PROCÉDÉ DE FABRICATION DE MEMBRANES D'ANALYSE DE DISPOSITIFS MICROFLUIDIQUES

Description

[0001] La présente invention a trait au domaine général de la micro fluidique. Elle concerne plus particulièrement les procédés de fabrication de dispositifs microfluidiques à visée diagnostique. La micro fluidique peut être définie comme l'étude des phénomènes qui régissent le mouvement de petits volumes de fluide, notamment de liquide. Elle englobe le développement de systèmes et de dispositifs permettant de faire circuler et/ou de manipuler de petits volumes de fluides et ce, à des fins très diverses comme, par exemple :

• pour mélanger, éventuellement pour faire réagir, tout ou partie des constituants d'un ou de plusieurs fluides, entre eux et/ou avec des composés exogènes,
• pour séparer certains constituants d'un fluide, éventuellement en vue d'en analyser les propriétés chimiques et/ou physiques,
• pour détecter, voire pour doser, des agents cibles dont on suspecte la présence.

La micro fluidique trouve ainsi des applications dans de nombreux domaines techniques.

[0002] Dans le domaine de la clinique, les tests de diagnostic mettant en oeuvre des dispositifs microfluidiques ont connu une rapide évolution depuis ces deux-trois dernières décennies (Yetisen et al., Lab Chip, 2013 (13) 2210-2251 : « Paper-based wiicrofluidic point-of-care diagnostic devices »).

[0003] Aussi désignés par « capteurs microfluidiques », ces dispositifs rendent non seulement possible l'analyse de petits volumes d'échantillons liquides, ils permettent également d'entreprendre, sur une seule et même plateforme, une pluralité de tests de détection, voire de quantification, d'analytes et/ou d'agents pathogènes cibles et ce, par une manipulation simple et rapide.

[0004] La présente invention s'intéresse plus précisément aux dispositifs microfluidiques à usage unique, du type de ceux qui comprennent une membrane d'analyse réalisée dans un matériau poreux et fonctionnant selon un principe dit de mouvement latéral des fluides, en l'occurrence des liquides. Parce que ladite membrane d'analyse a longtemps été réalisée à partir d'une feuille en fibre de cellulose ou de nitrocellulose, l'appellation « µPAD » (pour "microfluidic paper-based analytical devices", en anglosaxon) a été largement adoptée pour faire référence à cette technologie. D'autres matériaux poreux, hydrophiles et absorbants, dès lors qu'ils peuvent autoriser un mouvement latéral des liquides par capillarité, ont aussi été envisagés puis améliorés, pour pouvoir faire office de membranes d'analyse pour la confection de ces dispositifs microfluidiques. Il s'agit par exemple de matériaux réalisés à partir de fibres de nitrocellulose, d'acétate de cellulose, des tissus, des films poreux en polymères.

[0005] Le principe général de fonctionnement de ce type de dispositif microfluidique repose essentiellement sur une membrane d'analyse confectionnée/façonnée à partir d'une feuille de matériau poreux, hydrophile et absorbant, sur laquelle et dans la masse de laquelle est ménagé un réseau hydrophile formé de zones d'intérêt et des canaux. A l'intérieur et au travers de ce réseau de zones d'intérêt et de canaux, un liquide à analyser (par exemple un échantillon biologique liquide), une fois déposé sur ladite membrane d'analyse, peut progresser par simple capillarité et être soumis à une analyse ou une série d'analyses qualitatives et/ou quantitatives de ses constituants (immunodétection, détection moléculaire, test d'affinité, test de couplage ligand-récepteur, évaluation du pH...).

[0006] De manière très schématique, sur les membranes d'analyse des dispositifs microfluidiques, il peut être distingué :

• des zones dites zones de dépôt, au niveau desquelles les liquides à analyser sont déposés,
• des zones dites zones de réaction, au niveau desquelles ont lieu les réactions de détection et/ou de dosage,
• éventuellement, des zones mixtes qui font office simultanément de zones de dépôt et de zones de réaction,
• éventuellement, des zones dites zones réservoirs, au niveau desquelles des réactifs et/ou additifs nécessaires aux réactions à mener sont stockés, généralement sous forme sèche avant d'être réhydratés (ou solubilisés) et transférés vers des zones de réaction spécifiques,
• éventuellement, des zones de dépôt secondaires, qui seront alimentées en réactif(s) et/ou en additif(s), extemporanément et/ou au cours du processus d'analyse, et
• des structures formant canaux qui assurent une conduction fluidique entre les zones d'intérêt, et à travers lesquelles les liquides progressent par un simple phénomène de capillarité.

[0007] S'agissant de la conception de tels dispositifs et plus particulièrement de la partie formant membrane d'analyse, plusieurs approches ont été proposées pour créer, à travers l'épaisseur d'une feuille de substrat poreux, de telles zones hydrophiles délimitées par des bordures imperméables.

[0008] Parmi les méthodes proposées, celle décrite par WO 2008/049083 reprend le principe général de la photolithographie. Une feuille de substrat poreux est d'abord imprégnée d'une résine photosensible négative (par exemple, la résine photolithographique SU-8 2010), par immersion dans une solution de résine solubilisée dans un solvant. Après élimination de l'excédent de résine, sur une de ses faces, la feuille de substrat est revêtue d'un masque en matériau opaque aux ondes lumineuses. Ce masque est doté de parties ajourées (ou simplement transparentes aux ultraviolets) et de parties opaques aux ultraviolets qui produisent respectivement les parties hydrophobes et les parties hydrophiles à reporter sur le substrat. L'ensemble est alors soumis à une irradiation aux ultraviolets, à des longueurs d'ondes aptes à entrainer une photo-polymérisation de la résine négative au niveau des zones exposées. A ce niveau, dans l'épaisseur du substrat, se dessinent alors des zones hydrophiles délimitées par des bordures imperméables. Un éventuel traitement thermique additionnel permet d'évaporer complètement le solvant initial, et parfaire la réticulation.

[0009] Cette méthode, particulièrement consommatrice en résine, est très coûteuse à mettre en oeuvre, compte tenu du coût élevé des résines photosensibles.

[0010] Une alternative à l'emploi de résines photosensibles est proposée par WO 2010/003188. Une feuille de substrat est tout d'abord imprégnée d'une résine classique, par immersion dans une solution de résine solubilisée au solvant volatil. La feuille de substrat est ensuite placée dans une enceinte chauffée et ventilée en vue d'évaporer le solvant et provoquer la réticulation de la résine. La feuille de substrat, ainsi rendue entièrement hydrophobe, est revêtue sur sa face supérieure d'un masque de gravure. Ce masque est doté de parties ajourées et de parties non-ajourées, qui reproduisent respectivement les parties hydrophiles et bordures imperméables à reporter sur le substrat. Un traitement par plasma ou corona est appliqué à l'ensemble et permet d'ôter la résine présente à la surface du substrat, au niveau des zones exposées. Au niveau de ces zones exposées, les couches supérieures du substrat retrouvent des qualités de mouillabilité et d'hydrophilie.

[0011] Cette méthode est également très consommatrice en résine. Qui plus est, elle nécessite un équipement sophistiqué et coûteux, et dont l'investissement financier se justifie difficilement au regard du prix de vente envisageable pour des dispositifs de diagnostic à usage unique.

