » (150 mm, Dutscher 35-1058) sont incubées avec 20 ml de solution Tris-HCl 50mM
pH 9,5 et 60 µL de l'anticorps secondaire chèvre anti-IgG de lapin (Interchim 111-005-003),
et une boîte de Pétri dite « B » (100 mm, Dutscher 35-1029) avec 10 ml de solution
Tris-HCl 50mM pH 9,5 et 30 µL de l'anticorps secondaire chèvre anti-IgM de souris
(Interchim 1 15-005-020).Chaque boîte de panning est ensuite lavée 3 fois au PBS.
Puis les boîtes A sont saturées avec du D-PBS 0,2%BSA. La boîte B est incubée 3 heures
avec l'IgM de souris anti-Thy1 (T1 1D7, hybridome ECACC), puis lavée 4 fois au D-PBS.
1ère étape de panning : soustraction des macrophages
[0037] La suspension cellulaire, pré-incubée avec l'anticorps primaire IgG de lapin anti-macrophage
de rat, est incubée avec l'anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin sur la
première boîte A pendant 36 minutes. Les cellules non adhérentes sont transférées
sur la deuxième boîte A pour une deuxième incubation de 33 minutes.
2ème étape de panning : sélection des CGRs
[0038] Les cellules non adhérentes sont filtrées sur filtre Nitex 48 tm et incubées pendant
45 minutes sur la boîte B contenant l'anticorps primaire IgM de souris anti -Thy1.
La boîte B est ensuite lavée plusieurs fois (10 fois au moins) au D-PBS pour déloger
progressivement les cellules non-adhérentes. Cette progression est surveillée sous
microscope.
Etape de décrochage à la trypsine des cellules adhérentes purifiées
[0039] La boîte B est rincée 2 fois avec Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (Sigma E6267)
préchauffée à 37°C. Les cellules adhérentes sur la boîte B sont incubées avec une
solution de trypsine contenant 4 ml d'EBSS et 200 µL de trypsine 2,5% (Sigma T9201),
10 minutes à 37°C. La trypsine est inactivée par une solution de 4 ml de D-PBS-Fetal
Bovine Sérum (FBS) 30%. Les cellules sont détachées en pipetant doucement avec la
solution de blocage de la trypsine, puis centrifugées, et comptées (exclusion des
cellules mortes avec le bleu de Trypan).
[0040] Otx2 est dialysée, prédiluée dans le milieu de culture puis déposée dans les puits
avant l'ensemencement des cellules à une densité de 20,000 cellules par puits. Dans
certaines expériences, Otx2 a été pré-incubée avec un anticorps polyclonal anti-OTx2
(Neuromics) au 1/1000, 30 minutes à 37°C.
[0041] Un test de survie des cellules est réalisé à J1 pour évaluer le nombre moyen de RGCs
vivantes ensemencées initialement par puits (sur 4 lamelles), puis à J6 pour évaluer
la proportion de celles ayant survécu en culture dans les différentes conditions (3
à 6 lamelles par condition). Les RGCs purifiées sont incubées pendant 2 heures à 37°C
avec un mélange de deux réactifs : l'AM calcéine et l'éthidium (Live Dead Viability
Cytotoxicity Kit, Invitrogen, L3224). L'AM calcéine ne fluoresce (en vert) que si
elle pénètre dans une cellule vivante où elle est hydrolysée en calcéine fluorescente.
L'éthidium ne pénètre que dans les cellules mortes aux membranes endommagées et ne
fluoresce en rouge qu'en interagissant avec leur ADN. Les deux marqueurs ne fluorescent
que s'ils pénètrent dans les cellules, il n'y a donc pas de bruit de fond. L'analyse
est faite directement au microscope en transposant les lamelles (8mm) sur des porte-lamelles
spéciaux à cet effet, dans 75µL du milieu de culture incubé à 37°C avec les réactifs
du test Live-Dead.
[0042] La Figure 2 illustre les résultats obtenus. Ces résultats montrent que la même concentration
de 1.65nM est optimale pour la survie (x3) et que l'effet d'Otx2 est annulé après
préincubation de la protéine avec l'anticorps neutralisant anti-Otx2, qui n'a pas
d'effet par lui-même. L'effet de survie est donc bien dû à Otx2 et non à un possible
contaminant.
EXEMPLE 3 : COMPARAISON DES EFFETS D'OTX2, DU MILIEU CONDITIONNE DE CULTURES MIXTES
DE RETINES, ET DU BDNF SUR LA SURVIE DES NEURONES GANGLIONNAIRES RETINIENS.
[0044] Les expérimentations ont été effectuées sur des cultures de cellules ganglionnaires
adultes purifiées par immunopanning, comme décrit à l'Exemple 2 ci-dessus.
[0045] Otx2 et le BNDF ont été utilisés à la concentration de 50ng/ml dans le milieu de
culture.
[0046] Le milieu conditionné de cultures mixtes de rétines est préparé à partir de cultures
mixtes réalisées selon le protocole décrit à l'exemple 2 ci-dessus. Le milieu de culture
initial contient 10% de SVF pour permettre la prolifération des cellules gliales de
Müller. Les cellules sont cultivées dans ces conditions jusqu'à confluence (environ
10 jours). Après 4 lavages au NBA, le milieu de culture est changé pour un milieu
de culture chimiquement défini, sans sérum (NBA+ B27 2%) pour 2 jours supplémentaires.
Ce milieu conditionné (MC) est alors récupéré, centrifugé, aliquoté puis congelé dans
l'azote liquide.
[0047] Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Ces résultats montrent qu'Otx2 à 50ng/ml
(1,65nM) est aussi efficace, sinon plus que le milieu conditionné. La préincubation
du milieu conditionné avec l'anticorps anti-Otx2 ne modifie pas son effet, ce qui
montre que cet effet n'est pas dû à son contenu en Otx2. Le BDNF (Brain Derived Neurotrophic
Factor) à 50ng/ml donne une activité similaire à celle du milieu conditionné (résultats
non-illustrés).
[0048] Il ressort des expériences décrites ci-dessus qu'Otx2 est un nouveau facteur de survie
pour les neurones ganglionnaires adultes, et que son activité est égale ou supérieure
à celle du BDNF ou du milieu conditionné.
EXEMPLE 4 : EFFETS D'OTX2 SUR LA SURVIE IN VIVO DES NEURONES GANGLIONNAIRES RETINIENS.
[0049] L'effet d'Otx2 sur la survie des neurones ganglionnaires rétiniens a été confirmé
in vivo dans un modèle murin.
[0050] Le modèle choisi est l'intoxication au N-methyl-D-aspartate (NMDA). La survie des
neurones ganglionnaires a été déterminée en mesurant le niveau d'expression de Brain
3A (Brn3A), un facteur de transcription qui dans la rétine, est spécifiquement exprimé
dans les neurones ganglionnaires RGCs (
XIANG et al., J. Neurosci., 15, 4762-4785, 1995).
[0051] Des souris C57 B16 ont reçu dans l'oeil droit, 1 µl de tampon d'injection (PBS ou
NaCl 9 %) contenant soit 30ng d'Otx2, soit 1mM de NMDA, soit 1mM de NMDA additionné
de 3 ng ou de 30 ng d'Otx2, et dans l'oeil gauche, le même volume de tampon d'injection,
sans additif.
[0052] Au bout de 4 jours, les animaux sont sacrifiés, les rétines prélevées, et l'ARNm
en est extrait.
[0053] Le niveau d'expression de l'ARNm de Brn3A a été déterminé par RT-PCR quantitative,
en utilisant le gène de l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HPRT) comme gène
de référence, et le rapport entre l'expression de l'ARNm de Brn3A dans l'oeil droit
et dans l'oeil gauche a été calculé.
[0054] Les résultats sont illustrés par la Figure 4. En abscisse, sont indiqués les additifs
utilisés ; en ordonnée, est indiqué le rapport entre les quantités d'ARNm Brn3A (normalisées
par rapport à l'ARNm HPRT) dans l'oeil droit et dans l' oeil gauche.
[0055] Ces résultats montrent qu'Otx2 seul n'a pas d'effet significatif sur le niveau d'expression
de Brn3A (et donc sur la quantité de neurones ganglionnaires) dans la rétine. Le NMDA,
administré seul, diminue significativement (d'environ 60%) la quantité des neurons
ganglionnaires, et l'addition de 3ng d'Otx2 ne diminue pas significativement les effets
toxiques du de NMDA. En revanche l'addition de 30 ng d'Otx2 protège totalement les
neurones ganglionnaires contre les effets toxiques du NMDA.
SEQUENCE LISTING
[0056]
<110> - CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
- ECOLE NORMALE SUPERIEURE
- PROCHIANTZ, Alain
- MOYA, Kenneth Lee
<120> UTILISATION D'UNE HOMEOPROTEINE DE LA FAMILLE BICOÏD POUR LA PREVENTION OU LE
TRAITEMENT DE LA DEGENERESCENCE DES NEURONES GANGLIONNAIRES RETINIENS
<130> - MJP/mad-F644-174/PCT
<150> FR08/00110
<151> 2008-01-09
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 289
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<222> (38)..(97)
<223> Homéodomaine
<400> 1


<210> 2
<211> 297
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<222> (32)..(97)
<223> Homéodomaine
<220>
<221> DOMAIN
<222> (46) .. (105)
<223> Homéodomaine
<400> 2