[0012] De mise en oeuvre plus rudimentaire, la méthode décrite dans WO 2008/049083 consiste à utiliser un tampon-encreur dont la tête d'impression est spécifiquement façonnée pour estampiller un motif aux contours bien définis. La tête d'impression du tampon-encreur est enduite de cire chaude, liquide, puis est appliquée sur le substrat poreux. La cire liquide déposée en surface, imprègne en profondeur le substrat poreux. En durcissant, elle forme dans l'épaisseur du substrat des bordures imperméables, qui délimitent des zones hydrophiles. Outre la contrainte de devoir disposer, pour chaque modèle de motif à réaliser, d'une tête d'impression spécifiquement conçue, cette méthode ne permet pas de réaliser des motifs graphiquement complexes. Par ailleurs, le rendu final est généralement imparfait. US 2008/0241953 décrit une méthode qui consiste à mettre en contact une surface recouverte de cire et un substrat poreux avant d'y appliquer une pression à l'aide d'un tampon chauffé ayant à sa surface un motif prédéterminé. Ceci permet de transférer une couche de cire ayant ledit motif sur le substrat poreux. Dans la méthode décrite par Songjaroen et al., 2012 (Lab Chip, 2012 (12) 3392-3398 : « Blood séparation on microfluidic paper-based analytical devices »), de la cire est préalablement fondue sur une plaque chauffante et est maintenue à l'état liquide tout au long du processus. Une feuille de substrat poreux est couchée sur une lame de verre et sa face libre est surmontée d'un masque en fer plan. Les parties ajourées de ce masque définissent les parties hydrophobes à reporter sur et au travers de l'épaisseur de la feuille de substrat. Quant aux parties pleines du masque, elles définissent les parties hydrophiles à reporter. La feuille de substrat est ainsi maintenue en sandwich entre la plaque de verre et le masque en fer ; l'ensemble est maintenu solidaire à l'aide d'un aimant permanent placé à l'arrière de la lame de verre. L'ensemble a ensuite été plongé dans la cire fondue pendant 1 seconde. Une fois la cire refroidie, la feuille de substrat est décollée de la lame de verre et séparée du masque en fer.

[0013] Utilisant également de la cire pour la conception des bordures imperméables délimitant des zone hydrophiles, la méthode décrite par WO 2010/102294 met à profit des outils informatiques modernes, grâce auxquels la création de motifs de grande complexité graphique est rendue possible et est notablement simplifiée.

[0014] Dans cette méthode, le motif désiré est ainsi d'abord conçu par ordinateur. Puis, au moyen d'une imprimante à encre solide, celui-ci est imprimé avec la résolution d'image désirée sur une des faces d'une feuille de substrat poreux. Avec la face imprimée orientée vers le haut, la feuille de substrat est couchée sur une plaque chauffante portée à une température de l'ordre de 150°C, pendant environ 2 minutes. Sous l'effet de la chaleur, la cire contenue dans l'encre imprimée fond et, par gravité, pénètre et imprègne le substrat dans son épaisseur. En refroidissant, la cire se resolidifie et forme, dans l'épaisseur du substrat, des bordures imperméables délimitant des zones hydrophiles, à l'image du motif initialement conçu par ordinateur.

[0015] Les imprimantes à encre solide actuellement disponibles dans le commerce ne sont malheureusement adaptées que pour imprimer sur des support d'impression (papier, transparent, carton) de formats standards, aux dimensions biens définies et dont les épaisseurs ne dépassent guère 250 µm. L'épaisseur du support d'impression est un paramètre limitant qui n'est cependant pas uniquement lié au matériel informatique actuellement disponible, elle est également liée à la méthode elle-même. En termes de résolution d'image et d'imperméabilité des bordures formées, la qualité du résultat décroit progressivement avec l'augmentation de l'épaisseur du substrat. Plus un substrat d'impression est épais et poreux, plus la quantité/densité de cire nécessaire pour former les bordures imperméables sera importante. Egalement, plus la quantité/densité de cire nécessaire est importante et plus la diffusion latérale de la cire fondue sera marquée et délétère pour la finesse des bordures du motif initialement conçu en informatique.

[0016] A titre indicatif, WO 2010/102294 décrit un exemple de réalisation dans lequel une imprimante XEROX® Phaser 8560N est utilisée pour imprimer sur un papier filtre Whatman™ no. 1. Ce papier filtre utilisé en guise de feuille de substrat poreux, présente une composition en fibre de cellulose et une épaisseur de l'ordre de 180 µm. Des bordures imperméables fonctionnelles ont pu être obtenues en imprimant un tracé de cire de 300 µm d'épaisseur (latérale) ; les bordures imperméables ainsi formées étaient de 850 ± 50 µm d'épaisseur. Avec les tracés de cire d'une épaisseur inférieure à 300 µm, il n'a pas été possible d'obtenir de bordures imperméables qui soient fonctionnelles.

[0017] La façon dont est utilisée l'imprimante dans cette méthode induit un autre paramètre limitant, celui du matériau constitutif de la feuille de substrat poreux à imprimer. En effet, celui-ci doit pouvoir conférer à la feuille de substrat une tenue mécanique et une résistance en traction (ou résistance à la déchirure) suffisantes pour lui permettre d'être convoyée à travers l'imprimante, et pour pouvoir supporter toutes les contraintes mécaniques et thermiques infligées pendant le processus d'impression. Les feuilles de substrat poreux réalisées en matériau souple, tel qu'un tissu ou une ouate, ou en un matériau de grande friabilité, par exemple un papier filtre en fibre de verre, ne peuvent être transformées/remaniées par cette méthode. US 2015/0767342 décrit un procédé selon lequel un motif est imprimé à la cire sur une première face d'un substrat poreux, avant d'être pressé entre deux rouleaux: Le rouleau présent du côté de la seconde face non imprimée étant chauffé, la cire solidifiée peut ainsi fondre et pénétrer le substrat. La présente invention a pour objet de proposer un procédé de fabrication de dispositifs microfluidiques, plus précisément un procédé de confection de la partie formant membrane d'analyse, qui ne souffre pas des inconvénients sus-évoqués. Elle vise plus particulièrement à améliorer la méthode décrite dans WO 2010/102294.

[0018] Un objectif de la présente invention consiste donc à proposer un procédé de fabrication de membranes d'analyse pour dispositifs microfluidiques dont la mise en oeuvre ne soit pas limitée à la transformation de feuilles en fibre de cellulose ou de nitrocellulose, mais également à des feuilles faites dans d'autres matériaux poreux, ainsi qu'à des feuilles de substrat d'épaisseur relativement importante, c'est-à-dire d'épaisseur au moins égale à de l'ordre de 200 µm, notamment comprise entre 200 µm et 1000 µm.

[0019] Un autre objectif de la présente invention est aussi de pouvoir proposer un procédé qui soit compatible avec les contraintes d'une exploitation industrielle d'un dispositif de diagnostic à usage unique, notamment en termes de coût de production et de rentabilité.

[0020] La présente invention vise enfin à proposer un procédé de fabrication de membranes d'analyse, dont l'originalité se situe non seulement au niveau de leur conception mais également au niveau de leur structure et/ou de la nature des substrats utilisés, ainsi qu'au niveau des performances analytiques susceptibles d'être procurées.

[0021] La présente invention concerne donc, en premier lieu, un procédé de fabrication d'une membrane d'analyse de dispositif microfluidique ; ladite membrane microfluidique étant formée à partir d'une feuille de substrat poreux, dans l'épaisseur de laquelle de la cire solide forme des bordures imperméables délimitant des zones hydrophiles. Ces bordures imperméables décrivent ainsi, à travers ladite feuille de substrat, un motif tracé à la cire.

[0022] Conformément à l'invention, le procédé comprend les étapes suivantes :

• un motif intermédiaire, façonné à la cire à l'image dudit motif tracé à la cire que formeront les bordures imperméables de la membrane d'analyse, est apposé sur chacune des faces d'une feuille de substrat poreux de sorte que, de part et d'autre de l'épaisseur de ladite feuille de substrat, lesdits motifs intermédiaires, mutuellement symétriques, se trouvent positionnés en regard l'un de l'autre ;
• maintenue à l'horizontale, ladite feuille de substrat est soumise à un traitement thermique apte à provoquer une fusion au moins partielle de la cire constitutive des motifs intermédiaires apposés sur les faces de ladite feuille de substrat, et à un traitement mécanique apte à comprimer momentanément l'épaisseur de tout ou partie de ladite feuille de substrat ;
• ladite feuille de substrat est soumise à une phase de détente mécanique et thermique, apte à permettre à ladite feuille de substrat de reprendre au moins en partie son épaisseur initiale et à la cire de se resolidifier à l'intérieur de l'épaisseur de ladite feuille de substrat.

[0023] Eventuellement, ladite feuille de substrat ainsi transformée est redécoupée aux dimensions finales de la membrane d'analyse souhaitée. Eventuellement, avant ou après cette découpe, la face inférieure est recouverte d'une couche d'étanchéité, par exemple, par pulvérisation ou par application d'une composition de résine ou d'une cire, ou par contre-collage d'un film plastique imperméable, par exemple de type poly(téréphtalate d'éthylène) ou PET. Egalement, de manière intrinsèque, cette couche d'étanchéité peut aussi avoir l'avantage de rigidifier, de renforcer la structure de ladite membrane d'analyse.

[0024] Dans le présent texte, le terme de « feuille » est utilisé dans un sens très général et large pour désigner une pièce, un morceau de substrat dont l'épaisseur correspond à une valeur insignifiante par rapport à sa surface. Dans ce contexte, ce terme est ici utilisé pour désigner aussi bien une feuille au sens stricte, qu'un ruban ou un disque. De façon relative à cette notion de « feuille », le terme de « film » sera utilisé ci-après pour désigner une pièce, un morceau de matière dont l'épaisseur est significativement inférieure à celle d'une feuille prise au sens de la présente invention.

[0025] Egalement, au sens de la présente invention, le terme de « cires » désigne des substances lipophiles, solides à température ambiante (25°C) et ayant un point de fusion compris entre 45°C et 120°C. Juste au-dessus du point de fusion, les cires sont liquides et ont une viscosité particulièrement basse. Elles peuvent être d'origine animale (par exemple, la cire d'abeille, la cire de Chine, la lanoline...), végétale (par exemple, la cire de riz, de mimosa, la cire de candellila, de carnauba, la cire du Japon, la végétaline...), minérale (par exemple, la paraffine, l'ozocérite...) ou synthétique (par exemple, la stéarine, les polymères éthyléniques, les amines grasses, le polyéthylène glycol ou PEG,...).

[0026] S'agissant de l'étape de traitement thermique du substrat, on prendra soin de ne pas chauffer la cire de façon trop brutale. Une montée en température progressive permettra à la cire déposée sur la face supérieure de la feuille de substrat de fondre lentement et de descendre progressivement dans l'épaisseur du substrat. On évite/limite ainsi la saturation au niveau des couches les plus superficielles du substrat et on minimise, de ce fait, la diffusion latérale/radiale de la cire.

[0027] La cire déposée sur la face inférieure de la feuille de substrat imprègne quant à elle progressivement le substrat dans toutes les directions, y compris vers le haut.

[0028] En comprimant l'épaisseur de la feuille de substrat, on réduit le trajet vertical de la cire. Ce faisant, l'imprégnation en profondeur est favorisée et le temps de migration est raccourci. Moins de liberté est donc laissée à la cire pour pouvoir diffuser dans une direction radiale/latérale ; la finesse du tracé de cire initial s'en trouve affectée de façon moins significative.

[0029] Avantageusement et selon l'invention, l'épaisseur de ladite feuille de substrat est comprise entre 200 µm et 1000 µm, préférentiellement entre de l'ordre de 250 µm et de l'ordre de 850 µm.

[0030] Selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, ledit traitement thermique est mis en oeuvre à l'intérieur d'une enceinte chauffante thermo-contrôlée. Quant audit traitement mécanique, celui-ci est mis en oeuvre grâce à des moyens mécaniques aptes à appliquer une pression ou une force de compression suffisante pour comprimer l'épaisseur de ladite feuille de substrat, au moins au niveau des motifs intermédiaires, installés à l'intérieur de ladite enceinte thermo-contrôlée.

[0031] A titre d'exemple, ces moyens mécaniques peuvent consister en une ou plusieurs plaques, ayant une certaine masse, que l'on applique sur la feuille de substrat. Il peut aussi s'agir d'un dispositif formant étau, adapté pour pouvoir maintenir, entre ses mors, la feuille de substrat dans une position horizontale, et pour en comprimer l'épaisseur.

[0032] Selon une variante de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le traitement thermique et le traitement mécanique sont réalisés simultanément au moyen d'un dispositif de compression chauffant thermo-contrôlé, muni de deux plaques de compression chauffantes horizontales. Il peut s'agir notamment d'une presse à chaud (ou presse chauffante).

[0033] Quel que soit le mode de mise en oeuvre envisagé pour réaliser les traitements thermique et mécanique, on prendra soin d'éviter que la cire déposée sur les faces de la feuille de substrat ne soit en contact direct avec la(les) source(s) de chaleur, ceci essentiellement pour éviter une fusion rapide et brutale de la cire. Lorsqu'un dispositif de compression thermo-régulé est utilisé, une couche de matériau souple et élastique, plane, est interposée entre chacune des faces de ladite feuille de substrat et les plaques de compression chauffantes. Ladite couche de matériau souple et élastique fait alors office de tampon thermique et mécanique ; elle permet d'une part de ralentir la transmission de la chaleur au substrat et, d'autre part, de répartir de façon plus homogène la chaleur et la pression sur toute la feuille de substrat. A titre d'élément formant tampon thermique et mécanique, on peut par exemple utiliser une pièce de caoutchouc ou tout autre matériau polymère analogue, une pièce de tissus, une pièce de liège.

[0034] Avantageusement, on pourra également intercaler une couche de matériau absorbant entre chaque motif intermédiaire, apposé sur une des faces de la feuille de substrat, et ledit tampon thermique et mécanique. Cette couche de matériau absorbant est destinée à capter rapidement la cire fondue restée à la surface du substrat avant que celle-ci ne bave ou ne coule trop abondamment sur les côtés, ce qui pourrait affecter significativement la finesse du tracé de cire.

[0035] S'agissant de l'étape de détente thermique et mécanique, aucune précaution particulière à prendre n'est à noter. Le refroidissement peut être effectué de façon passive, en arrêtant le chauffage et/ou en retirant et en éloignant la feuille de substrat de toute source de chaleur. De même, la détente mécanique peut être réalisée simplement en supprimant promptement les contraintes mécaniques appliquées ou en réduisant progressivement leur intensité.

[0036] Egalement, l'ordre chronologique selon lequel on déclenche la détente thermique et la détente mécanique ne revêt pas une grande importance. Avantageusement et selon l'invention, les deux détentes sont déclenchées de façon simultanée ou l'une après l'autre.

[0037] Pour apposer, sur les faces de la feuille de substrat, les motifs intermédiaires façonnés à la cire, toutes les techniques adaptées connues de l'homme du métier peuvent être utilisées.

[0038] A cet effet, l'impression 3D peut être utilisée. En procédant face par face, les motifs intermédiaires sont tracés directement sur la feuille de substrat par dépôt de cire. Sur la face supérieure de la feuille de substrat, le motif intermédiaire reproduit à l'identique le motif final souhaité. Sur la face inférieure, le motif intermédiaire apparait comme une image inversée du motif final souhaité. De part et d'autre de l'épaisseur de la feuille de substrat, les deux motifs intermédiaires, mutuellement symétriques, se trouvent positionnés en regard l'un de l'autre.

[0039] Selon un autre mode de réalisation avantageux, les motifs intermédiaires réalisés à la cire sont apposés sur chacune des faces de la feuille de substrat poreux avec une technique de transfert de cire. A cet effet, les motifs intermédiaires sont d'abord imprimés sur un film de transfert. Sur ce film de transfert imprimé, le motif intermédiaire destiné à revêtir la face inférieure de la feuille de substrat apparait identique au motif final à réaliser, alors que le motif intermédiaire destiné à revêtir la face supérieure de la feuille de substrat, apparait comme une image inversée du premier motif intermédiaire.

[0040] Ces motifs intermédiaires sont ensuite transférés sur chacune des faces de la feuille de substrat, puis dans son épaisseur, en procédant aux traitements thermique et mécanique selon l'invention.

[0041] En choisissant des films de transfert d'épaisseur relativement faible (par exemple, une épaisseur inférieure à 200 µm), une imprimante à encre solide peut avantageusement être utilisée pour imprimer les motifs intermédiaires. En utilisant une imprimante à encre solide, la quantité (par unité de surface) de cire déposée sur le film de transfert dépend de la qualité d'impression choisie, des encres utilisées - plus précisément de la concentration en cire présente dans ces compositions d'encre-, et de l'intensité de la coloration des motifs à imprimer. En jouant sur ces différents paramètres, un opérateur appréciera le meilleur réglage à appliquer en vue d'obtenir des bordures parfaitement imperméables, qui traversent toute l'épaisseur de la feuille de substrat poreux à transformer/remanier.

[0042] US 2012/190765, US 2012/287199, US 2012/287212, US 2012/309896 et US 2014/123873 proposent des compositions d'encre solide à base de cire, ainsi que leur procédé de fabrication. A titre indicatif de compositions d'encre solide accessibles dans le commerce, on peut citer notamment celle de la compagnie XEROX® CORP. (Japon) de références CQ 8570 XEVP, 108R00931, 108R00932, 108R00933, 108R00934 et 108R00935.

[0043] En guise de film de transfert utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, divers matériaux sont envisageables, dès lors qu'ils sont imprimables. Il peut s'agir notamment d'une feuille plastique imprimable (transparente ou opaque), d'une feuille de papier d'impression, d'une feuille de papier sulfurisée.

[0044] Avantageusement et selon l'invention, les deux motifs intermédiaires, destinés à revêtir les faces supérieure et inférieure de la feuille de substrat sont imprimés sur deux films de transfert distincts. La feuille de substrat est alors placée entre les deux films de transfert, les motifs en cire étant plaqués contre les faces de la feuille de substrat. L'ensemble est maintenu solidaire et est soumis aux traitements thermique et mécanique selon l'invention.

[0045] Selon une variante de mise en oeuvre, les deux motifs intermédiaires destinés à revêtir les faces supérieure et inférieure de la feuille de substrat sont imprimés sur un seul et même film de transfert. Sur ce film de transfert, les deux motifs intermédiaires sont disposés côte à côte, symétriquement par rapport à un axe. Une fois les motifs intermédiaires imprimés et la cire séchée, le film de transfert est plié en deux le long dudit axe de symétrie, la face imprimée tournée vers l'intérieur. Les deux motifs intermédiaires se retrouvent donc superposés. La feuille de substrat est insérée à l'intérieur du film de transfert replié, entre les deux motifs intermédiaires imprimés. L'ensemble est maintenu solidaire et est soumis auxdits traitements thermique et mécanique selon l'invention.

[0046] Avantageusement et selon l'invention, le film de transfert est une feuille de papier en fibre de cellulose. Légèrement absorbante, ce film permet, lors des traitements thermique et mécanique selon l'invention, de capter au moins une partie de la cire fondue restée à la surface du substrat avant qu'elle ne bave/coule sur les côtés.

[0047] Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre à partir d'une large gamme de feuilles de substrat poreux, notamment de composition fibreuse choisie parmi : la fibre de cellulose, de nitrocellulose, de coton, de linter, de verre, de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester, de polyamide (Nylon®), de poly(acide lactique) ou PLA. Lesdites fibres peuvent éventuellement être fonctionnalisées et/ou chargées et/ou dopées d'additifs (par exemple, talc, diatomite...).

[0048] Avantageusement, le procédé selon l'invention est mis en oeuvre à partir d'une feuille de substrat poreux de même composition qu'un média filtrant réalisé en fibre de cellulose, de nitrocellulose, de coton, de linter, de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester, préférentiellement en fibre de verre.

[0049] Au sens de la présente invention et de façon générale, le terme de « média filtrant » désigne un matériau filtrant classiquement utilisé dans les laboratoires et dans l'industrie à des fins d'analyse de liquides, et plus spécifiquement à des fins de séparation et de purification. En fonction de leur épaisseur et de leur format, les qualificatifs de membrane, papier, tampon ou disque, leur sont parfois attribués. De même, on entend par « média filtrant en fibre de verre », un matériau filtrant réalisé à base de microfibres de verre, éventuellement borosilicatés, avec ou sans liant. A titre d'exemples de médias filtrants en fibre de verre actuellement disponibles dans le commerce, on peut notamment citer :

• les filtres WHATMAN™ (GE Healthcare Life Sciences, États-Unis), notamment les papiers MF1, LF1, VF1, VF2 et Fusion 5, destinés à la filtration du sang total et à la séparation cellules/plasma, et le filtre GF/C, destiné à la séparation de substances solides en suspension dans un fluide ;
• les filtres de la société SARTORIUS A.G. (Allemagne), notamment ceux destinés au traitement et à l'analyse de fluide.

[0050] Avantageusement et selon l'invention, ledit procédé de fabrication d'une membrane d'analyse de dispositif microfluidique est mis en oeuvre à partir d'une feuille de substrat poreux en fibre de verre. Avantageusement et selon l'invention, ladite feuille de substrat reprend la composition d'un média filtrant en fibre de verre.

[0051] Les médias filtrants en fibre de verre se caractérisent par une très grande fragilité à la déchirure et l'effritement. Cette grande fragilité structurelle les rend incompatibles à toute impression directe au moyen des imprimantes à encre solide actuellement proposées dans le commerce. Les contraintes mécaniques imposées par ces dernières leur sont en effet considérablement dénaturantes.

[0052] Ainsi, outre le fait d'avoir envisagé d'utiliser un média filtrant en fibre de verre comme substrat poreux pour la confection de membranes d'analyse de/ou pour dispositifs microfluidiques, il est du mérite des inventeurs d'être parvenus à mettre au point un procédé apte à intégrer dans l'épaisseur de ce matériau si particulier, de la cire pour y former in fine des bordures imperméables délimitant des zones dites hydrophiles. Qui plus est, outre la simplicité et le faible coût de sa mise en oeuvre, le procédé proposé permet la réalisation, dans l'épaisseur des feuilles de substrat d'épaisseur relativement importante (comprise entre de 200 µm et 1000 µm), de bordures de cire parfaitement imperméables aux liquides et dont la finesse (épaisseur latérale) peut atteindre de l'ordre de 800 µm. La membrane d'analyse obtenue par le procédé de l'invention présente une épaisseur de laquelle de la cire solide forme des bordures imperméables (en l'occurrence, imperméables aux liquides) délimitant des zones hydrophiles. L'épaisseur de la membrane d'analyse est comprise entre 200 µm et 1000 µm, préférentiellement entre de l'ordre de 250 µm et de l'ordre de 850 µm.

[0053] Eventuellement, ladite membrane d'analyse comprend une face (en l'occurrence, une face dite face inférieure) recouverte d'une couche d'étanchéité. Celle-ci peut être obtenue par pulvérisation ou par application d'une composition de résine ou d'une cire, ou par contre-collage d'un film plastique, par exemple de type PET.

[0054] Avantageusement, la cire constitutive desdites bordures imperméables est choisie parmi une cire animale (par exemple, la cire d'abeille, la cire de Chine, la lanoline...), végétale (par exemple, la cire de riz, de mimosa, la cire de candellila, de carnauba, la cire du Japon, la végétaline...), minérale (par exemple, la paraffine, l'ozocérite...) et synthétique (par exemple, la stéarine, les polymères éthyléniques, les amines grasses, le polyéthylène de glycol ou PEG...).

[0055] Avantageusement, la membrane d'analyse est en fibre de cellulose, en fibre de nitrocellulose ou en fibre de verre, en coton, en linter, en ouate de cellulose, en fibre de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester. Elle peut éventuellement être fonctionnalisée et/ou chargée et/ou dopée d'additifs (par exemple, talc, diatomite...).

[0056] Avantageusement, la membrane d'analyse est réalisée dans un substrat poreux dont la composition reprend celle d'un média filtrant en fibre de cellulose, de nitrocellulose, de coton, de linter, de verre, de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester, de polyamide ou de PLA. Préférentiellement, la composition de la membrane d'analyse est en fibre de verre. Elle reprend avantageusement la composition d'un média filtrant tel que notamment :

• les filtres WHATMAN™ de la compagnie GE HEALTHCARE LIFE SCIENCE, (États-Unis), en particulier les filtres MF1, LF1, VF1 et VF2, qui sont ordinairement destinés à la filtration du sang total et à la séparation cellules/plasma, et du filtre GF/C, et/ou à la séparation de substances solides en suspension dans un fluide ;
• les filtres de la société SARTORIUS A.G. (Allemagne), notamment ceux destinés au traitement et à l'analyse de fluides.

[0057] Avantageusement et préférentiellement, la membrane d'analyse a une épaisseur comprise entre de 200 µm et 1 000 µm, typiquement comprise entre de l'ordre de 250 µm et de l'ordre de 850 µm.

[0058] Les membranes d'analyse réalisées en fibre de verre selon le procédé de l'invention permettent une analyse du plasma directement à partir du sang total. Le sang déposé à la surface de la membrane est fractionné ; les cellules et le plasma sont séparés. Les cellules restent fixées dans la zone de dépôt alors que le plasma va diffuser à travers la membrane, en progressant le long des canaux hydrophiles par diffusion latérale.

[0059] Dans les dispositifs microfluidiques actuellement disponibles dans le commerce, les membranes d'analyse sont classiquement réalisées en fibre de cellulose ou de nitrocellulose. A elles seules, ces membranes d'analyse sont incapables de séparer la fraction plasmatique de la fraction cellulaire. Le sang total déposé sur de telles membranes d'analyse coagule rapidement ; après le dépôt de l'échantillon de sang sur ces supports, les cellules bloquent le plasma et empêche sa diffusion latérale à travers les canaux hydrophiles. Ainsi, pour les analyses sanguines, les µPAD jusqu'à présent proposés comprennent un assemblage d'une membrane d'analyse avec un système de filtration (par exemple, un média filtrant en fibre de verre) apte à mettre en oeuvre un fractionnement du sang ; une fois séparé des cellules qui restent bloquées au niveau du système de filtration, le plasma diffuse à travers la membrane d'analyse où ses composants sont alors analysés. Un exemple de µPAD comprenant une tel assemblage entre une membrane d'analyse et un média filtrant est décrit par Songjaroen et al., 2012 (Lab Chip, 2012 (12) 3392-3398 : « Blood séparation on microfluidic paper-based analytical device »).

[0060] Pour les modèles de µPAD ne disposant pas d'un tel de système de filtration, ceux-ci doivent être utilisés avec du plasma préalablement purifié. Outre des bordures imperméables tracées à la cire et délimitant des zones hydrophiles, ladite membrane d'analyse peut également comprendre dans son épaisseur des incrustations de cire, présentes au niveau d'au moins une zone hydrophile. Ces incrustations de cire ne forment pas des barrières imperméables au passage des liquides. Positionnées au niveau de diverses zones hydrophiles, elles ont vocation à perturber et/ou à ralentir localement le flux de liquide et/ou à créer des zones réservoirs et/ou de réaction bien déterminées. Elles peuvent aussi définir les contours de zones sans cire, donc très hydrophiles, qui pourront faire usage de réservoirs ou de zones réactionnelles bien délimitées.

[0061] Ces incrustations de cire peuvent être réalisées de multiples façons. Une première méthode consiste à reprendre le procédé précédemment décrit pour établir les bordures imperméable de la membrane d'analyse. On obtient alors des incrustations ponctuelles et localisées de cire qui s'étendent à travers toute l'épaisseur de ladite feuille. Elles forment ainsi des obstacles que les liquides doivent contourner par les côtés pour pouvoir progresser à travers la membrane d'analyse.

[0062] Une autre méthode consiste à répéter le procédé selon l'invention mais en le modifiant quelque peu pour ne disperser dans l'épaisseur du substrat poreux qu'une quantité faible de cire, insuffisante pour pouvoir bloquer complètement la migration des liquides. A cet effet, on peut par exemple, utiliser une encre solide faiblement concentrée en cire et/ou n'apposer l'encre solide que sur une des deux faces de la feuille de substrat et/ou imprimer le film de transfert avec une couche de couleur pâle, faiblement intense.

[0063] Un résultat similaire peut être obtenu en reprenant le procédé selon l'invention, mais cette fois-ci sans comprimer l'épaisseur de la feuille de substrat poreux.

[0064] Par rapport à ce dernier mode de réalisation, les modes précédemment évoqués ont l'avantage de permettre la réalisation des incrustations de cire de façon concomitante avec celles des bordures imperméables.

[0065] La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'une membrane d'analyse de dispositif microfluidique caractérisé, en combinaison, par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus ou ci-après.

[0066] D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront à la lecture des exemples suivants qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :

• la Figure 1 est une représentation schématisée d'un mode particulier de mise en oeuvre d'un procédé de fabrication d'une membrane d'analyse de dispositif microfluidique conforme à la présente invention ;
• la Figure 2 présente une photographie d'une membrane WHATMAN™ MF1 à la sortie d'une imprimante à encre solide, après une tentative d'impression directe ;
• la Figure 3 expose en (A), une représentation schématique d'un film de transfert sur lequel est imprimé un exemple de motifs intermédiaires et en (B), une photographie d'une membrane d'analyse obtenue à partir de ce film de transfert ;
• la Figure 4 présente deux photographies de membranes d'analyse pour dispositifs microfluidiques ; la photographie (A) correspond à une membrane d'analyse obtenue par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention ; la photographie (B) correspond à une membrane d'analyse obtenue avec le même procédé mais en omettant le traitement mécanique ;
• la Figure 5 est un graphique mettant en évidence une relation linéaire entre l'épaisseur d'un trait de cire imprimé sur un film de transfert et l'épaisseur de ce même trait après transfert dans l'épaisseur d'une feuille de substrat ;
• la Figure 6 expose des photographies permettant d'apprécier l'imperméabilité des bordures de cire façonnées avec un procédé selon l'invention, en fonction de leur épaisseur ;
• la Figure 7 présente deux photographies prises en microscopie ; la première (A) montre une bordure imprimée à la cire sur un film de transfert en fibre de cellulose, la seconde (B) montre cette même bordure après transfert vers une membrane WHATMAN™ MF1 ;
• La Figure 8 montre des photographies illustrant l'imperméabilité de bordures d'épaisseur de l'ordre de 800 µm, formées sur des substrats de différentes compositions et de différentes épaisseurs, par mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention ;
• les Figure 9, Figure 10A et Figure 10B sont des photographies illustrant la mise en application d'une membrane d'analyse selon l'invention à des fins d'immunodétection ; et
• la Figure 11 est une photographie d'une membrane d'analyse selon l'invention façonnée pour le dépistage du virus de la dengue, par une codétection des protéines NS1 et DomIII.

EXEMPLES

1. Fabrication d'une membrane d'analyse de dispositif microfluidique selon l'invention

[0067] La Figure 1 illustre de façon schématique la mise en oeuvre d'un procédé de fabrication d'une membrane d'analyse 10, conforme à l'invention, et par lequel un motif tracé à la cire est intégré dans l'épaisseur même d'une feuille de substrat poreux 11 ; les contours dudit motif étant destinés à former, dans l'épaisseur de ladite feuille de substrat 11, des bordures imperméables 12 délimitant des zones hydrophiles 13 de configuration déterminée. Dans le mode opératoire particulier illustré ici, les deux motifs intermédiaires 12a et 12b sont imprimés sur un seul et même film de transfert 20.

[0068] Dans une première étape, on crée, par informatique et au moyen d'un logiciel de dessin, une image 12'a correspondant au motif à intégrer dans l'épaisseur de la feuille de substrat 11. Cette première image 12'a est dupliquée en une image symétrique 12'b.

[0069] Au moyen d'une imprimante à encre solide, les deux images 12'a et 12'b sont imprimées sur un film de transfert 20, de façon à former deux motifs intermédiaires 12a et 12b disposés symétriquement par rapport à un axe. Cet axe de symétrie S est également imprimé sur le film de transfert 20, en guise de repère visuel.

[0070] Pour ce faire, l'impression est réalisée avec une imprimante de type XEROX® ColorQube™, alimentée avec des encres solides de références XEROX® 108R00931 (couleur cyan), 108R00932 (couleur magenta), 108R00933 (couleur jaune) et 108R00934/108R00935 (couleur noire). Le film de transfert 20 est une feuille de papier bureautique ordinaire. Les contours du motif sont imprimés en qualité/résolution photo à l'encre noire.

[0071] Une fois cette impression réalisée, le film de transfert 20 est plié en deux en suivant l'axe de symétrie S, les motifs intermédiaires 12a et 12b tournés vers l'intérieur. Ces derniers se retrouvent ainsi superposés l'un sur l'autre. Une feuille de substrat 11 est glissée à l'intérieur du film de transfert 20 replié, intercalé entre les deux motifs intermédiaires 12a et 12b.

[0072] La feuille de substrat 11, prise en sandwich entre les deux volets du film de transfert 20, est alors mise sous presse entre deux plaques de compression chauffantes, horizontales et deux pièces en caoutchouc 15 formant tampon thermique et mécanique.

[0073] L'ensemble est soumis à une pression de l'ordre de 1 kg/cm² et à une température de 120°C, pendant environ 3 minutes. Lors de ce processus, la cire préalablement imprimée sur le film de transfert 20 est transférée sur les deux faces de la feuille de substrat 11, puis en imprègne l'épaisseur.

[0074] Le procédé décrit ici s'applique à de nombreux substrats poreux, tels que par exemple des substrats réalisés en fibre de cellulose, de nitrocellulose, de coton, de linter, de verre, de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester, de polyamide, de PLA. Ce procédé a été mis au point essentiellement sur des substrats en fibre de verre et plus particulièrement sur des médias de filtration de marque WHATMAN™ (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCE, États-Unis), d'épaisseurs variables, notamment :

• filtre MF1, d'une épaisseur de 367 µm
• filtre Fusion 5, d'une épaisseur de 370 µm
• filtre VF2, d'une épaisseur de 785 µm.

[0075] Ces médias de filtration habituellement utilisés pour la filtration d'échantillons de sang total, en vue d'une séparation rapide entre fraction cellulaire / fraction liquide, sont extrêmement fragiles à la déchirure et doivent être manipulés avec précaution et délicatesse.

[0076] Compte tenu de cette grande fragilité, il n'est pas possible de procéder à une impression des motifs intermédiaires directement sur ce type de matériau au moyen d'une imprimante à encre solide. La Figure 2 est une photographie d'une membrane WHATMAN™ MF1 après une tentative infructueuse d'impression directe. Cette membrane, préalablement scotchée sur une feuille de papier de format standard pour faciliter son passage dans l'imprimante et pour en consolider quelque peu la structure, ressort de l'imprimante totalement détériorée.

2. Exemple de réalisation d'une membrane d'analyse selon l'invention, à partir d'une feuille de substrat en fibre de verre

[0077] La Figure 3 illustre, dans sa partie (A), un film de transfert 20 sur lequel un exemple particulier de motifs intermédiaires 12a et 12b est imprimé. Dans la partie (B), est exposée une photographie d'une membrane d'analyse 10 (après utilisation) façonnée à partir d'une feuille de substrat en fibre de verre et utilisant un tel film de transfert 20.

[0078] Les motifs intermédiaires 12a et 12b, de forme générale rectiligne, présentent une partie supérieure évasée et une partie basse plus étroite à extrémité ouverte. Leurs contours sont imprimés à l'encre noire (référence XEROX® 108R00934), en qualité photo. Cette encre solide renferme une concentration en cire qui s'est avérée suffisante pour permettre la réalisation et l'obtention de bordures imperméables dans l'épaisseur de feuilles de substrat relativement épaisses, y compris des membranes WHATMAN™ VF2 de 785 µm d'épaisseur.

[0079] La partie supérieure des motifs intermédiaires 12a et 12b est évasée et est destinée à former une zone hydrophile, en l'occurrence une zone de dépôt 13a apte à recevoir un échantillon liquide à analyser. Une fois déposé dans la zone de dépôt 13a, l'échantillon liquide va pouvoir migrer par capillarité en direction des autres zones hydrophiles de la membrane d'analyse, à savoir vers la partie basse du motif. Plus étroite, elle forme un canal à l'intérieur duquel sont ménagées quatre zones d'intérêt 13b, 13c, 13d et 13e. La position de chacune de ces zones d'intérêt est spécifiquement repérée par les éléments de marquage 14b, 14c, 14d et 14e, également tracée à l'encre solide colorée.

[0080] Du fait de la grande hydrophilie qui caractérise les médias filtrant en fibre de verre, il peut être avantageux de pouvoir ralentir le flux des liquides et/ou modifier leur profil d'écoulement, notamment au niveau des zones d'intérêt 13b, 13c, 13d et 13e. Pour ce faire, sur la partie basse des motifs intermédiaires 12a et 12b, autours des régions destinées à former les zones d'intérêt 13b, 13c, 13d et 13e, une couche de couleur faiblement chargée en cire 14 recouvre la surface du film de transfert 20. Contrairement aux contours des motifs intermédiaires 12a et 12b qui sont imprimés à l'encre solide noire, la couche faiblement chargée en cire 14 est obtenue en imprimant, à l'encre solide, une couche de couleur pâle (faiblement intense). L'intensité de la couleur de cette couche est proportionnelle à la quantité de cire déposée sur le film de transfert ; cette intensité de couleur est choisie pour que, une fois dans l'épaisseur de la feuille de substrat, la quantité de cire ainsi transférée soit insuffisante pour bloquer complètement la migration des liquides par capillarité.

[0081] Le dépôt d'une couche de couleur jaune pâle sur le film de transfert a permis de réduire et moduler assez précisément les vitesses d'écoulement des liquides au sein de la membrane d'analyse.

[0082] Les zones d'intérêt 13b, 13c, 13d et 13e n'ont pas été modifiées par la cire. Elles conservent la porosité et l'hydrophilie initiales de la feuille de substrat utilisée, et pourront être fonctionnalisées ultérieurement.

[0083] Une fois les cires transférées dans l'épaisseur de la feuille de substrat, les différentes zones plus ou moins hydrophiles vont pouvoir être fonctionnalisées et/ou chargées en réactifs en fonction des analyses et tests souhaités.

3. Mise en évidence du caractère essentiel du traitement mécanique constitutif du procédé selon l'invention

[0084] La Figure 4 présente la photographie de deux membranes d'analyse fabriquées à partir d'une feuille de substrat de type membrane WHATMAN™ MF1 (367 µm d'épaisseur) et utilisant un film de transfert 20, tel qu'exposé à la Figure 3 et tel que décrit dans l'exemple précédent.

[0085] La membrane d'analyse de la photographie (A) a été fabriquée en mettant en oeuvre un procédé conforme à l'invention et tel qu'illustré à la Figure 1. La membrane d'analyse de la photographie (B) a été fabriquée en mettant en oeuvre le même procédé, mais en omettant de réaliser le traitement mécanique (compression de la feuille de substrat à environ 1 kg/cm²).

[0086] Les deux membranes d'analyse sont chargées d'une solution colorée. A la différence de la membrane d'analyse de la photographie (A), avec celle de la photographie (B), des fuites importantes de la solution colorée sont constatées au niveau de la zone de dépôt. La quantité de cire transférée est nettement plus faible et ne permet pas d'obtenir motif aux parois imperméables.

4. Analyse de l'évolution de l'épaisseur des traits de cire, imprimés sur un film de transfert puis transférés vers un substrat poreux en fibre de verre

[0087] 

a) Des motifs circulaires avec des épaisseurs de trait variables sont imprimés sur un film de transfert en fibre de cellulose (impression à l'encre solide noir, en qualité photo et au moyen d'une imprimante de type XEROX® ColorQube™), puis transférés sur membrane WHATMAN™ MF1 (367 µm d'épaisseur), par traitements thermique et mécanique selon l'invention, durant 5 minutes à 120°C sous une pression équivalente à 0,5-2 kg.cm^-2. Les épaisseurs des traits de cire avant et après transfert sont mesurées sous microscope.
Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 5, sous la forme d'un graphique montrant une relation linéaire entre l'épaisseur d'un trait de cire imprimé sur le film de transfert et l'épaisseur de ce trait après son transfert dans l'épaisseur d'une feuille de substrat en fibre de verre.

b) Une solution colorée est ensuite déposée au centre de chacun des motifs réalisés pour évaluer l'étanchéité des bordures crées. La Figure 6 et la Figure 7 présentent les résultats obtenus, sous la forme de photographies.
L'imperméabilité aux liquides est obtenue pour une épaisseur de cire imprimée au minimum égale à 260 µm, donnant après transfert une barrière de cire de l'ordre de 830 µm. En deçà de cette épaisseur, le colorant n'est plus contenu dans le motif circulaire.

5. Transfert de cire vers des feuilles de substrat de différentes compositions et de différentes épaisseurs, et évaluation de l'imperméabilité des bordures créées

[0088] Des substrats, d'épaisseur et de nature variables, ont été testés. Il s'agit en l'occurrence des médias filtrants commercialisés par la compagnie GE HEALTHCARE LIFE SCIENCE (États-Unis), sous la marque de fabrique WHATMAN™ : les filtres MF1, Fusion 5 et VF2, respectivement de 367 µm, 370 µm et 785 µm d'épaisseur.

[0089] Les transferts, par traitements thermique et mécanique selon l'invention, ont lieu durant 3 minutes à 120°C et sous une pression équivalente à environ 1 kg/cm². L'étanchéité des motifs est vérifiée à l'aide d'un dépôt d'une solution colorée dans la partie évasée du motif (zone de dépôt).

[0090] Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 8, sous la forme de photographies. Quelles que soient la nature et l'épaisseur des substrats testés, des barrières d'une épaisseur latérale de l'ordre de 800 µm procure une bonne étanchéité au système.

6. Exemples de fonctionnalisation d'une membrane d'analyse selon l'invention

a) Fonctionnalisation pour le dépistage du virus de l'hépatite B

[0091] Selon un premier mode de mise en application de la membrane d'analyse 10 précédemment décrite, celle-ci a été fonctionnalisée pour le dépistage de l'hépatite B, par immunodétection de l'antigène HBs contenu dans le sang.

[0092] Dans ce contexte, des fonctions particulières ont été affectées aux zones d'intérêt 13b, 13c, 13d et 13e.

[0093] La zone 13d est fonctionnalisée au moyen d'anticorps monoclonaux anti-HBs, spécifiques de la réaction; la zone 13d forme le «spot test ». La zone 13e est fonctionnalisée au moyen d'anticorps monoclonaux anti-alcaline phosphatase, spécifiques du conjugué de détection ; la zone 13e forme le «spot contrôle positif». La zone 13c est fonctionnalisée au moyen d'anticorps non-spécifiques de la réaction (par exemple, des anticorps anti-rat) ; la zone 13c forme le « spot contrôle négatif ».

[0094] La fonctionnalisation de ces différentes zones par les anticorps est réalisée par adsorption passive des anticorps sur les fibres constitutives du substrat.

[0095] Au-dessus de ces trois spots, la zone 13b est dédiée au stockage de la seconde partie du complexe conjugué (anticorps monoclonaux anti-HBs marqués par la biotine) ; la zone 13b forme le « spot Ac anti-HBs-biot ».

[0096] Eventuellement, la zone de dépôt 13a peut également servir au stockage du conjugué de la réaction immuno-enzymatique (streptavidine-alcaline phosphatase ou STRE-PAL) sous forme séchée. Ce conjugué sera resolubilisé par la phase liquide de l'échantillon à analyser.

b) Fonctionnalisation pour le dépistage du virus de la dengue

[0097] Selon un deuxième mode de mise en application de la membrane d'analyse 10 précédemment décrite, celle-ci a été fonctionnalisée pour la détection, dans le sang et le plasma, de deux protéines du virus de la dengue : la protéine NS1 et le domaine III de la protéine d'enveloppe du virus (DomIII).

[0098] Pour la détection de la protéine NS1, les dépôts suivants ont été réalisés :

• zone 13e (zone contrôle anti-PAL) : 0,35 µL d'un anticorps anti-phosphatase alcaline 1 mg/mL en PBS,
• zone 13c (zone de test) : 0,35 µL d'un anticorps anti-NS1 à 1 mg/mL en PBS,
• zone 13b : 1 µL d'une solution d'anticorps anti-NS1 marqués à la phosphatase alcaline à la concentration de 50 µg/mL en PBS-BSA 0,5 %,
• zone 13d (zone de contrôle négatif) : 0,35 µL de PBS-BSA 0,5 %.

Une fois les dépôts effectués, la membrane d'analyse est mise à sécher pendant 3 minutes à 60°C. Elle est alors prête à être utilisée.

[0099] Pour tester cette membrane d'analyse, 20-25 µL de plasma additionnés de 1 µg de protéine NS1 sont déposés dans la zone réservoir 13a. Une fois que la totalité de l'échantillon a pénétré et migré à l'intérieur du pad, 10µL de BCIP/NTP (bromo-4-chloro-3-indol phosphate/4-nitroblue tetrazolium chloride) sont rajoutés dans la zone 13b. Très rapidement, la zone contrôle anti-PAL et la zone de test deviennent positives, la zone de contrôle négatif restant incolore (cf. Figure 9). La détection est réalisée en 5-6 minutes. En parallèle, l'expérience est réalisée avec 20-25 µL de plasma sans NS1. Dans ce cas, seule la zone contrôle devient positive.

[0100] De façon similaire, la membrane d'analyse 10 précédemment décrite, a été fonctionnalisée pour la détection de la protéine de l'enveloppe du virus de la dengue, en utilisant des anticorps de capture et de détection dirigés contre DomIII. La membrane d'analyse correspondante a été testée. Une détection positive de DomIII et une détection négative sont illustrées par les Figure 10A et Figure 10B, respectivement.

[0101] Enfin, la codétection des protéines NS1 et DomIII a également été mise en oeuvre avec succès au moyen d'une membrane d'analyse (multiplexage) dont la structure et la conception sont très similaires à celles des membranes d'analyse 10 précédentes. La différence repose sur la présence d'une zone de réaction supplémentaire au niveau de l'espace à diffusion ralentie. Une photographie de cette nouvelle membrane d'analyse selon l'invention est présentée sur la Figure 11.

Revendications

1. Procédé de fabrication d'une membrane d'analyse (10) de dispositif microfluidique ; ladite membrane d'analyse (10) étant formée à partir d'une feuille de substrat poreux (11) dans l'épaisseur de laquelle de la cire solide forme des bordures imperméables (12) délimitant des zones hydrophiles (13) ; lesdites bordures imperméables (12) décrivant, à travers la feuille de substrat (11), un motif tracé à la cire ;
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

- un motif intermédiaire (12a, 12b), façonné à la cire à l'image dudit motif tracé à la cire que formeront les bordures imperméables de la membrane d'analyse (10), est apposé sur chacune des faces d'une feuille de substrat poreux (11) de sorte que, de part et d'autre de l'épaisseur de ladite feuille de substrat (11), lesdits motifs intermédiaires (12a, 12b), mutuellement symétriques, se trouvent positionnés en regard l'un de l'autre ;

- maintenue à l'horizontale, ladite feuille de substrat (11) est soumise à un traitement thermique apte à provoquer une fusion au moins partielle de la cire constitutive des motifs intermédiaires (12a, 12b) apposés sur les faces de ladite feuille de substrat (11), et à un traitement mécanique apte à comprimer l'épaisseur de tout ou partie de ladite feuille de substrat (11);

- ladite feuille de substrat (11) est soumise à une phase de détente mécanique et thermique apte à permettre à ladite feuille de substrat (11) de reprendre au moins en partie son épaisseur initiale et à la cire de se resolidifier à l'intérieur de l'épaisseur de ladite feuille de substrat (11) ; et

en ce que l'épaisseur de ladite feuille de substrat (11) est comprise entre 200 µm et 1000 µm.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit procédé est mis en oeuvre à partir d'une feuille de substrat (11) de composition fibreuse choisie parmi : la fibre de cellulose, de nitrocellulose, de coton, de linter, de verre, de soie, de viscose, de polypropylène, de polyester, de polyamide, de poly(acide lactique).

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre à partir d'une feuille de substrat (11) reprenant la composition d'un média filtrant en fibre de verre.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit traitement thermique est mis en oeuvre à l'intérieur d'une enceinte chauffante thermo-contrôlée et ledit traitement mécanique est mis en oeuvre grâce à des moyens mécaniques, installés à l'intérieur de ladite enceinte thermo-contrôlée et aptes à appliquer une pression ou une force de compression suffisantes pour comprimer l'épaisseur de ladite feuille de substrat (11), au moins au niveau des motifs intermédiaires.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit traitement thermique et ledit traitement mécanique sont réalisés simultanément au moyen d'un dispositif de compression chauffant thermo-contrôlé, muni de deux plaques de compression chauffantes horizontales.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, pour la mise en oeuvre desdits traitements thermique et mécanique, une couche de matériau souple et élastique, plane, est interposée entre chacune des faces de ladite feuille de substrat (11) et les plaques de compression chauffantes ; ladite couche de matériau souple faisant office de tampon thermique et mécanique (15).

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'une couche de matériau absorbant est intercalée entre chaque motif intermédiaire (12a, 12b) apposé sur une des faces de la feuille de substrat (11), et ledit tampon thermique et mécanique.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les motifs intermédiaires (12a; 12b) sont apposés sur chacune des faces de ladite feuille de substrat (11) avec une technique de transfert de cire.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les motifs intermédiaires (12a, 12b) sont d'abord imprimés sur un film de transfert (20) et sont ensuite transférés sur chacune des faces de ladite feuille de substrat (11), puis dans son épaisseur en procédant auxdits traitements thermique et mécanique.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit film de transfert (20) est une feuille de papier en fibre de cellulose.

Ansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Analysemembran (10) eines Mikrofluidgeräts; wobei die Analysemembran (10) aus einer Folie eines porösen Substrats (11) gebildet ist, in deren Dicke festes Wachs undurchlässige Ränder (12) bildet, die hydrophile Zonen (13) begrenzen; wobei die undurchlässigen Ränder (12) durch die Substratfolie (11) ein in das Wachs gezeichnetes Motiv beschreiben;
dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

- ein Zwischenmotiv (12a, 12b), das mit dem Wachs nach dem Abbild des in das Wachs gezeichneten Motivs, das die undurchlässigen Ränder der Analysemembran (10) bilden, geformt ist, wird auf jede der Seiten einer Folie eines porösen Substrats (11) aufgebracht, so dass beiderseits der Dicke der Substratfolie (11) die Zwischenmotive (12a, 12b), die wechselseitig symmetrisch sind, einander gegenüber angeordnet sind;

- horizontal gehalten, wird die Substratfolie (11) einer thermischen Behandlung, die geeignet ist, ein zumindest teilweises Schmelzen des Wachses hervorzurufen, aus dem die Zwischenmotive (12a, 12b) bestehen, die auf die Seiten der Substratfolie (11) aufgebracht sind, und einer mechanischen Behandlung unterzogen, die geeignet ist, die Dicke der Gesamtheit oder eines Teils der Substratfolie (11) zusammenzudrücken;

- die Substratfolie (11) wird einer mechanischen und thermischen Entspannungsphase unterzogen, die geeignet ist, es der Substratfolie (11) zu ermöglichen, zumindest teilweise wieder ihre ursprüngliche Dicke anzunehmen, und es dem Wachs zu ermöglichen, sich innerhalb der Dicke der Substratfolie (11) wieder zu verfestigen; und

dass die Dicke der Substratfolie (11) zwischen 200 µm und 1000 µm beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren auf Basis einer Substratfolie (11) mit faseriger Zusammensetzung eingesetzt wird, ausgewählt unter: Zellulosefaser, Nitrozellulose, Baumwolle, Linter, Glas, Seide, Viskose, Polypropylen, Polyester, Polyamid, Poly(milchsäure).

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es auf Basis einer Substratfolie (11) eingesetzt wird, die die Zusammensetzung eines Filtermediums aus Glasfaser übernimmt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die thermische Behandlung innerhalb eines thermisch kontrollierten Heizraums eingesetzt wird, und die mechanische Behandlung durch mechanische Mittel eingesetzt wird, die innerhalb des thermisch kontrollierten Raums installiert und geeignet sind, einen Druck oder eine Kompressionskraft auszuüben, die ausreichend sind, um die Dicke der Substratfolie (11) zumindest im Bereich der Zwischenmotive zusammenzudrücken.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die thermische Behandlung und die mechanische Behandlung gleichzeitig mit Hilfe einer thermisch kontrollierten Heiz-Kompressions-Vorrichtung erfolgen, die mit zwei horizontalen Heiz-Kompressions-Platen versehen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass für den Einsatz der thermischen Behandlung und mechanischen Behandlung eine weiche und elastische, flache Materialschicht zwischen jede der Seiten der Substratfolie (11) und die Heiz-Kompressions-Platten zwischengefügt wird; wobei die weiche Materialschicht als thermischer und mechanischer Puffer (15) dient.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine absorbierende Materialschicht zwischen jedes Zwischenmotiv (12a, 12b), das auf eine der Seiten der Substratfolie (11) aufgebracht ist, und den thermischen und mechanischen Puffer zwischengefügt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenmotive (12a; 12b) auf jede der Seiten der Substratfolie (11) mit einer Wachstransfertechnik aufgebracht sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwischenmotive (12a, 12b) zuerst auf eine Transferfolie (20) gedruckt werden, und dann auf jede der Seiten der Substratfolie (11), dann in ihre Dicke transferiert werden, wobei die thermischen und mechanischen Behandlungen durchgeführt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Transferfolie (20) eine Folie aus Zellulosefaserpapier ist.

Claims

1. Method for the manufacture of a microfluidic device analytical membrane (10); the said analytical membrane (10) being formed from a porous substrate sheet (11) in the thickness of which solid wax forms impermeable edges (12) delimiting hydrophilic regions (13); the said impermeable edges (12) describing, across the substrate sheet (11), a pattern drawn with the wax;
characterized in that it comprises the following stages:

- an intermediate pattern (12a, 12b), fashioned with the wax in the image of the said pattern drawn with the wax which will form the impermeable edges of the analytical membrane (10), is affixed to each of the faces of a porous substrate sheet (11) so that, on either side of the thickness of the said substrate sheet (11), the said intermediate patterns (12a, 12b), which are mutually symmetrical, are found positioned facing one another;

- held horizontally, the said substrate sheet (11) is subjected to a heat treatment capable of bringing about at least partial melting of the constituent wax of the intermediate patterns (12a, 12b) affixed to the faces of the said substrate sheet (11), and to a mechanical treatment capable of compressing the thickness of all or part of the said substrate sheet (11) ;

- the said substrate sheet (11) is subjected to a phase of mechanical and thermal relaxation capable of making it possible for the said substrate sheet (11) to at least partially regain its initial thickness and for the wax to resolidify inside the thickness of the said substrate sheet (11); and

in that the thickness of the said substrate sheet (11) is between 200 µm and 1000 µm.

2. Method according to Claim 1, characterized in that the said process is carried out starting from a substrate sheet (11) of fibrous composition chosen from: the cellulose, nitrocellulose, cotton, linter, glass, silk, viscose, polypropylene, polyester, polyamide or poly(lactic acid) fibre.

3. Method according to Claim 1 or 2, characterized in that it is carried out starting from a substrate sheet (11) repeating the composition of a filtering medium made of glass fibre.

4. Method according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that the said heat treatment is carried out inside a thermally controlled heating chamber and the said mechanical treatment is carried out by virtue of mechanical means, installed inside the said thermally controlled chamber and capable of applying a pressure or a compressive force which are sufficient to compress the thickness of the said substrate sheet (11), at least at the intermediate patterns.

5. Method according to any one of Claims 1 to 4, characterized in that the said heat treatment and the said mechanical treatment are carried out simultaneously by means of a thermally controlled compression/heating device provided with two horizontal compression/heating plates.

6. Method according to Claim 5, characterized in that, for the implementation of the said heat and mechanical treatments, a flat layer of flexible and elastic material is interposed between each of the faces of the said substrate sheet (11) and the compression/heating plates; the said layer of flexible material acting as heat and mechanical buffer (15).

7. Method according to Claim 6, characterized in that a layer of absorbent material is inserted between each intermediate pattern (12a, 12b) affixed to one of the faces of the substrate sheet (11) and the said heat and mechanical buffer.

8. Method according to any one of Claims 1 to 7, characterized in that the intermediate patterns (12a; 12b) are affixed to each of the faces of the said substrate sheet (11) with a wax transfer technique.

9. Method according to Claim 8, characterized in that the intermediate patterns (12a, 12b) are first printed on a transfer film (20) and are subsequently transferred onto each of the faces of the said substrate sheet (11) and then into its thickness by carrying out the said heat and mechanical treatments.

10. Method according to Claim 9, characterized in that the said transfer film (20) is a sheet of paper made of cellulose fibre.

Dessins